Name: an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

Vi takker anke Jurisdich, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte og Cornelia Heckmann for assistance med eksperimentelle procedurer og Benjamin Tiburzy fra Biolegend for at få nyttige kommentarer til gating-strategien. J.S. blev støttet af Helmholtz Grant (ICEMED). Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra den kliniske forskningsenhed under Berlins Institut for sundhed (BIH), "BCRT-Grant" af det tyske Forbundsministerium for uddannelse og forskning og Einstein Foundation. K.S.-B. og H.-D.V. er finansieret af FOR2165.

Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr fra National Institutes of Health og Dyrevelfærdsloven under tilsyn af vores institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug. Dyre protokoller blev gennemført i henhold til de institutionelle etiske retningslinjer fra Charité Berlin, Tyskland, og blev godkendt af Landesamt für Gesundheit und Soziales og er i overensstemmelse med retningslinjerne for ankomst.
1. kost-induceret animalsk mod...

<ol>
	<li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis.</a> BMC Public Health. 9, 88 (2009).</li><li>Prentki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+&#946;+cell+failure+in+type.">Islet &#946; cell failure in type.</a> J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).</li><li>Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+insulin+resistance.">Inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444, 840 (2006).</li><li>Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+immune+system+and+adipose+tissue+in+obesity.">Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+fat,+and+the+emergence+of+immunometabolism.">Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).</li><li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies.">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610 (2011).</li><li>Onodera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+induce+PPAR&#947;-high+FOXP3(+)+regulatory+T+cells.">Adipose tissue macrophages induce PPAR&#947;-high FOXP3(+) regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).</li><li>Calle, E. E., Kaaks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overweight,+obesity+and+cancer:+epidemiological+evidence+and+proposed+mechanisms.">Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).</li><li>Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Nonalcoholic+Steatohepatitis:+Eat,+Delete,+and+Inflame.">Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame.</a> Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice+by+normalizing+environment.">Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment.</a> Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).</li><li>Sbierski-Kind, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Housing+Conditions+Reveal+a+Major+Impact+of+Adaptive+Immunity+on+the+Course+of+Obesity-Induced+Type+2+Diabetes.">Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes.</a> Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).</li><li>Japp, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+immunology+assessed+by+multidimensional+mass+cytometry.">Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).</li><li>Benedict, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease:+An+expanded+review.">Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review.</a> World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Immunity,+and+Metabolic+Disease.">Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+Cells+in+Adipose+Tissue.">The Immune Cells in Adipose Tissue.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 15, 34-38 (2013).</li><li>Bertola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+expression+patterns+of+inflammatory+and+immune+response+genes+associated+with+obesity+and+NASH+in+morbidly+obese+patients.">Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients.</a> PloS One. 5 (10), e13577 (2010).</li><li>Turnbaugh, P. J., B&#228;ckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-Induced+Obesity+Is+Linked+to+Marked+but+Reversible+Alterations+in+the+Mouse+Distal+Gut+Microbiome.">Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome.</a> Cell Host &amp; Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).</li><li>Singh, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+diet+on+the+gut+microbiome+and+implications+for+human+health.">Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).</li><li>M&#252;ller, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+barrier+impairment+by+high-fat+diet+in+mice+depends+on+housing+conditions.">Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions.</a> Molecular Nutrition &amp; Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).</li></ol>

Steatohepatitis har en stærk forbindelse med metaboliske abnormiteter såsom fedme, insulinresistens og dyslipidæmi15. Flere undersøgelser indikerer, at betændelse i fedtvæv kan føre patogenesen af type 2-diabetes, herunder ændrede niveauer af celler i både det medfødte og adaptive immunsystem4,5,16,17 . Desuden, det er blevet konstateret, at fedme moduserer akt...

