Name: an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

Ringraziamo anke Giuch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte e Cornelia Heckmann per l'assistenza con le procedure sperimentali e Benjamin Tiburzy di Biolegend per commenti utili sulla strategia di gating. La JS è stata sostenuta dall'Helmholtz Grant (ICEMED). Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dall'unità di ricerca clinica del Berlin Institute of Health (BIH), il "BCRT-Grant" dal Ministero federale tedesco per l'istruzione e la ricerca e la Fondazione Einstein. K.S.-B. e H.-D.V. sono finanziati da FOR2165.

Questo studio è stato effettuato in conformità con la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli istituti nazionali di sanità e della legge sul benessere degli animali sotto la supervisione del nostro Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. I protocolli animali sono stati condotti secondo le linee guida etiche istituzionali della Charité Berlin, Germania, e sono stati approvati dal Landesamt für Gesundheit und Soziales e sono conformi alle linee guida di arrivo.
<p class="jove...

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La steatoepatite ha una forte associazione con anomalie metaboliche come l'obesità, l'insulino-resistenza e la dislipidemia15. Studi multipli indicano che l'infiammazione del tessuto adiposo può guidare la patogenesi del diabete di tipo 2, compresi i livelli alterati di cellule del sistema immunitario innato e adattivo4,5,16,17 . Inoltre, è stato trovato che l'obesit?...

L'obesità è un disturbo multifattoriale e un importante fattore di rischio per lo sviluppo di malattie cardiache, ictus, steatoepatite non alcolica (NASH), diabete di tipo 2 (T2D) e alcuni tipi di cancro. La prevalenza dell'obesità è in rapida crescita a livello globale. Oggi, 2,1 miliardi persone — quasi il 30% della popolazione mondiale — sono obesi o sovrappeso1. La resistenza all'insulina associata all'obesità può portare a T2D, quando le cellule beta dell'isolotto pancreatica esaurite non riescono a compensare l'aumentata necessità di insulina per mantenere l'omeostasi del glucosio2.
Tessuto adiposo è composto da vari tipi di cellule tra cui adipociti, cellule endoteliali, fibroblasti e cellule immunitarie. Durante la progressione dell'obesità, i cambiamenti nel numero e nell'attività delle cellule immunitarie possono portare a un'infiammazione di basso grado del tessuto adiposo ipertrofico3,4. In particolare, è stato riscontrato che l'eccessiva assunzione di energia, accompagnata da livelli cronicamente elevati di glucosio nel sangue, trigliceridi e acidi grassi liberi, porta ad ipossia adipociti, stress del reticolo endoplasmatico, compromissione della funzione mitocondriale e secrezione di citochine potenziata, con conseguente attivazione di cellule immunitarie adiposo pro-infiammatorie5,6. La ricerca passata si è concentrata principalmente sull'immunità innata, ma più recentemente le cellule immunitarie adattative (cellule T e B) sono emerse come importanti regolatori dell'omeostasi del glucosio. Possiedono cellule infiammatorie (tra cui CD8+ t, Th1 e B) o principalmente funzioni regolatorie (comprese le cellule t (Treg) regolatorie, cellule Th2) e possono sia esacerbare che proteggere contro l'insulino-resistenza7,8 , 9. il
Inoltre, sono stati proposti diversi meccanismi per spiegare come l'obesità aumenti la steatoepatite, inclusa l'aumento della produzione di citochines da parte del tessuto adiposo10. NASH, la forma progressiva di malattia epatica grassa non alcolica e un importante onere sanitario nei paesi sviluppati, è istologicamente caratterizzata da epatociti con pallino, accumulo lipidico, fibrosi e infiammazione pericellulare e può progredire verso malattia epatica in stadio terminale o carcinoma epatocellulare. Diversi regimi (ad esempio la metionina e la dieta carente di colina11) sono noti per indurre la patologia epatica simile a Nash in modelli animali non umani, ma la maggior parte di questi approcci non ricapitolano le condizioni umane di Nash e il suo metabolismo metabolico conseguenze in quanto richiedono un gene knockout specifico, manipolazioni dietetiche non fisiologiche o mancanza di insulino-resistenza tipica della NASH umana. Inoltre, la nostra comprensione dei meccanismi di base delle malattie metaboliche è attualmente basata su esperimenti condotti con topi di laboratorio alloggiati in condizioni specifiche esenti da patogeno (SPF) standard. Tali strutture di barriera sono anormalmente igieniche e non considerano la diversità microbica che gli esseri umani devono incontrare, il che può tenere conto delle difficoltà nel processo di traduzione degli studi sugli animali agli approcci clinici12,13 , ( 14).
Per indagare i diversi sottogruppi di cellule immunitarie nel tessuto adiposo e nel fegato durante lo sviluppo di resistenza all'insulina e NASH in un modello di topo avanzato che riproduce le condizioni immunologiche umane, i topi sono stati alloggiati in singole gabbie in semi sterili condizioni senza barriere. I topi alloggiati in condizioni di antigene esposto hanno sviluppato una patologia epatica simile a NASH già dopo 15 settimane di alimentazione ad alto contenuto di grassi (HFD)13. Rispetto ai topi SPF abbinati all'età hanno sviluppato steatosi macrovesicolare, infiltrazione epatica e attivazione delle cellule immunitarie.
Questo manoscritto descrive una solida analisi della citometria a flusso per definire e contare i sottogruppi delle cellule immunitarie dal tessuto adiposo del topo e dal fegato in un modello di NASH. L'analisi della citometria a flusso consente il rilevamento simultaneo di più parametri di singole cellule in contrasto con gli approcci RT-PCR o immunoistochimica.
In sintesi, il nostro studio offre un modello di topo di HFD a breve termine per indagare lo sviluppo di insulino-resistenza e NASH e i meccanismi di base che mostra anche la fedeltà alla condizione umana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">100&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">26G x 5/8 needles&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">35mm Petri Dishes&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">40&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td style="width:169px;">GIBCO</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103127</td>
			<td>AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Analysis software&#160;</td>
			<td>FlowJo 10.0.8 software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">117309</td>
			<td>AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">138411</td>
			<td>AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse CD127 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135023</td>
			<td>AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">123131</td>
			<td>AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135219</td>
			<td>AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108739</td>
			<td>AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101239</td>
			<td>AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV711 anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103255</td>
			<td>AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV785 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100749</td>
			<td>AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:351px;">C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Forschungseinrichtungen f&#252;r experimentelle Medizin (FEM)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CaCl2&#160;</td>
			<td>Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td style="width:119px;">A119.1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Collagenase NB 4G Proved Grade&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SERVA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11427513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:351px;">Collagenase Typ I&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 15ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 50ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DNAse&#160;&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Filter 30&#181;m&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Celltrics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">400422316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FITC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100203</td>
			<td>AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD-LSR Fortessa&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Bioanalytic GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">085021-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">High-fat diet&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SSNIF</td>
			<td>E15741&#8211;34&#160;</td>
			<td>60 kJ% from fat, 19&#8201;kJ% from proteins, and 21&#8201;kJ% from carbohydrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">micro dissecting scissors&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S3146</td>
			<td>used for dissection purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE anti-mouse CD25 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101903</td>
			<td>AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">104417</td>
			<td>AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">107629</td>
			<td>AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td>AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Percoll solution&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103031</td>
			<td>AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108427</td>
			<td>AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Round-Bottom Tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:169px;">STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">38030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TruStain fcX anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101301</td>
			<td>AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">423105</td>
			<td>viablity stain&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes

