Name: an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

Wir danken Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte und Cornelia Heckmann für die Unterstützung bei experimentellen Verfahren und Benjamin Tiburzy von Biolegend für hilfreiche Kommentare zur Gating-Strategie. J.S. wurde vom Helmholtz Grant (ICEMED) unterstützt. Die Studie wurde durch Stipendien der Klinischen Forschergruppe des Berliner Instituts für Gesundheit (BIH), des "BCRT-Stipendiums" des Bundesministeriums für Bildung und Forschung und der Einstein-Stiftung unterstützt. K.S.-B. Und H.-D.V. wird von FOR2165 finanziert.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren der Nationalen Gesundheitsinstitute und des Tierschutzgesetzes unter der Aufsicht unseres institutionellen Tierschutzausschusses durchgeführt. Die Tierprotokolle wurden nach institutionalethischen Richtlinien der Charité Berlin durchgeführt und vom Landesamt für Gesundheit und Soziales genehmigt und entsprechen den ARRIVE-Richtlinien.
1. Diät-induziertes Tiermodell der Steatohepatitis
<o...

<ol>
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Die Steatohepatitis hat eine starke Verbindung mit Stoffwechselstörungen wie Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipidämie15. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass eine Fettgewebe-Entzündung die Pathogenese von Typ-2-Diabetes antreiben kann, einschließlich veränderter Zellwerte sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems 4,5,16, 17 . Darüber hi...