Fedme er en multifaktoriel lidelse og en stor risikofaktor for udvikling af hjertesygdomme, slagtilfælde, nonalkoholisk steatohepatitis (NASH), type 2 diabetes (T2D) og nogle typer af kræft. Forekomsten af fedme er hastigt stigende globalt. I dag, 2.100.000.000 mennesker-næsten 30% af verdens befolkning-er enten fede eller overvægtige1. Fedme-associeret insulinresistens kan føre til T2D, når udmattet pancreaserlet beta celler undlader at kompensere for det øgede behov for insulin til at opretholde glukose homøostase2.
Fedtvæv består af forskellige celletyper, herunder adipocytter, endotel celler, fibroblaster og immunceller. Under progression af fedme kan ændringer i antallet og aktiviteten af immunceller føre til lav-grade betændelse af hypertrofisk fedtvæv3,4. Specifikt, det er blevet konstateret, at overdreven energi indtag, ledsaget af kronisk forhøjede niveauer af blodglukose, triglycerider og frie fedtsyrer, fører til adipocyt hypoxi, endoplasmatiske reticulum stress, nedsat mitokondriel funktion og øget cytokinsekretion, hvilket resulterer i aktivering af pro-inflammatoriske fedtvæv immunceller5,6. Tidligere forskning har primært fokuseret på medfødt immunitet, men mere nyligt adaptive immunceller (T og B celler) er dukket op som vigtige regulatorer af glukose homøostase. De besidder inflammatoriske (herunder CD8+ T-celler, Th1 og B-celler) eller primært regulerende funktioner (herunder regulatoriske T (treg) celler, Th2 celler) og kan både forværre eller beskytte mod insulinresistens7,8 , 9. det er
Desuden blev der foreslået flere mekanismer til at forklare, hvordan fedme øger steatohepatitis, herunder øget produktion af cytokiner ved fedtvæv10. NASH, den progressive form af ikke-alkoholiske fedt leversygdom og en stor sundhedsbyrde i de udviklede lande, er histologisk karakteriseret ved ballooned hepatocytter, lipid akkumulering, fibrose og pericellulær inflammation og kan udvikle sig til leversygdom i slutstadiet eller hepatocellulær karcinom. Flere regime (for eksempel methionin og cholin mangelfuld kost11) er kendt for at INDUCERE Nash-lignende lever patologi i ikke-humane dyremodeller, men de fleste af disse tilgange ikke rekapitulate menneskelige betingelser for Nash og dens metaboliske konsekvenser, da de enten kræver specifikke gen knockout, ikke-fysiologiske kost manipulationer eller manglende insulinresistens typisk for menneskelige NASH. Desuden er vores forståelse af de underliggende mekanismer for metaboliske sygdomme i øjeblikket baseret på eksperimenter udført med laboratorie mus, der er anbragt under standard specifikke patogenfri (SPF) betingelser. Disse barriere faciliteter er unormalt hygiejniske og ikke anser den mikrobielle mangfoldighed mennesker har at støde på, som kan tage højde for vanskeligheder i oversættelsen processen af dyreforsøg til kliniske tilgange12,13 , 14. det er
For at undersøge de forskellige immuncelle undersæt i fedtvæv og leveren under udviklingen af insulinresistens og NASH i en avanceret musemodel, der gengiver humane immunologiske tilstande, blev mus anbragt i individuelle bure i semi sterile betingelser uden barriere. Mus opstaldet under antigen udsatte forhold udviklede NASH-lignende lever patologi allerede efter 15 ugers højt fedtfattig kost (HFD) fodring13. Sammenlignet med alders matchede SPF-mus udviklede de makrovesikulær steatose, hepatisk infiltration og aktivering af immunceller.
Dette manuskript beskriver en robust flow cytometri analyse til at definere og tælle immuncelle undersæt fra mus fedtvæv og leveren i en model af NASH. Flow cytometri analyse giver mulighed for påvisning af flere parametre af individuelle celler samtidig i modsætning til RT-PCR eller Immunhistokemi tilgange.
Sammenfattende, vores undersøgelse tilbyder en mus model af kortsigtede HFD for at undersøge udviklingen af insulinresistens og NASH og de underliggende mekanismer, der også udviser troskab til den menneskelige tilstand.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">100&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">26G x 5/8 needles&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">35mm Petri Dishes&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">40&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td style="width:169px;">GIBCO</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103127</td>
			<td>AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Analysis software&#160;</td>
			<td>FlowJo 10.0.8 software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">117309</td>
			<td>AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">138411</td>
			<td>AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse CD127 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135023</td>
			<td>AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">123131</td>
			<td>AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135219</td>
			<td>AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108739</td>
			<td>AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101239</td>
			<td>AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV711 anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103255</td>
			<td>AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV785 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100749</td>
			<td>AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:351px;">C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Forschungseinrichtungen f&#252;r experimentelle Medizin (FEM)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CaCl2&#160;</td>
			<td>Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td style="width:119px;">A119.1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Collagenase NB 4G Proved Grade&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SERVA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11427513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:351px;">Collagenase Typ I&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 15ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 50ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DNAse&#160;&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Filter 30&#181;m&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Celltrics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">400422316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FITC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100203</td>
			<td>AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD-LSR Fortessa&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Bioanalytic GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">085021-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">High-fat diet&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SSNIF</td>
			<td>E15741&#8211;34&#160;</td>
			<td>60 kJ% from fat, 19&#8201;kJ% from proteins, and 21&#8201;kJ% from carbohydrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">micro dissecting scissors&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S3146</td>
			<td>used for dissection purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE anti-mouse CD25 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101903</td>
			<td>AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">104417</td>
			<td>AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">107629</td>
			<td>AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td>AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Percoll solution&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103031</td>
			<td>AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108427</td>
			<td>AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Round-Bottom Tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:169px;">STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">38030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TruStain fcX anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101301</td>
			<td>AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">423105</td>
			<td>viablity stain&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes

