Name: an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

אנו מודים Anke Jurisch, דיאנה וולנר, ד ר קתרין וייט ו קורנליה השמאן לקבלת סיוע בהליכים ניסיוניים ובנימין Tiburzy מ Biolegend על הערות מועילות על אסטרטגיית העליה. י. ס. ס. הייתה נתמכת על ידי מענק הלמהולץ (ICEMED). מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהיחידה למחקר קליני של מכון ברלין לבריאות (BIH), "BCRT-גרנט" על ידי משרד החינוך הגרמני הפדרלי של המחקר וקרן איינשטיין. K.S.-בי. ו-H.-D.V. ממומנים על ידי FOR2165.

מחקר זה נעשה בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים של המוסדות הלאומיים לבריאות וחוק רווחה בעלי חיים תחת פיקוחו של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש. פרוטוקולי בעלי חיים נערכו על פי הנחיות אתיות מוסדיים של הCharité ברלין, גרמניה, ואושרו על-ידי מדינת לנדיסמט והגעה להנחיות הבאו...

<ol>
	<li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis.</a> BMC Public Health. 9, 88 (2009).</li><li>Prentki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+&#946;+cell+failure+in+type.">Islet &#946; cell failure in type.</a> J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).</li><li>Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+insulin+resistance.">Inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444, 840 (2006).</li><li>Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+immune+system+and+adipose+tissue+in+obesity.">Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+fat,+and+the+emergence+of+immunometabolism.">Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).</li><li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies.">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610 (2011).</li><li>Onodera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+induce+PPAR&#947;-high+FOXP3(+)+regulatory+T+cells.">Adipose tissue macrophages induce PPAR&#947;-high FOXP3(+) regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).</li><li>Calle, E. E., Kaaks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overweight,+obesity+and+cancer:+epidemiological+evidence+and+proposed+mechanisms.">Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).</li><li>Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Nonalcoholic+Steatohepatitis:+Eat,+Delete,+and+Inflame.">Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame.</a> Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice+by+normalizing+environment.">Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment.</a> Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).</li><li>Sbierski-Kind, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Housing+Conditions+Reveal+a+Major+Impact+of+Adaptive+Immunity+on+the+Course+of+Obesity-Induced+Type+2+Diabetes.">Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes.</a> Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).</li><li>Japp, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+immunology+assessed+by+multidimensional+mass+cytometry.">Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).</li><li>Benedict, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease:+An+expanded+review.">Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review.</a> World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Immunity,+and+Metabolic+Disease.">Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+Cells+in+Adipose+Tissue.">The Immune Cells in Adipose Tissue.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 15, 34-38 (2013).</li><li>Bertola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+expression+patterns+of+inflammatory+and+immune+response+genes+associated+with+obesity+and+NASH+in+morbidly+obese+patients.">Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients.</a> PloS One. 5 (10), e13577 (2010).</li><li>Turnbaugh, P. J., B&#228;ckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-Induced+Obesity+Is+Linked+to+Marked+but+Reversible+Alterations+in+the+Mouse+Distal+Gut+Microbiome.">Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome.</a> Cell Host &amp; Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).</li><li>Singh, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+diet+on+the+gut+microbiome+and+implications+for+human+health.">Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).</li><li>M&#252;ller, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+barrier+impairment+by+high-fat+diet+in+mice+depends+on+housing+conditions.">Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions.</a> Molecular Nutrition &amp; Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).</li></ol>

Steatohepatitis יש קשר חזק עם חריגות מטבולית כגון השמנה, עמידות לאינסולין ו דיסליפידמיה15. מחקרים מרובים מצביעים על כך דלקת ברקמת אדיפוז יכול לנהוג בפתוגנזה של סוכרת סוג 2, כולל רמות שונות של תאים הן של המערכת החיסונית מולדת מסתגלת4,5,16</sup...