Fettleibigkeit ist eine multifaktorielle Erkrankung und ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung von Herzerkrankungen, Schlaganfall, alkoholfreier Steatohepatitis (NASH), Typ-2-Diabetes (T2D) und einigen Krebsarten. Die Verbreitung von Fettleibigkeit nimmt weltweit rapide zu. Heute sind 2,1 Milliarden Menschen — fast 30% der Weltbevölkerung — entweder fettleibig oder übergewichtig1. Fettleibig-assoziierte Insulinresistenz kann zu T2D führen, wenn erschöpfte Bauchspeicheldrüsen-Beta-Zellen den erhöhten Bedarf an Insulin zur Aufrechterhaltung der Glukose-Homöostase2nicht kompensieren.
Das Fettgewebe besteht aus verschiedenen Zelltypen, darunter Adipozyten, Endothelzellen, Fibroblasten und Immunzellen. Während des Fortschritts der Fettleibigkeit können Veränderungen in der Anzahl und Aktivität von Immunzellen zu einer minderwertigen Entzündung des hypertrophischenFettgewebes 3,4führen. Konkret wurde festgestellt, dass eine übermäßige Energieaufnahme, begleitet von chronisch erhöhten Blutzuckerwerten, Triglyceriden und freien Fettsäuren, zu Adipozyten-Hypoxie, endoplasmatischer Retikelstress, beeinträchtigter Mitochondrien-Funktion und Verstärkten die Cytokin-Sekretion, was zur Aktivierung von entzündungshemmenden Fettzellen5,6führt. Die bisherigen Forschungen haben sich vor allem auf die angeborene Immunität konzentriert, aber in jüngerer Zeit haben sich adaptive Immunzellen (T und B-Zellen) als wichtige Regulatoren der Glukose-Homöostase herausgebildet. Sie verfügen über entzündliche Funktionen (einschließlich CD8+ T-Zellen, Th1 und B-Zellen) oder vor allem über regulatorische Funktionen (einschließlich regulatorischer T (Treg) Zellen, Th2-Zellen) und können sowohldie Insulinresistenz von7,8 verschärfen noch schützen. , 9. September
Darüber hinaus wurden mehrere Mechanismen vorgeschlagen, um zu erklären, wie Fettleibigkeit die Steatohepatitis erhöht, einschließlich der erhöhten Produktion von Zytokinen durch Fettgewebe 10. NASH, die fortschreitende Form der alkoholfreien Fettlebererkrankung und eine große gesundheitliche Belastung in den Industrieländern, ist histologisch durch aufgeblasene Hepatozyten, Fettansammlungen, Fibrose und pericelluläre Entzündungen gekennzeichnet und kann sich fortentwickeln, um Zirrhose, Lebererkrankung im Endstadium oder hepatokelluläres Karzinom. Mehrere Regimen (zum Beispiel die Methion-und Cholin-Mangelnahrung 11) sind dafür bekannt, dass sie in nicht-menschlichen Tiermodellen eine NASH-ähnliche Leberpathologie hervorrufen, aber die meisten dieser Ansätze rekapitulieren die menschlichen Bedingungen der NASH und ihrer Stoffwechsels nicht. Konsequenzen, da sie entweder einen spezifischen Genknockout, nicht-physiologische Ernährungsmanipulationen oder keine Insulinresistenz erfordern, die typisch für die menschliche NASH ist. Darüber hinaus basiert unser Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen von Stoffwechselerkrankungen derzeit auf Experimenten, die mit Labormäusen durchgeführt werden, die unter den üblichen pathogenfreien (SPF) Bedingungen untergebracht sind. Diese Barriereanlagen sind ungewöhnlich hygienisch und berücksichtigen nicht die mikrobielle Vielfalt, auf die der Mensch stoßen muss, was für Schwierigkeiten im Übersetzungsprozess von Tierstudien zu klinischen Ansätzen 12, 13 verantwortlich sein kann. , 14.
Um die verschiedenen Immunzelluntergruppen in Fettgewebe und Leber bei der Entwicklung von Insulinresistenz und NASH in einem fortgeschrittenen Mausmodell zu untersuchen, das menschliche Immunbedingungen reproduziert, wurden Mäuse in einzelnen Käfigen in halbsterilen Bedingungen ohne Barriere. Mäuse, die unter Antigen-exponierten Bedingungen untergebracht waren, entwickelten bereits nach 15 Wochen fettreicher Ernährung(HFD) eine NASH-ähnliche Leberpathologie. Im Vergleich zu altersgerechten SPF-Mäusen entwickelten sie makrovesikuläre Steatose, Leberinfiltration und Aktivierung von Immunzellen.
Dieses Manuskript beschreibt eine robuste Strömungszytometrie-Analyse, um Immunzellen-Teilmengen aus dem Fettgewebe und der Leber der Maus in einem Modell von NASH zu definieren und zu zählen. Die Strömungszytometrie-Analyse ermöglicht die Ermittlung mehrerer Parameter einzelner Zellen gleichzeitig im Gegensatz zu RT-PCR oder Immunhistochemie-Ansätzen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Studie ein Mausmodell der kurzfristigen HFD zur Untersuchung der Entwicklung von Insulinresistenz und NASH sowie den zugrundeliegenden Mechanismen bietet, die auch die Treue zum menschlichen Zustand aufweisen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">100&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">26G x 5/8 needles&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">35mm Petri Dishes&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">40&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td style="width:169px;">GIBCO</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103127</td>
			<td>AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Analysis software&#160;</td>
			<td>FlowJo 10.0.8 software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">117309</td>
			<td>AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">138411</td>
			<td>AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse CD127 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135023</td>
			<td>AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">123131</td>
			<td>AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135219</td>
			<td>AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108739</td>
			<td>AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101239</td>
			<td>AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV711 anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103255</td>
			<td>AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV785 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100749</td>
			<td>AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:351px;">C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Forschungseinrichtungen f&#252;r experimentelle Medizin (FEM)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CaCl2&#160;</td>
			<td>Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td style="width:119px;">A119.1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Collagenase NB 4G Proved Grade&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SERVA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11427513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:351px;">Collagenase Typ I&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 15ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 50ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DNAse&#160;&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Filter 30&#181;m&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Celltrics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">400422316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FITC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100203</td>
			<td>AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD-LSR Fortessa&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Bioanalytic GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">085021-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">High-fat diet&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SSNIF</td>
			<td>E15741&#8211;34&#160;</td>
			<td>60 kJ% from fat, 19&#8201;kJ% from proteins, and 21&#8201;kJ% from carbohydrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">micro dissecting scissors&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S3146</td>
			<td>used for dissection purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE anti-mouse CD25 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101903</td>
			<td>AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">104417</td>
			<td>AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">107629</td>
			<td>AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td>AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Percoll solution&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103031</td>
			<td>AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108427</td>
			<td>AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Round-Bottom Tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:169px;">STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">38030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TruStain fcX anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101301</td>
			<td>AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">423105</td>
			<td>viablity stain&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes

Fettleibigkeit wird mit chronischen, minderwertigen Entzündungen und Insulinresistenz in Verbindung gebracht, was zu einer zunehmenden Prävalenz chronischer Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes und alkoholfreier Steatohepatitis (NASH) beiträgt. Neuere Forschungen haben ergeben, dass entzündungshemmende Immunzellen fettleibiges hypertrophisches Fettgewebe und Leber infiltrieren. Angesichts der sich abzeichnenden Bedeutung von Immunzellen im Zusammenhang mit der metabolischen Homöostase ist es dringend erforderlich, ihre Veränderung bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes und NASH zu quantifizieren und zu charakterisieren. Tiermodelle, die für die menschliche NASH typische pathophysiologische Merkmale hervorrufen, sind jedoch spärlich.
In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Immunzellen-Teilmengen zu identifizieren, die von der Leber und dem Fettgewebe isoliert sind, in einem zuverlässigen Mausmodell von NASH, das durch die Unterbringung von fettreichen Diät-Mäusen (HFD) unter unspezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen ohne Sperre für mindestens sieben Wochen. Wir zeigen den Umgang mit Mäusen unter nicht-seften Bedingungen, die Verdauung des Gewebes und die Identifizierung von Makrophagen, natürlichen Killerzellen (NK), dendritischen Zellen, B und T-Zell-Untergruppen durch Fließzytometrie. Repräsentative Flow-Zytometrie-Parzellen von SPF-HFD-Mäuse und Nicht-SPF-Mäusen werden zur Verfügung gestellt. Um verlässliche und interpretierbare Daten zu erhalten, sind der Einsatz von Antikörpern, präzisen und präzisen Methoden zur Gewebeverdauung und der richtigen Gattung in Strömungszytometrie-Experimenten entscheidende Elemente.
Der Eingriff zur Wiederherstellung der physiologischen Antigen-Exposition bei Mäusen, indem er sie unter nicht-slawischen Bedingungen unterbringt, und die unspezifische Exposition gegenüber mikrobiellen Antigenen könnten ein relevantes Instrument zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen immunologischen Veränderungen sein, die durch die Ernährung verursacht werden. Fettleibigkeit und damit verbundene Langzeitkomplikationen.

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Charakterisierung von Oberflächenmarkern angeborener und adaptiver Immunzellen, die von murem perigonadalem Fettgewebe und Leber in einem Modell der Diät-induzierten NASH isoliert sind. Bei diesem Modell wurde NASH durch die Verabreichung von HFD plus Saccharose (6%) induziert. 7 bis 15 Wochen im Trinkwasser in C57Bl/6J Mäuse, wie zuvor berichtet 13. Wichtig ist, dass Mäuse in halbsterilen Bedingungen untergebracht waren und daher während des gesamte...

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An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Es wird ein einfaches und zuverlässiges, diächterinduziertes Zäuntiermodell für alkoholfreie Steatohepatitis (NASH) beschrieben, das durch das nicht-SPF-Gehäuse der Tiere und die Verabreichung einer bestimmten fettreichen Ernährung erreicht wird. Wir beschreiben die Identifizierung von Leber-und Fettzell-Subsets, um die menschlichen Immunbedingungen zu rekapitulieren, indem Mäuse Umweltkeimen aussetzen.