Fedme er forbundet med kronisk lav-grade inflammation og insulinresistens, bidrager til en stigende prævalens af kroniske metaboliske sygdomme, såsom type 2 diabetes og nonalkoholisk steatohepatitis (NASH). Nyere forskning har fastslået, at pro-inflammatoriske immunceller infiltrerer fede hypertrofisk fedtvæv og lever. I betragtning af den nye betydning af immunceller i forbindelse med metaboliske homøostase, der er et kritisk behov for at kvantificere og karakterisere deres modifikation under udviklingen af type 2 diabetes og NASH. Men, dyremodeller, der inducerer patofysiologiske funktioner typiske for menneskelige NASH er sparsom.
I denne artikel giver vi en detaljeret protokol til at identificere immuncelle undersæt isoleret fra leveren og fedtvæv i en pålidelig musemodel af NASH, der er etableret ved at huse højt fedtfattig kost (HFD) mus under ikke-specifikke patogen-fri (SPF) betingelser uden en barriere i mindst syv uger. Vi demonstrerer håndteringen af mus under ikke-SPF betingelser, fordøjelsen af vævet og identifikation af makrofager, naturlige dræber (NK) celler, dendritiske celler, B-og T-celle undergrupper ved flow cytometri. Repræsentative flow cytometri parceller fra SPF HFD-mus og ikke-SPF-mus leveres. For at opnå pålidelige og fortoldelig data, er brugen af antistoffer, nøjagtige og præcise metoder til vævs fordøjelse og korrekt gating i flow cytometri eksperimenter kritiske elementer.
Interventionen med henblik på at genoprette fysiologisk antigen eksponering hos mus ved at huse dem under ikke-SPF-betingelser og uspecifik eksponering for mikrobielle antigener kan være et relevant redskab til at undersøge forbindelsen mellem immunologiske ændringer, diæt inducerede fedme og relaterede langsigtede komplikationer.

Den beskrevne protokol tillader karakterisering af overflade markører af medfødte og adaptive immunceller isoleret fra murine perigonadal fedtvæv og leveren i en model af kost-induceret NASH. I denne model blev NASH induceret af administrationen af HFD plus saccharose (6%) i drikkevand i 7 til 15 uger i C57Bl/6J mus, som tidligere rapporteret13. Vigtigere, mus blev anbragt i semi sterile forhold og dermed udsat for miljømæssige antigener gennem hele eksperimentet. HFD fodret mus opstaldet i S...

Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

En enkel og pålidelig kost-induceret gnaver dyremodel for nonalkoholisk steatohepatitis (NASH) er beskrevet, opnået gennem ikke-SPF boliger af dyrene og administration af en bestemt fedtfattig diæt. Vi beskriver identifikation af hepatiske og fedtmæssige immuncelle undersæt for at rekapitulere humane immunologiske tilstande ved at udsætte mus for miljømæssige bakterier.