L'obesità è associata a infiammazione cronica di basso grado e resistenza all'insulina, contribuendo ad una crescente prevalenza di malattie metaboliche croniche, come il diabete di tipo 2 e la steatoepatite non alcolica (NASH). Recenti ricerche hanno stabilito che le cellule immunitarie pro-infiammatorie infiltrano obesi tessuto adiposo ipertrofico e fegato. Data l'importanza emergente delle cellule immunitarie nel contesto dell'omeostasi metabolica, vi è la necessità critica di quantificare e caratterizzare la loro modificazione durante lo sviluppo del diabete di tipo 2 e NASH. Tuttavia, i modelli animali che inducono caratteristiche patofisiologiche tipiche della NASH umana sono scarsi.
In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per identificare i sottogruppi di cellule immunitarie isolati dal fegato e dal tessuto adiposo in un modello di topo affidabile di NASH, stabilito da topi con dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) in condizioni non specifiche prive di patogeno (SPF) senza barriera per almeno sette settimane. Dimostriamo la manipolazione dei topi in condizioni non-SPF, la digestione dei tessuti e l'identificazione dei macrofagi, delle cellule Natural Killer (NK), delle cellule dendritiche, dei sottogruppi di cellule B e T mediante citometria a flusso. Sono forniti diagrammi di citometria a flusso rappresentativo da topi HFD SPF e topi non SPF. Per ottenere dati affidabili e interpretabili, l'uso di anticorpi, metodi precisi e precisi per la digestione dei tessuti e la corretta gating negli esperimenti di citometria a flusso sono elementi critici.
L'intervento per ripristinare l'esposizione fisiologica di antigene nei topi che li ospita in condizioni non-SPF e l'esposizione non specifica agli antigeni microbici potrebbe fornire uno strumento pertinente per indagare il legame tra alterazioni immunologiche, l'obesità e le correlate complicazioni a lungo termine.

