Name: an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

Wij danken Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin witte en Cornelia Heckmann voor hulp bij experimentele procedures en Benjamin Tiburzy van biolegend voor nuttige opmerkingen over de gating strategie. J.S. werd ondersteund door de Helmholtz Grant (ICEMED). Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Clinical Research Unit van het Berlijnse Instituut voor volksgezondheid (BIH), de "Miguel-Grant" van het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek en de Einstein Foundation. KERCKHOFS-B. en H.-Daphne worden gefinancierd door FOR2165.

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de nationale instituten van gezondheid en de wet van het welzijn van dieren onder toezicht van onze institutionele Commissie van het Dierzorg en gebruik. Dierlijke protocollen werden uitgevoerd volgens de institutionele ethische richtlijnen van de Charité Berlijn, Duitsland, en werden goedgekeurd door de Landesamt für Gesundheit und Soziales en voldoen aan de richtlijnen komen.
1. dieet-g...

<ol>
	<li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis.</a> BMC Public Health. 9, 88 (2009).</li><li>Prentki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+&#946;+cell+failure+in+type.">Islet &#946; cell failure in type.</a> J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).</li><li>Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+insulin+resistance.">Inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444, 840 (2006).</li><li>Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+immune+system+and+adipose+tissue+in+obesity.">Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+fat,+and+the+emergence+of+immunometabolism.">Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).</li><li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies.">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610 (2011).</li><li>Onodera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+induce+PPAR&#947;-high+FOXP3(+)+regulatory+T+cells.">Adipose tissue macrophages induce PPAR&#947;-high FOXP3(+) regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).</li><li>Calle, E. E., Kaaks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overweight,+obesity+and+cancer:+epidemiological+evidence+and+proposed+mechanisms.">Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).</li><li>Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Nonalcoholic+Steatohepatitis:+Eat,+Delete,+and+Inflame.">Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame.</a> Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice+by+normalizing+environment.">Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment.</a> Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).</li><li>Sbierski-Kind, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Housing+Conditions+Reveal+a+Major+Impact+of+Adaptive+Immunity+on+the+Course+of+Obesity-Induced+Type+2+Diabetes.">Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes.</a> Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).</li><li>Japp, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+immunology+assessed+by+multidimensional+mass+cytometry.">Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).</li><li>Benedict, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease:+An+expanded+review.">Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review.</a> World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Immunity,+and+Metabolic+Disease.">Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+Cells+in+Adipose+Tissue.">The Immune Cells in Adipose Tissue.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 15, 34-38 (2013).</li><li>Bertola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+expression+patterns+of+inflammatory+and+immune+response+genes+associated+with+obesity+and+NASH+in+morbidly+obese+patients.">Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients.</a> PloS One. 5 (10), e13577 (2010).</li><li>Turnbaugh, P. J., B&#228;ckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-Induced+Obesity+Is+Linked+to+Marked+but+Reversible+Alterations+in+the+Mouse+Distal+Gut+Microbiome.">Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome.</a> Cell Host &amp; Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).</li><li>Singh, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+diet+on+the+gut+microbiome+and+implications+for+human+health.">Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).</li><li>M&#252;ller, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+barrier+impairment+by+high-fat+diet+in+mice+depends+on+housing+conditions.">Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions.</a> Molecular Nutrition &amp; Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).</li></ol>

Steatohepatitis heeft een sterke associatie met metabole afwijkingen zoals obesitas, insulineresistentie en dyslipidemie15. De veelvoudige studies wijzen erop dat de ontsteking van het vetweefsel de pathogenese van type 2 diabetes, met inbegrip van veranderde niveaus van cellen van zowel het aangeboren als aanpassings immune systeem4,5,16,17 kan drijven . Daarnaast is ge...