En avanceret murine model for alkoholfri steatohepatitis i forbindelse med type 2 diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare spørgsmål i immunometabolisme området om bidraget fra immunceller til fedme-induceret inflammation i fedt og steatohepatitis i levervæv. Disse teknikker er blevet optimeret til isolering af fedt- og lever immunceller i en kost-induceret model af ikke-alkoholisk steatohepatitis opnået gennem en ikke-specifik patogen-fri gnaver boliger. Disse metoder kan bidrage til at uddybe vores forståelse af de immunologiske mekanismer, der er involveret i vedligeholdelsen af metabolisk homøostase.Generelt, personer nye til denne teknik vil kæmpe med at maksimere udbyttet af funktionelt levedygtige dissocierede celler og oprette den rette gating i flow cytometri. At generere en fedtvæv encellede suspension, spray brystet af en aflivet mus med 70% ethanol, og omhyggeligt gøre en fem til seks-centimeter centrale snit gennem integument og bugvæg langs hele længden af brystkassen til at afsløre pleural hulrum og hjerte. Ved hjælp af en 26-gauge nål, injicere mindst 10 milliliter 0,9% saltvand opløsning i toppen af venstre ventrikel, og bruge en saks til at åbne bughulen.Derefter dissekere epigonadale fedtvæv, og afveje det. Mekanisk dissociaet fedtvævet i fine stykker i en petriskål ved fire grader Celsius, før vævsfragmenterne overføres til et 50-milliliter konisk rør. Petriskålen skylles med en milliliter 0,5 % kvægserumalbumin eller BSA i PBS, og der tilsættes tre milliliter frisklavet fedtvævsfordøjende opløsning pr. gram fedtvæv til røret.Efter 20 minutter ved 37 grader Celsius og 200 rotationer i minuttet, tilsæt fem milliliter 0,5% BSA i PBS, og placere fedtfordøje på is. Triturate opløsningen flere gange med en 10-milliliter serologisk pipette, og brug et stempel til at passere opløsningen gennem en 100-mikrometer si. Adskærg vævsfraktionerne ved centrifugering, og brug en pipette til at kassere den flydende adipocytfraktion.Resuspend den stromale vaskulære fraktion celle pellet i en milliliter ammonium-chlorid-kalium, eller ACK, lysis buffer, stoppe lysis reaktion med 10 milliliter 2% føtal kalv serum, eller FCS, i PBS efter et par sekunder. Derefter indsamles de isolerede hvide blodlegemer ved centrifugering, og opslæmle pellet i 250 mikroliter på 2% FCS i PBS til optælling. Høst leveren i et konisk rør af PBS på is, før du bruger sprøjtestempler til mekanisk at adskille vævet i en petriskål ved fire grader Celsius.Petriskålen overføres til et 50 milliliterrør med 10 milliliter varm leverfordøjeopløsning, og petriskålen skylles med tre milliliter frisk leverfordøjeopløsning. Efter 20 minutter ved 37 grader Celsius og 200 rotationer i minuttet, stoppe fordøjelsen med 20 milliliter HBSS, og triturere vævsslamten flere gange med en 10-milliliter serologisk pipette. Brug et stempel til at passere vævsopløsningen gennem en 100-mikrometers si, og indsamle levercellerne ved centrifugering.Opsalt pellet i 20 milliliter frisk HBSS, og fjern hepatocyte matrix ved centrifugering. Opsammer supernatanten til centrifugering, idet pelletsussuseres i 10 milliliter 33% lav viskositetsgradensgradientmed opløsning i HBSS. Separat lever immuncellerne ved massefylde gradient centrifugering, og resuspend leukocyt pellet i en milliliter ACK lysis buffer.Efter fire minutter ved stuetemperatur stoppes lysisen med 10 milliliter HBSS, og cellerne filtreres gennem en 30-mikrometer poresal i et 15-milliliterrør til centrifugering. Derefter resuspend pellet i 250 mikroliter af 2% FCS i PBS til optælling. For flow cytometrisk analyse af de isolerede leukocyt populationer, tilføjes op til tre gange 10 til de seks celler i 100 mikroliter af 2% FCS i PBS fra væv af interesse i individuelle polystyren fluorescens-aktiveret cellesortering, eller FACS, rør.Der tilsættes 10 mikroliter anti-CD16/CD32-antistof til hvert rør for at blokere enhver ikke-specifik binding i 10 minutter på is efterfulgt af farvning med en passende mængde antistofblanding