Ein fortgeschrittenes Murine-Modell für alkoholfreie Steatohepatitis in Verbindung mit Typ-2-Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Diese Methode kann helfen, Fragen im Immunstoffwechselfeld über den Beitrag von Immunzellen zu Adipositas-induzierten Entzündungen in Fett- und Steatohepatitis im Lebergewebe zu beantworten. Diese Techniken wurden für die Isolierung von Fett- und Leberimmunzellen in einem ernährungsinduzierten Modell der nichtalkoholischen Steatohepatitis optimiert, das durch ein unspezifisches pathogenfreies Nagetiergehäuse erreicht wird. Diese Methoden können dazu beitragen, unser Verständnis der immunologischen Mechanismen zu vertiefen, die bei der Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase beteiligt sind.Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik neu sind, mit der Maximierung der Ausbeute von funktional lebensfähigen dissoziierten Zellen und der Einrichtung der richtigen Gating in der Durchflusszytometrie zu kämpfen haben. Um eine fettgewebe-Einzelzellsuspension zu erzeugen, sprühen Sie die Brust einer eingeschläferten Maus mit 70% Ethanol und machen Sie vorsichtig einen fünf bis sechs Zentimeter großen zentralen Schnitt durch die Integument- und Bauchwand entlang der gesamten Länge des Rippenkäfigs, um die Pleurahöhle und das Herz freizulegen. Mit einer 26-Spur-Nadel, injizieren Sie mindestens 10 Milliliter 0,9%saline Lösung in die Spitze der linken Herzkammer, und verwenden Sie eine Schere, um die Peritonealhöhle zu öffnen.Dann sezieren Sie das epigonadale Fettgewebe und wiegen Sie es. Zerlegen Sie das Fettgewebe in einer Petrischale bei vier Grad Celsius mechanisch in feine Stücke, bevor die Gewebefragmente in ein 50-Milliliter-Konusrohr übertragen werden. Spülen Sie die Petrischale mit einem Milliliter 0,5% Rinderserumalbumin oder BSA in PBS, und fügen Sie drei Milliliter frisch zubereitete Fettgewebe-Digest-Lösung pro Gramm Fettgewebe in die Röhre.Nach 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute fünf Milliliter 0,5%BSA in PBS hinzufügen und den Fettverdauungsgrad auf Eis legen. Trituieren Sie die Lösung mehrmals mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette und verwenden Sie einen Kolben, um die Lösung durch ein 100-Mikrometer-Sieb zu passieren. Trennen Sie die Gewebefraktionen durch Zentrifugation, und verwenden Sie eine Pipette, um die schwimmende Adipozytenfraktion zu verwerfen.Setzen Sie das stromale Vaskuläre Zellpellet in einem Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium oder ACK, Lysepuffer, wieder auf und stoppen Sie die Lysereaktion mit 10 Millilitern 2%fetalem Kalbserum oder FCS in PBS nach wenigen Sekunden. Dann sammeln Sie die isolierten weißen Blutkörperchen durch Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in 250 Mikroliter von 2%FCS in PBS zum Zählen. Ernten Sie die Leber in eine konische Röhre von PBS auf Eis, bevor Sie Spritzenstempel verwenden, um das Gewebe in einer Petrischale bei vier Grad Celsius mechanisch zu dissoziieren.Übertragen Sie die sezierten Lebergewebefragmente in eine 50-Milliliter-Röhre mit 10 Milliliter warmer Leberverdauungslösung und spülen Sie die Petrischale mit drei Millilitern frischer Leberverdauungslösung ab. Nach 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute die Verdauung mit 20 Millilitern HBSS beenden und die Gewebeschlämme mehrmals mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette trituieren. Verwenden Sie einen Kolben, um die Gewebelösung durch ein 100-Mikrometer-Sieb zu passieren, und sammeln Sie die Leberzellen durch Zentrifugation.Setzen Sie das Pellet in 20 Milliliter frischer HBSS aus, und entfernen Sie die Hepatozytenmatrix durch Zentrifugation. Sammeln Sie den Überstand für die Zentrifugation, indem Sie das Pellet in 10 Millilitern mit 33% niedriger Viskositätsdichtegradienten-Medium-Lösung in HBSS wieder aufhängen. Trennen Sie die Leberimmunzellen durch Dichtegradientzentrifugation, und setzen Sie das Leukozytenpellet in einem Milliliter ACK-Lysepuffer wieder auf.Nach vier Minuten bei Raumtemperatur die Lyse mit 10 Millilitern HBSS