השמנת יתר היא הפרעה רב עצרת וגורם סיכון מרכזי לפיתוח מחלות לב, שבץ, steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש), סוכרת סוג 2 (T2D) וכמה סוגים של סרטן. השכיחות של השמנת יתר הוא גדל במהירות ברחבי העולם. כיום, 2,100,000,000 אנשים – כמעט 30% מאוכלוסיית העולם-הם שמנים או שמנים1. השמנת יתר הקשורות לאינסולין יכול להוביל T2D, כאשר מותש תאי ביתא איון הלבלב לא לפצות על הצורך מוגבר לאינסולין כדי לשמור על הומאוסטזיס גלוקוז2.
רקמת אדיפוז מורכבת מסוגי תאים שונים, כולל אדיפוציטים, תאי אנדותל, פיברותקיעות ותאי החיסון. במהלך התקדמות של השמנת יתר, שינויים במספר והפעילות של תאים חיסוניים יכול להוביל דלקת בדרגה נמוכה של יפרטרופית אדיפוז3,4. באופן ספציפי, זה נמצא כי צריכת אנרגיה מוגזמת, מלווה ברמות גבוהות באופן כרוני של גלוקוז בדם, טריגליצרידים וחומצות שומן חינם, מוביל היפוקסיה adipocyte, המתח רשתית העין, לקויי תפקוד מיטוכונדריאלי ו הפרשת ציטוקין משופרת, וכתוצאה מכך הפעלת התאים החיסוניים הפרו-דלקתיים5,6. מחקר בעבר התמקד בעיקר בחסינות מולדת, אבל לאחרונה תאים חיסוניים גמישים (T ו-B תאים) התפתחה כרגולטורים חשובים של הומאוסטזיס גלוקוז. הם בעלי דלקתיות (כולל CD8+ T תאים, Th1, ו B תאים) או בעיקר פונקציות רגולטוריות (כולל הרגולציה T (treg) תאים, Th2 תאים) והוא יכול גם להחמיר או להגן מפני תנגודת לאינסולין7,8 , . בסדר, תשע
יתר על כן, מנגנונים מספר הוצעו כדי להסביר כיצד השמנת יתר מגדילה, כולל ייצור מוגבר של ציטוקינים על ידי האדיפוז רקמה10. נאש, הצורה המתקדמת של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי ונטל בריאות מרכזי במדינות מפותחות, הוא מאופיין באופן היסטולוגית על ידי הבלון בלונים, הצטברות ליפיד, פיברוזיס ודלקת לוצלתית ועשוי להתקדם ל שחמת, בסוף מחלת כבד שלב או סרטן hepatocellular. משטר מספר (למשל מתיונין ותזונה לקויה כולין11) ידועים לגרום נאש כמו מחלות כבד במודלים בעלי חיים לא אנושיים, אבל רוב הגישות הללו לא לכידה של התנאים האנושיים של נאש ואת מטבולית תוצאות כפי שהם דורשים הסתרה גנטית ספציפית, שאינם פיזיולוגיים מניפולציות תזונתיים או חוסר עמידות לאינסולין אופייני של האדם נאש. יתר על כן, ההבנה שלנו של המנגנונים הבסיסיים של מחלות מטבולית מבוססת כיום על ניסויים שבוצעו עם עכברי מעבדה שוכנו תחת תקן הפתוגן הספציפי ללא המחלה (SPF). מתקני מכשול אלה הם היגיינה באופן חריג לא לשקול את החיידקים מגוון בני אדם צריך להיתקל, אשר עשוי להסביר את הקשיים בתהליך התרגום של מחקרי בעלי חיים לגישות קליניות12,13 , . ארבע עשרה
כדי לחקור את ערכות המשנה של התא החיסונית השונים ברקמת השומן והכבד במהלך התפתחות עמידות לאינסולין ונאש במודל עכבר מתקדם לשחזר את התנאים האימונולוגיים אנושיים, עכברים שוכנו בכלובים בודדים בחצי סטרילי תנאים ללא מחסום. עכברים שוכנו תחת התנאים נחשף אנטיגן פיתחה נאש כמו הכבד פתולוגיה כבר אחרי 15 שבועות של דיאטה גבוהה שומן (HFD) האכלה13. בהשוואה לגיל המתאים עכברי SPF הם פיתחו stevesiרומטוזיס, חדירת הכבד הפעלה של תאים חיסוניים.
כתב יד זה מתאר זרימה חזקה cy, לנסות ניתוח להגדיר ולספור את תת הקבוצות של תאים החיסונית של רקמת שומן העכבר והכבד במודל של נאש. הניתוח הסייטונסה לזרום מאפשר זיהוי של פרמטרים מרובים של תאים בודדים בו בניגוד ל-RT-PCR או גישות אימונוהיסטוכימיה.
לסיכום, המחקר שלנו מציע מודל העכבר של HFD לטווח קצר עבור חקירת התפתחות עמידות לאינסולין ו נאש ואת המנגנונים הבסיסיים המוצגים גם נאמנות למצב האנושי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">100&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">26G x 5/8 needles&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">35mm Petri Dishes&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">40&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td style="width:169px;">GIBCO</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103127</td>
			<td>AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Analysis software&#160;</td>
			<td>FlowJo 10.0.8 software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">117309</td>
			<td>AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">138411</td>
			<td>AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse CD127 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135023</td>
			<td>AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">123131</td>
			<td>AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135219</td>
			<td>AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108739</td>
			<td>AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101239</td>
			<td>AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV711 anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103255</td>
			<td>AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV785 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100749</td>
			<td>AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:351px;">C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Forschungseinrichtungen f&#252;r experimentelle Medizin (FEM)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CaCl2&#160;</td>
			<td>Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td style="width:119px;">A119.1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Collagenase NB 4G Proved Grade&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SERVA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11427513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:351px;">Collagenase Typ I&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 15ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 50ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DNAse&#160;&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Filter 30&#181;m&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Celltrics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">400422316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FITC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100203</td>
			<td>AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD-LSR Fortessa&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Bioanalytic GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">085021-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">High-fat diet&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SSNIF</td>
			<td>E15741&#8211;34&#160;</td>
			<td>60 kJ% from fat, 19&#8201;kJ% from proteins, and 21&#8201;kJ% from carbohydrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">micro dissecting scissors&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S3146</td>
			<td>used for dissection purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE anti-mouse CD25 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101903</td>
			<td>AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">104417</td>
			<td>AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">107629</td>
			<td>AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td>AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Percoll solution&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103031</td>
			<td>AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108427</td>
			<td>AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Round-Bottom Tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:169px;">STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">38030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TruStain fcX anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101301</td>
			<td>AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">423105</td>
			<td>viablity stain&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes

השמנת יתר קשורה לדלקת כרונית בדרגה נמוכה ועמידות לאינסולין, לתרום לשכיחות הולכת וגוברת של מחלות מטבולית כרונית, כגון סוכרת סוג 2 ו steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש). מחקרים שאירעו לאחרונה הקימה כי תאי החיסון הפרו דלקתיים לחדור יפרטרופית שמנים רקמות והכבד. בהינתן החשיבות המתעוררים של תאים חיסוניים בהקשר של הומאוסטזיס מטבולית, יש צורך קריטי לכמת ולאפיין את השינוי שלהם במהלך התפתחות של סוכרת מסוג 2 ו נאש. עם זאת, מודלים בעלי חיים היגרמו לתכונות הפתותולוגיות האופייניות של האדם נאש הם דלילים.
במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את ערכות המשנה של תאים חיסוניים מבודדים מן הכבד ואת רקמת השומן במודל העכבר האמין של נאש, שהוקמה על ידי הדיור דיאטה גבוהה שומן (HFD) עכברים תחת לא ספציפי הפתוגן ללא מצבים (SPF) תנאים ללא מכשול למשך שבעה שבועות לפחות. אנו להדגים את הטיפול של עכברים בתנאים שאינם SPF, העיכול של רקמות וזיהוי של מקרופאגים, הרוצח הטבעי (NK) תאים, תאים דנדריטים, B ו-T קבוצות ממשנה של תאים על ידי הזרמת cy, לנסות. זרם מייצג cy, לנסות מגרשים מעכברי SPF HFD ועכברים שאינם SPF מסופקים. כדי להשיג נתונים אמינים ומתרגם, שימוש בנוגדנים, שיטות מדויקות ומדויקות לעיכול רקמות והמשך הניסויים הנכונים בזרימה cy, לנסות הם אלמנטים קריטיים.
ההתערבות כדי לשחזר את החשיפה אנטיגן פיזיולוגי בעכברים על ידי דיור אותם בתנאים שאינם SPF וחשיפה לא ספציפית אנטיגנים חיידקים יכול לספק כלי רלוונטי לחקירת הקשר בין שינויים אימונולוגיים, המושרה דיאטה השמנת יתר וסיבוכים הקשורים לטווח ארוך.

הפרוטוקול תיאר מאפשר את האפיון של סמנים פני השטח של תאים חיסוניים מולדים מסתגלת מבודדים מורטין perigonadal הרקמה והכבד במודל של המושרה דיאטה נאש. במודל זה, נאש המושרה על ידי מינהל של HFD פלוס סוכרוז (6%) במים לשתייה במשך 7 עד 15 שבועות בעכברים C57Bl/6J, כפי שדווח בעבר13. חשוב מכך, עכברים היו שו...

Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

דיאטה פשוטה ואמינה המושרה בעלי חיים מכרסם מודל עבור steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש) מתואר, מושגת באמצעות דיור ללא SPF של בעלי חיים וניהול של תזונה מסוימת גבוהה שומן. אנו מתארים זיהוי של תת הכבד והאדיפוז מערכות המשנה של תאים חיסוניים כדי ללכוד את התנאים האימונולוגיים אנושיים על ידי חשיפת עכברים חיידקים סביבתיים.

מודל Murine מתקדם לאגודה לדלקת כבד Nonatoin עם סוכרת מסוג 2

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום immunometabolism על תרומתם של תאים חיסוניים לדלקת הנגרמת על ידי השמנת יתר בשומן ו steatohepatitis ברקמת הכבד. טכניקות אלה כבר אופטימיזציה לבידוד של שומן ותאי החיסון הכבד במודל דיאטה המושרה של steatohepatitis nonalcoholic מושגת באמצעות דיור מכרסמים ללא פתוגן לא ספציפי. שיטות אלה יכולות לסייע להעמיק את הבנתנו את המנגנונים האימונולוגיים המעורבים בתחזוקת הונוסטזיס מטבולי.בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו למקסם את התשואה של תאים דיסוציאציה בת קיימא מבחינה תפקודית והגדרת gating הנכון בציטומטריה זרימה. כדי ליצור רקמת שומן מתלה חד-תאי, לרסס את החזה של עכבר המתת דם עם 70%אתנול, בזהירות לעשות חתך מרכזי חמישה עד שישה סנטימטרים דרך ההטנוזה וקיר הבטן לאורך כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל pleural ואת הלב. באמצעות מחט 26-מד, להזריק לפחות 10 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9% לתוך הגידור השמאלי, ולהשתמש מספריים כדי לפתוח את חלל צפדית.לאחר מכן, לנתח את רקמת השומן האפיגונדהאלית, ולשקול אותו. ניתוב מכני של רקמת השומן לחתיכות דקות בצלחת פטרי בארבע מעלות צלזיוס לפני העברת שברי הרקמה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. יש לשטוף את צלחת פטרי במיליליטר אחד של 0.5% אלבומין סרום בקר, או BSA, ב-PBS, ולהוסיף לצינור שלושה מיליליטר של רקמת שומן טרייה.לאחר 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סיבובים בדקה, הוסיפו 5 מיליליטר של 0.5% BSA ב-PBS, וה מניחים את תקציר הפתיל על קרח. יש לאתר את הפתרון מספר פעמים באמצעות פיפט סרולוגי של 10 מיליליטר, ולהשתמש בבוכנה כדי להעביר את הפתרון דרך מסננת של 100 מיקרומטר. להפריד את שברי הרקמה על ידי צנטריפוגה, ולהשתמש פיפטה כדי להשליך את שבר adipocyte צף.תן מחדש את גלולת תא שבר כלי הדם סטרומה במיליליטר אחד של אמוניום-כלוריד-אשלגן, או ACK, חיץ תזה, לעצור את תגובת ת ליסיס עם 10 מיליליטר של 2% נסיוב עגל עוברי, או FCS, ב PBS לאחר כמה שניות. לאחר מכן, לאסוף את תאי הדם הלבנים מבודדים על ידי צנטריפוגה, ו resuspend גלולה ב 250 microliters של 2% FCS ב PBS לספירה. לקצור את הכבד לתוך צינור חרוט של PBS על קרח לפני השימוש בולים מזרק כדי לנטרל מכנית את הרקמה בצלחת פטרי בארבע מעלות צלזיוס.מעבירים את שברי רקמת הכבד המנותח לצינור 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של תקציר כבד חם, ושטיפת צלחת פטרי עם שלושה מיליליטר של פתרון עיכול כבד טרי. לאחר 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סיבובים לדקה, לעצור את העיכול עם 20 מיליליטר של HBSS, ו triturate תרחיף הרקמה מספר פעמים עם פיפט סרולוגי 10 מיליליטר. השתמש בוכנה כדי להעביר את פתרון הרקמה דרך מסננת 100 מיקרומטר, ולאסוף את תאי הכבד על ידי צנטריפוגה.