Obesitas is een multifactoral stoornis en een belangrijke risicofactor voor het ontwikkelen van hart-en vaatziekten, beroerte, niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH), type 2 diabetes (T2D) en sommige vormen van kanker. De prevalentie van obesitas neemt wereldwijd snel toe. Vandaag, 2.100.000.000 mensen-bijna 30% van de wereldbevolking-zijn ofwel zwaarlijvig of overgewicht1. Obesitas-geassocieerde insulineresistentie kan leiden tot T2D, wanneer uitgeput pancreas Islet beta cellen niet te compenseren voor de toegenomen behoefte aan insuline te handhaven glucose homeostase2.
Vetweefsel is samengesteld uit verschillende soorten cellen, waaronder adipocyten, endothelial cellen, fibroblasten en immuun cellen. Tijdens de progressie van obesitas, veranderingen in het aantal en de activiteit van het immuunsysteem cellen kan leiden tot een lage-grade ontsteking van hypertrofische vetweefsel3,4. Concreet is gebleken dat overmatige energie-inname, begeleid door chronisch verhoogde niveaus van bloedglucose, triglyceriden en vrije vetzuren, leidt tot adipocyte hypoxie, endoplasmatisch reticulum stress, verminderde mitochondriale functie en verbeterde cytokine secretie, resulterend in de activering van pro-inflammatoire vetweefsel immuun cellen5,6. Afgelopen onderzoek is vooral gericht op aangeboren immuniteit, maar meer recentelijk adaptieve immuun cellen (T en B-cellen) zijn ontstaan als belangrijke regulatoren van glucose homeostase. Zij bezitten ontstekings (met inbegrip van CD8+ T cellen, Th1, en de cellen van B) of hoofdzakelijk regelgevende functies (met inbegrip van regelgevende T (Treg) cellen, Th2 cellen) en kunnen zowel verergeren of beschermen tegen insulineweerstand7,8 , 9.
Voorts werden verscheidene mechanismen voorgesteld om te verklaren hoe de zwaarlijvigheid Steatohepatitis, met inbegrip van verhoogde productie van cytokines door vetweefsel10toeneemt. NASH, de progressieve vorm van niet-alcoholische vervetting van de leverziekte en een grote gezondheids last in de ontwikkelde landen, is histologisch gekenmerkt door ballon hepatocyten, lipide accumulatie, fibrose en pericellular ontsteking en kan vooruitgang te cirrose, eindstadium leverziekte of hepatocellulair carcinoom. Verschillende regimes (bijvoorbeeld de methionine en choline gebrekkig dieet11) is bekend dat Nash-achtige lever pathologie induceren in niet-menselijke dierlijke modellen, maar de meeste van deze benaderingen niet recapituleren menselijke omstandigheden van Nash en de metabole gevolgen als ze ofwel vereisen specifieke gen knock-out, niet-fysiologische dieet manipulaties of gebrek aan insulineresistentie typisch voor de mens NASH. Bovendien is ons begrip van de onderliggende mechanismen van metabole ziekten momenteel gebaseerd op experimenten uitgevoerd met laboratoriummuizen gehuisvest onder standaard specifieke pathogeen vrije (SPF) voorwaarden. Die barrière faciliteiten zijn abnormaal hygiënisch en beschouwen niet de microbiële diversiteit mensen moeten ontmoeten, die voor moeilijkheden in het vertaalproces van dierlijke studies aan klinische benaderingen kunnen rekenschap nemen12,13 , 14.
Om de verschillende immune cel subsets in vetweefsel en lever tijdens de ontwikkeling van insulineweerstand en NASH in een geavanceerd muismodel te onderzoeken dat menselijke immunologische voorwaarden reproduceert, werden de muizen gehuisvest in individuele kooien in semi steriel omstandigheden zonder barrière. De muizen die onder antigeen blootgestelde voorwaarden worden gehuisvest ontwikkelden NASH-als lever pathologie reeds na 15 weken van high-fat dieet (HFD) het voeden13. Vergeleken met leeftijds gematchte SPF muizen ontwikkelden zij macrovesicular steatose, lever infiltratie en activering van immune cellen.
Dit manuscript beschrijft een robuuste flow Cytometry analyse te definiëren en te tellen immune cel subsets van muis vetweefsel en lever in een model van NASH. Flow Cytometry analyse maakt het mogelijk de detectie van meerdere parameters van individuele cellen gelijktijdig in tegenstelling tot RT-PCR of Immunohistochemistry benaderingen.
Samengevat, onze studie biedt een muismodel van korte-termijn HFD voor het onderzoek naar de ontwikkeling van insulineresistentie en NASH en de onderliggende mechanismen die ook vertoont trouw aan de menselijke conditie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">100&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">26G x 5/8 needles&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">35mm Petri Dishes&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">40&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td style="width:169px;">GIBCO</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103127</td>
			<td>AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Analysis software&#160;</td>
			<td>FlowJo 10.0.8 software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">117309</td>
			<td>AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">138411</td>
			<td>AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse CD127 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135023</td>
			<td>AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">123131</td>
			<td>AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135219</td>
			<td>AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108739</td>
			<td>AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101239</td>
			<td>AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV711 anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103255</td>
			<td>AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV785 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100749</td>
			<td>AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:351px;">C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Forschungseinrichtungen f&#252;r experimentelle Medizin (FEM)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CaCl2&#160;</td>
			<td>Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td style="width:119px;">A119.1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Collagenase NB 4G Proved Grade&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SERVA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11427513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:351px;">Collagenase Typ I&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 15ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 50ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DNAse&#160;&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Filter 30&#181;m&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Celltrics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">400422316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FITC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100203</td>
			<td>AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD-LSR Fortessa&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Bioanalytic GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">085021-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">High-fat diet&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SSNIF</td>
			<td>E15741&#8211;34&#160;</td>
			<td>60 kJ% from fat, 19&#8201;kJ% from proteins, and 21&#8201;kJ% from carbohydrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">micro dissecting scissors&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S3146</td>
			<td>used for dissection purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE anti-mouse CD25 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101903</td>
			<td>AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">104417</td>
			<td>AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">107629</td>
			<td>AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td>AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Percoll solution&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103031</td>
			<td>AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108427</td>
			<td>AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Round-Bottom Tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:169px;">STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">38030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TruStain fcX anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101301</td>
			<td>AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">423105</td>
			<td>viablity stain&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes

Obesitas wordt geassocieerd met chronische low-grade ontsteking en insulineresistentie, bij te dragen tot een toenemende prevalentie van chronische metabole ziekten, zoals type 2 diabetes en niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH). Recent onderzoek heeft vastgesteld dat pro-inflammatoire immuun cellen infiltreren zwaarlijvige hypertrofische vetweefsel en lever. Gezien het opkomende belang van immune cellen in de context van metabolische homeostase, is er een kritieke behoefte om hun wijziging tijdens de ontwikkeling van type 2 diabetes en NASH te kwantificeren en te karakteriseren. Echter, dierlijke modellen die induceren pathofysiologische kenmerken van de menselijke NASH zijn schaars.
In dit artikel, bieden wij een gedetailleerd protocol te identificeren immuun cel subsets geïsoleerd van lever en vetweefsel in een betrouwbare muismodel van NASH, opgericht door de huisvesting van high-fat Diet (HFD) muizen onder niet-specifieke pathogeen-vrije (SPF) voorwaarden zonder een ten minste zeven weken. We demonstreren de behandeling van muizen in niet-SPF-omstandigheden, de spijsvertering van de weefsels en de identificatie van macrofagen, Natural Killer (NK) cellen, dendritische cellen, B en T-cel subsets door flow Cytometry. Representatieve flow Cytometry percelen van SPF HFD muizen en niet-SPF muizen zijn voorzien. Voor het verkrijgen van betrouwbare en interpreterende gegevens, het gebruik van antilichamen, nauwkeurige en precieze methoden voor de spijsvertering en de juiste gating in flow Cytometry experimenten zijn kritische elementen.
De interventie om de blootstelling van fysiologische antigeen bij muizen te herstellen door ze te bewonen in niet-SPF-omstandigheden en onspecifieke blootstelling aan microbiële antigenen kan een relevant hulpmiddel zijn voor het onderzoeken van het verband tussen immunologische veranderingen, dieet-geïnduceerde obesitas en aanverwante complicaties op lange termijn.

Het beschreven protocol maakt het mogelijk de karakterisering van oppervlakte markers van aangeboren en adaptieve immuun cellen geïsoleerd van muizen perigonadal vetweefsel en lever in een model van dieet-geïnduceerde NASH. In dit model werd NASH geïnduceerd door toediening van HFD plus sacharose (6%) in drinkwater gedurende 7 tot 15 weken in C57Bl/6J muizen, zoals eerder gemeld13. Belangrijk is dat muizen werden ondergebracht in semi-steriele omstandigheden en, dus, blootgesteld aan milieu-ant...

Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Een eenvoudige en betrouwbare dieet-geïnduceerde knaagdier model voor niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH) wordt beschreven, bereikt door niet-SPF huisvesting van de dieren en het beheer van een specifieke high-fat dieet. Wij beschrijven de identificatie van de lever-en vetweefsel immuun cel subsets aan recapituleren menselijke immunologische omstandigheden door bloot muizen aan milieu-kiemen.

Een geavanceerd muizen model voor niet-alcoholische Steatohepatitis in samenwerking met type 2 diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van immunometabolisme over de bijdrage van immuuncellen aan obesitas-geïnduceerde ontsteking in vet en steatohepatitis in leverweefsel. Deze technieken zijn geoptimaliseerd voor de isolatie van vet- en lever immune cellen in een door voeding geïnduceerd model van niet-alcoholische steatohepatitis bereikt door een niet-specifieke pathogene-vrije knaagdierbehuizing. Deze methoden kunnen helpen om ons begrip van de immunologische mechanismen die betrokken zijn bij het behoud van metabole homeostase te verdiepen.Over het algemeen, individuen nieuw aan deze techniek zal worstelen met het maximaliseren van de opbrengst van functioneel levensvatbare gescheiden cellen en het opzetten van de juiste gating in flow cytometrie. Voor het genereren van een vetweefsel eencellige suspensie, spray de borst van een geëuthanaseerde muis met 70%-ethanol, en zorgvuldig een vijf tot zes centimeter centrale incisie door de integument en buikwand langs de gehele lengte van de ribbenkast om de pleuraholte en het hart bloot te stellen. Met behulp van een 26-gauge naald, injecteren ten minste 10 milliliter van 0,9%zoutoplossing in de top van de linker ventrikel, en gebruik schaar om de buikholte te openen.Ontleed vervolgens het epigonade vetweefsel en weeg het. Verwijder het vetweefsel mechanisch in fijne stukjes in een petrischaaltje bij vier graden Celsius voordat u de weefselfragmenten in een conische buis van 50 milliliter overzet. Spoel de petrischaal met een milliliter van 0,5% runder serum albumine, of BSA, in PBS, en voeg drie milliliter vers bereid vetweefsel verteren oplossing per gram vetweefsel aan de buis.Na 20 minuten bij 37 graden Celsius en 200 rotaties per minuut, voeg vijf milliliter van 0,5%BSA in PBS, en plaats de vetvertering op ijs. Triturate de oplossing meerdere keren met een 10-milliliter serologische pipet, en gebruik een zuiger om de oplossing door een 100-micrometer zeef. Scheid de weefselfracties door centrifugatie en gebruik een pipet om de drijvende adipocytefractie weg te gooien.Resuspend de stromale vasculaire fractiecelpellet in een milliliter ammoniumchloride-kalium, of ACK, lysebuffer, waardoor de lysereactie na enkele seconden stopt met 10 milliliter van 2%foetaal kalfsserum, of FCS, in PBS. Verzamel vervolgens de geïsoleerde witte bloedcellen door centrifugatie en zet de pellet opnieuw op in 250 microliters van 2%FCS in PBS voor het tellen. Oogst de lever in een conische buis van PBS op ijs voordat u spuitzegels gebruikt om het weefsel mechanisch te scheiden in een petrischaaltje bij vier graden Celsius.Breng de ontleed leverweefsel fragmenten in een 50-milliliter buis met 10 milliliter van warme lever digest oplossing, en spoel de petrischaal met drie milliliter verse lever verteren oplossing. Na 20 minuten bij 37 graden Celsius en 200 rotaties per minuut, stop de spijsvertering met 20 milliliter HBSS en trituraat de weefseldrijfmest meerdere keren met een 10-milliliter serologische pipet. Gebruik een zuiger om de weefseloplossing door een 100-micrometer zeef te passeren en de levercellen te verzamelen door middel van centrifugatie.Resuspend de pellet in 20 milliliter verse HBSS, en verwijder de hepatocyte matrix door centrifugatie. Verzamel de supernatant voor centrifugatie, resuspending de pellet in 10 milliliter van 33% lage viscositeit dichtheid gradiënt medium oplossing in HBSS. Scheid de lever immuuncellen door dichtheid gradiënt centrifugatie, en resuspend de leukocyte pellet in een milliliter van ACK lyse buffer.Na vier minuten bij kamertemperatuur, stop de lysis met 10 milliliter HBSS en filtreer de cellen door een