stoppen und die Zellen durch ein 30-Mikrometer Porensieb in ein 15-Milliliter-Rohr für die Zentrifugation filtern. Dann setzen Sie das Pellet in 250 Mikroliter 2%FCS in PBS zum Zählen wieder aus. Für die zytometrische Analyse der isolierten Leukozytenpopulationen summieren sich bis zu dreimal 10 zu den sechs Zellen in 100 Mikrolitern von 2%FCS in PBS aus dem Gewebe von Interesse in einzelne Polystyrolfluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, oder FACS, Rohre.Fügen Sie 10 Mikroliter Anti-CD16/CD32-Antikörper in jedes Rohr ein, um jede unspezifische Bindung für 10 Minuten auf Eis zu blockieren, gefolgt von einer Färbung mit dem entsprechenden Volumen an Antikörpergemisch und einem Mikroliter Lebensfähigkeitsfarbstoff pro Probe, um eine Diskriminierung lebender und toter Zellen zu ermöglichen. Nach 20 Minuten bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt, waschen Sie die Proben zweimal mit zwei Millilitern von 2%FCS plus PBS pro Wäsche, und Zentrifuge bei 300 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dann setzen Sie das Pellet in frischem PBS plus FCS wieder aus.Um die Zellen durch Durchflusszytometrie zu analysieren, verwenden Sie eine ungefärbte negative Kontrollprobe, um die Vorwärts- und Seitenstreuung einzustellen, und passen Sie die Spannungen des Durchflusszytometers an, um die lebensfähige Leukozytenpopulation zu erkennen und die Trümmer auszuschließen. Führen Sie anschließend einzelne gebeizte Kontrollproben für die mehrfarbige Kompensation aus, bevor Sie die experimentellen Proben ausführen, und sammeln Sie mindestens fünfmal 10 bis zu den vier Ereignissen pro Rohr. Exportieren Sie dann die FCS-Datendateien zur Analyse, und legen Sie die Gating-Strategie für CD45-positive Leukozyten fest, um die Identifizierung der nachfolgenden Immunzellpopulationen von Interesse zu ermöglichen.Hier wird eine repräsentative Gating-Strategie für T-Zell-Subpopulationen einschließlich doppelter Diskriminierung und Lebensfähigkeitsfärbung in murinem Perigonadalfett gezeigt. CD45-positive Leukozyten werden zuerst für CD4 und CD8 und anschließend für CD44- und CD62-Ligand enden, um zwischen naiven, zentralen Speicher-, Effektorspeicher- und Effektor-T-Zellen zu unterscheiden. CD44-positive Zellen werden dann weiter mit CD127, Killerzell-Lektin-ähnlichem Rezeptor G1 und programmiertem Tod-1 charakterisiert.Hier wird die Gating-Strategie zur Analyse von B-Zellen, Granulozyten, natürlichen Killerzellen, Makrophagen und dendritischen Zellen gezeigt. Ein höherer Prozentsatz von Effektorspeicher CD4-positive und CD8-positive Zellen können in fettreichen Diätmäusen nachgewiesen werden, die unter Nicht-SPF-Bedingungen untergebracht sind, während intrahepatische naive CD4-positive und CD8-positive T-Zellen bei diesen Tieren deutlich niedriger sind als SPF-Fett-Diätmäuse in Woche sieben. Schwere Steatose, einschließlich einer Zunahme von großen Lipidtröpfchen, die zu makrovesikulärer Steatose, lobularer Entzündung, hepatozellulärer Ballonung und zerstörter lobularer Struktur führen, findet sich in fettreichen, fettexponierten Mäusen, während nur einige SPF-Mäuse eine leichte Fettansammlung in der Leber zeigen.Darüber hinaus ist der Anteil der natürlichen Killerzellen im perigonadalen Fettgewebe von fettreichen, fettexponierten Mäusen höher, während fettreiche SPF-Mäuse höhere Anteile an dendritischen Zellen zeigten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellen auf Eis und im Dunkeln zu halten, sofern nicht anders angegeben. Sie sollten jetzt ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einzellige Suspensionen richtig vorbereiten und wie Maninadipose und Lebergewebe für Durchflusszytometrie-Experimente isoliert werden kann.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infektion: Ein Modell des Typ-2-Immunität und Entzündung im Darm

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Anwendung konsistenter massageähnlicher Störungen an Mauskälbern und Überwachung der daraus resultierenden intramuskulären Druckänderungen

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...