תן שימוש חוזר את גלולה ב 20 מיליליטר של HBSS טרי, ולהסיר את מטריצת hepatocyte על ידי צנטריפוגה. לאסוף את supernatant עבור צנטריפוגה, resuspending את גלולה ב 10 מיליליטר של 33% צפיפות צמיגות נמוכה פתרון בינוני שיפוע ב- HBSS. להפריד את תאי החיסון בכבד על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות, ו resuspend גלולת לויקוציט במיליליטר אחד של חיץ תמוגה ACK.לאחר ארבע דקות בטמפרטורת החדר, לעצור את תמוגה עם 10 מיליליטר של HBSS, ולסנן את התאים דרך מסננת נקבובית 30 מיקרומטר לתוך צינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולה ב 250 microliters של 2%FCS ב PBS לספירה. לניתוח ציטומטרי זרימה של אוכלוסיות לויקוציט מבודדות, להוסיף עד שלוש פעמים 10 לשישה תאים ב 100 microliters של 2%FCS ב PBS מן הרקמה של עניין לתוך מיון תאים בודדים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות פוליסטירן, או FACS, צינורות.הוסף 10 microliters של נוגדן נגד CD16/CD32 לכל צינור כדי לחסום כל כריכה לא ספציפית במשך 10 דקות על קרח, ואחריו כתמים עם הנפח המתאים של תערובת נוגדנים מיקרוליטר אחד של צבע הכדאיות לכל מדגם כדי לאפשר אפליה חיה ומתה של תאים. לאחר 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגנות מפני אור, לשטוף את הדגימות פעמיים עם שני מיליליטר של 2% FCS בתוספת PBS לשטוף, וצנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולה PBS טרי בתוספת FCS.כדי לנתח את התאים לפי ציטומטריית זרימה, השתמש בדגימת בקרה שלילית לא מזוהמת כדי להגדיר את פיזור קדימה וצד, ולהתאים את המתחים של ציטומטר הזרימה כדי לזהות את אוכלוסיית לויקוציט קיימא ולא לכלול את הפסולת. לאחר מכן, הפעל דגימות בקרה מוכתמות בודדות לפיצוי צבעוני לפני הפעלת הדגימות הניסיוניות, איסוף לפחות חמש פעמים 10 לארבעת האירועים לכל צינור. לאחר מכן, לייצא את קבצי הנתונים FCS לניתוח, ולהגדיר את אסטרטגיית gating עבור לויוציטים חיוביים CD45 כדי לאפשר זיהוי של אוכלוסיות תא החיסון הבאים של עניין.כאן, מוצגת אסטרטגיית גת מייצגת עבור תת-תפוסות של תאי T, כולל אפליה כפולה וכתמי כדאיות בשומן פריגונאדל מורין. לוקוציטים חיוביים ל-CD45 מגודרים תחילה עבור CD4 ו- CD8 ולאחר מכן עבור ליגנד CD44 ו- CD62 כדי להפלות בין תאים נאיביים, זיכרון מרכזי, זיכרון אפקטר ותאי T של אפקט. תאים חיוביים CD44 מאופיינים עוד יותר עם CD127, תא רוצח כמו Lectin קולטן G1, ומוות מתוכנת-1.כאן מוצגת אסטרטגיית הגט לניתוח תאי B, גרנולוציטים, תאים קטלניים טבעיים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים. אחוז גבוה יותר של תאים חיוביים CD4-חיובי ו-CD8 זיכרון אפקטים חיוביים ניתן לזהות בעכברים דיאטה עתירת שומן שוכנים בתנאים שאינם SPF, ואילו תאי CD4 חיובי ו- CD8 חיוביים INTRAHEPATIC נמצאים נמוכים משמעותית בבעלי חיים אלה בהשוואה לעכברי דיאטה עתירי שומן SPF בשבוע השביעי. סטאטוזיס חמור, כולל עלייה של טיפות שומנים גדולים וכתוצאה מכך סיטטוזיס מקרו-וסקולרי, דלקת lobular, בלון hepatocellular, ומבנה lobular נהרס נמצא בעכברים חשופים דיאטה עתירת שומן בעוד רק כמה עכברי SPF להציג הצטברות שומן קלה בכבד.בנוסף, אחוז התאים הרוצח הטבעי גבוה יותר ברקמת השומן perigonadal של עכברים חשופים דיאטה עתירת שומן, ואילו עכברי SPF דיאטה עתירת שומן הפגינו אחוזים גבוהים יותר של תאים דנדריטיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשמור את התאים על קרח ובחושך אלא אם צוין אחרת. עכשיו אתה צריך הבנה טובה של איך להכין כראוי מתלים חד-תאיים וכיצד לבודד שומן מורין ורקמות הכבד לניסויים ציטומטריה זרימה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

יישום של רטבאליות העיסוי העקבי של העכבר וניטור השינויים הנובעים בלחץ שרירי

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...