Il protocollo descritto consente la caratterizzazione di marcatori superficiali di cellule immunitarie innate e adattative isolate dal tessuto adiposo perigonadica murina e dal fegato in un modello di NASH indotto dalla dieta. In questo modello, NASH è stato indotto dalla somministrazione di HFD più saccarosio (6%) in acqua potabile per 7 a 15 settimane in topi topi C57BL/6J, come precedentemente riportato13. È importante sottolineare che i topi sono stati alloggiati in condizioni semi sterili ...

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An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

È descritto un semplice e affidabile modello animale di roditore indotto dalla dieta per la steatoepatite non alcolica (NASH), ottenuto attraverso l'alloggiamento non SPF degli animali e la somministrazione di una dieta specifica ad alto contenuto di grassi. Descriviamo l'identificazione di sottoinsiemi di cellule immunitarie epatiche e adiposo per ricapitolare le condizioni immunologiche umane esponendo i topi ai germi ambientali.

Un modello avanzato di murine per la steatoepatite non alcolica in associazione con il diabete di tipo 2

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande nel campo dell'immunometabolismo sul contributo delle cellule immunitarie all'infiammazione indotta dall'obesità nell'adiposo e nella steatoepatite nel tessuto epatico. Queste tecniche sono state ottimizzate per l'isolamento delle cellule immunitarie adipose ed epatiche in un modello indotto dalla dieta di steatoepatite analcolica ottenuta attraverso un alloggiamento non specifico dei roditori privo di agenti patogeni. Questi metodi possono aiutare ad approfondire la nostra comprensione dei meccanismi immunologici coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi metabolica.Generalmente, gli individui nuovi a questa tecnica faranno fatica a massimizzare la resa delle cellule dissociate funzionalmente vitali e a impostare la corretta ghiandolazione nella citometria del flusso. Per generare una sospensione monoscicolare del tessuto adiposo, spruzzare il torace di un topo eutanasiato con il 70% di etanolo e fare con cura un'incisione centrale da cinque a sei centimetri attraverso il tegumento e la parete addominale lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica e il cuore. Utilizzando un ago calibro 26, iniettare almeno 10 millilitri di soluzione salina allo 0,9% nell'apice del ventricolo sinistro e utilizzare le forbici per aprire la cavità peritoneale.Quindi, sezionare il tessuto adiposo epigonadale e pesarlo. Dissociare meccanicamente il tessuto adiposo in pezzi fini in una piastra di Petri a quattro gradi Celsius prima di trasferire i frammenti di tessuto in un tubo conico da 50 millilitri. Sciacquare la piastra di Petri con un millilitro dello 0,5% di albumina siere bovina, o BSA, in PBS, e aggiungere tre millilitri di soluzione di digestione dei tessuti adiposi appena preparata per grammo di tessuto adiposo al tubo.Dopo 20 minuti a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto, aggiungere cinque millilitri dello 0,5%BSA in PBS e posizionare il digest adiposo sul ghiaccio. Triturare la soluzione più volte con una pipetta sierologica da 10 millilitri e utilizzare uno stantuffo per passare la soluzione attraverso un colino da 100 micrometri. Separare le frazioni tissutali per centrifugazione e utilizzare una pipetta per scartare la frazione adipocite galleggiante.Rimescolare il pellet cellulare della frazione vascolare stromale in un millilitro di ammonio-cloruro-potassio, o ACK, tampone dilisi, fermando la reazione dilisi con 10 millilitri di siero di vitello fetale al 2%, o FCS, in PBS dopo pochi secondi. Quindi, raccogliere i globuli bianchi isolati per centrifugazione e rimosogliere il pellet in 250 microlitri del 2%FCS in PBS per il conteggio. Raccogliere il fegato in un tubo conico di PBS sul ghiaccio prima di usare i timbri delle siringhe per dissociare meccanicamente il tessuto in una piastra di Petri a quattro gradi Celsius.Trasferire i frammenti di tessuto epatico sezionati in un tubo da 50 millilitri contenente 10 millilitri di soluzione calda di digestione del fegato e sciacquare la piastra di Petri con tre millilitri di soluzione di digestione del fegato fresco. Dopo 20 minuti a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto, interrompere la digestione con 20 millilitri di HBSS e triturare il liquame tissutale più volte con una pipetta sierologica da 10 millilitri. Utilizzare uno stantuffo per passare la soluzione tissutale attraverso un colino di 100 micrometri e raccogliere le cellule del fegato mediante centrifugazione.Rimorsi il pellet in 20 millilitri di HBSS fresco e rimuovere la matrice di epatociti mediante centrifugazione. Raccogliere il supernatante per la centrifugazione, rimescolando il pellet in 10 millilitri di soluzione media gradiente di densità di viscosità bassa del 33% in HBSS. Separare le cellule immunitarie del fegato