og en mikroliter levedygtighedsfarve pr. prøve for at tillade forskelsbehandling af levende og døde celler. Efter 20 minutter ved fire grader Celsius beskyttet mod lys, vaskes prøverne to gange med to milliliter 2% FCS plus PBS per vask, og centrifuge ved 300 gange g i fem minutter ved fire grader Celsius. Derefter resuspend pellet i frisk PBS plus FCS.For at analysere cellerne ved flowcytometri skal du bruge en uindgroet negativ kontrolprøve til at indstille frem- og side scatter, og justere spændingerne i flowcytometeret for at detektere den levedygtige leukocytpopulation og til at udelukke snavs. Dernæst køres enkeltfarvede kontrolprøver for flerfarvet kompensation, før forsøgsprøverne køres, og der indsamles mindst fem gange 10 til de fire hændelser pr. rør. Derefter eksportere FCS datafiler til analyse, og sæt gating strategi for CD45-positive leukocytter at gøre det muligt at identificere de efterfølgende immuncellepopulationer af interesse.Her vises en repræsentativ gating-strategi for T-celleunderpopulationer, herunder doublet diskrimination og levedygtighed farvning i murine perigonadal fedt. CD45-positive leukocytter er først gated til CD4 og CD8 og efterfølgende for CD44 og CD62 ligand at skelne mellem naive, centrale hukommelse, effektor hukommelse, og effektor T-celler. CD44-positive celler er derefter yderligere karakteriseret med CD127, killer celle lectin-lignende receptor G1, og programmeret død-1.Her vises gating-strategien for analyse af B-celler, granulocytter, naturlige dræberceller, makrofager og dendritiske celler. En højere procentdel af effektorhukommelse CD4-positive og CD8-positive celler kan påvises i mus med højt fedtindhold, der er anbragt under ikke-SPF-forhold, mens intrahepatiske naive CD4-positive og CD8-positive T-celler viser sig at være betydeligt lavere hos disse dyr sammenlignet med SPF-mus med højt fedtindhold i uge syv. Svær steatose, herunder en stigning i store lipid dråber resulterer i makrovesicular steatose, lobular inflammation, hepatocellulær ballooning, og ødelagt lobular struktur findes i højt fedtindhold kost eksponerede mus, mens kun nogle SPF mus vise en mild fedt ophobning i leveren.Desuden er procentdelen af naturlige dræberceller højere i perigonadal fedtvæv af højt fedtindhold kost eksponerede mus, mens højt fedtindhold kost SPF mus viste højere procentdele af dendritiske celler. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at holde cellerne på is og i mørke, medmindre andet er angivet. Du bør nu have en god forståelse af, hvordan man korrekt forberede encellede suspensioner og hvordan man kan isolere murine fedt og levervæv for flow cytometri eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering af primære murine type II alveolære epitelceller for Funktionelle og molekylære studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated Type 1 Diabetes Induktion i mus ved adoptiv overførsel af diabetogene CD4 + T-celler

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Brug af Image Cytometry til kvantificering af patogene svampe i forbindelse med Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi Metoder til bestemmelse af levedygtighed Bakterier i foreningen med pattedvrceller

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolation og intravenøs injektion af murine knoglemarv Afledte Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo infektion af murint Epidermis med herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse af lymfocyt Ekstravasation Ved anvendelse af en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af humant blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Anvendelse af konsekvente massage lignende forstyrrelser på muse kalve og overvågning af de resulterende intramuskulære trykændringer

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Højeffektiv generation af antigen-specifikke primære mus cytotoksiske T-celler til funktionel testning i en autoimmun diabetes model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...