poriezeef van 30 micrometer in een buis van 15 milliliter voor centrifugatie. Vervolgens, resuspend de pellet in 250 microliters van 2% FCS in PBS voor het tellen. Voor flow cytometrische analyse van de geïsoleerde leukocyten populaties, toe te voegen tot drie keer 10 tot de zes cellen in 100 microliters van 2%FCS in PBS van het weefsel van belang in individuele polystyreen fluorescentie geactiveerde cel sorteren, of FACS, buizen.Voeg 10 microliter anti-CD16/CD32-antilichaam toe aan elke buis om elke niet-specifieke binding gedurende 10 minuten op ijs te blokkeren, gevolgd door vlekken met het juiste volume van het antilichaammengsel en één microliter levensvatbaarheidskleurstof per monster om levende en dode celdiscriminatie mogelijk te maken. Na 20 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht, was de monsters twee keer met twee milliliters van 2%FCS plus PBS per wasbeurt, en centrifuge op 300 keer g gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Dan, resuspend de pellet in verse PBS plus FCS.Als u de cellen wilt analyseren door cytometrie in de stroom, gebruikt u een niet-gekleurd negatief controlemonster om de voorwaartse en zijverstrooiing in te stellen en de spanningen van de stroomcytometer aan te passen om de levensvatbare leukocytenpopulatie te detecteren en het puin uit te sluiten. Voer vervolgens enkel gekleurde controlemonsters uit voor veelkleurige compensatie voordat u de experimentele monsters uitvoert en verzamel ten minste vijf keer tien tot de vier gebeurtenissen per buis. Exporteer vervolgens de FCS-gegevensbestanden voor analyse en stel de gatingstrategie voor CD45-positieve leukocyten in om de identificatie van de daaropvolgende immuuncelpopulaties van belang mogelijk te maken.Hier wordt een representatieve gating strategie voor T cel subpopulaties met inbegrip van doublet discriminatie en levensvatbaarheid vlekken in murine perigonadal vet getoond. CD45-positieve leukocyten worden eerst gated voor CD4 en CD8 en vervolgens voor CD44 en CD62 ligand om onderscheid te maken tussen naïeve, centrale geheugen, effector geheugen, en effector T cellen. CD44-positieve cellen worden dan verder gekenmerkt met CD127, killer cell lectine-achtige receptor G1, en geprogrammeerd death-1.Hier wordt de gatingstrategie voor het analyseren van B-cellen, granulocyten, natuurlijke killercellen, macrofagen en dendritische cellen weergegeven. Een hoger percentage van effector geheugen CD4-positieve en CD8-positieve cellen kunnen worden gedetecteerd in vetrijke dieet muizen gehuisvest in niet-SPF voorwaarden, terwijl intrahepatische naïeve CD4-positieve en CD8-positieve T-cellen blijken aanzienlijk lager te zijn bij deze dieren in vergelijking met SPF vetrijke dieet muizen in week zeven. Ernstige steatose, met inbegrip van een toename van grote lipide druppels resulterend in macrovesiculaire steatose, lobaire ontsteking, hepatocellulaire ballonvaren, en vernietigde lobular structuur wordt gevonden in vetrijke dieet blootgestelde muizen, terwijl slechts sommige SPF muizen vertonen een milde vetophoping in de lever.Bovendien is het percentage natuurlijke killer cellen hoger in het perigonadale vetweefsel van vetrijke dieet blootgestelde muizen, terwijl vetrijke dieet SPF muizen aangetoond hogere percentages van dendritische cellen. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om de cellen op ijs en in het donker te houden, tenzij anders vermeld. Je moet nu een goed begrip van hoe goed voor te bereiden eencellige suspensies en hoe murine vet en hepatisch weefsel te isoleren voor flow cytometrie experimenten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris Muris Infectie: Een model van type 2 immuniteit en ontsteking in de darm

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Gebruik van Afbeelding Cytometry voor kwantificering van pathogene schimmels in associatie met gastheercellen

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infectie van Muizen Epidermis met Herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Toepassing van consistente massage-achtige perturbaties op muis kalveren en het monitoren van de resulterende intramusculaire drukveranderingen

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...