per centrifugazione gradiente di densità e rimescolare il pellet di leucocitario in un millilitro del tampone di lisi ACK.Dopo quattro minuti a temperatura ambiente, interrompere lalisi con 10 millilitri di HBSS e filtrare le cellule attraverso un colino poro di 30 micrometri in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione. Quindi, rimospensì il pellet in 250 microlitri del 2%FCS in PBS per il conteggio. Per l'analisi citometrica del flusso delle popolazioni isolate di leucociti, aggiungere fino a tre volte 10 alle sei cellule in 100 microlitri del 2%FCS in PBS dal tessuto di interesse in singoli tubi di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza in polistirolo, o FACS.Aggiungere 10 microlitri di anticorpo anti-CD16/CD32 a ciascun tubo per bloccare qualsiasi legame non specifico per 10 minuti sul ghiaccio, seguito dalla colorazione con il volume appropriato di miscela di anticorpi e da un microlitro di colorante di vitalità per campione per consentire la discriminazione delle cellule vive e morte. Dopo 20 minuti a quattro gradi Celsius protetti dalla luce, lavare i campioni due volte con due millilitri di 2%FCS più PBS per lavaggio e centrifugare a 300 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, resuspend il pellet in PBS fresco più FCS.Per analizzare le cellule per citometria di flusso, utilizzare un campione di controllo negativo non macchiato per impostare la dispersione avanti e laterale e regolare le tensioni del citometro di flusso per rilevare la popolazione di leucociti vitale ed escludere i detriti. Successivamente, eseguire singoli campioni di controllo macchiati per la compensazione multicolore prima di eseguire i campioni sperimentali, raccogliendo almeno cinque volte 10 ai quattro eventi per tubo. Quindi, esportare i file di dati FCS per l'analisi e impostare la strategia di gating per i leucociti positivi al CD45 per consentire l'identificazione delle successive popolazioni di cellule immunitarie di interesse.Qui viene mostrata una strategia rappresentativa di gating per le sottopopolazioni di cellule T, tra cui la discriminazione del doppietto e la colorazione della vitalità nel grasso perigonadale murino. I leucociti positivi ai CD45 vengono prima gated per CD4 e CD8 e successivamente per il ligando CD44 e CD62 per discriminare tra ingenua memoria centrale, memoria effettore e cellule T dell'effettore. Le cellule cd44-positive sono quindi ulteriormente caratterizzate con CD127, recettore killer simile alla lettalina a cellule G1 e morte programmata-1.Qui viene mostrata la strategia di gating per l'analisi di cellule B, granulociti, cellule killer naturali, macrofagi e cellule dendritiche. Una percentuale più elevata di cellule CD4-positive e CD8-positive della memoria effettore può essere rilevata in topi dietetici ad alto contenuto di grassi ospitati in condizioni non SPF, mentre le cellule T ingenue intraepatiche CD4-positive e CD8-positive sono considerevolmente più basse in questi animali rispetto ai topi dietetici ad alto contenuto di grassi SPF alla settima settimana. Steatosi grave, tra cui un aumento di grandi goccioline lipidiche con conseguente steatosi macrovesicolare, infiammazione lobulare, palloncino epatocellulare e struttura lobulare distrutta si trova nella dieta ricca di grassi topi esposti mentre solo alcuni topi SPF mostrano un lieve accumulo di grasso nel fegato.Inoltre, la percentuale di cellule killer naturali è più alta nel tessuto adiposo perigonadale dei topi esposti alla dieta ad alto contenuto di grassi, mentre i topi SPF a dieta ad alto contenuto di grassi hanno dimostrato percentuali più elevate di cellule dendritiche. Quando si tenta questa procedura, è importante mantenere le cellule sul ghiaccio e al buio se non diversamente indicato. Ora dovresti avere una buona comprensione di come preparare correttamente le sospensioni uni-cellule e come isolare l'adiposo murino e il tessuto epatico per gli esperimenti di citometria a flusso.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris Muris Infezione: un modello di tipo 2 Immunità e infiammazione nell&#39;intestino

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

L&#39;uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

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As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

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To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

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L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Applicazione di perturbazioni costanti simili a massaggi sui vitelli per topi e monitoraggio dei conseguenti cambiamenti di pressione intramuscolare

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Generazione ad alta efficienza di cellule T Topo primario specifico dell'antigene per test funzionali in un modello di diabete autoimmune

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...