Name: an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

学 Jurisch、ダイアナ Woellner、キャスリンウィッテとコーネリア・ヘックマンは、ゲーティング戦略に関する有用なコメントを Tiburzy からの実験的な手順とベンジャミン・ Biolegend の支援のために感謝しています。J.S. は、ヘルムホルツ許可 (ICEMED) によって支持されました。この研究は、ベルリン健康研究所 (ボスニア・ヘルツェゴビナ)、ドイツ連邦教育研究省とアインシュタイン財団の「BCRT」の臨床研究ユニットからの助成金によって支援されました。K.S.-B.そして、h. D.V. は FOR2165 によって賄われています。

本研究は、当社の動物愛護・使用委員会の監督下において、国立衛生研究所および動物福祉法の実験動物の診療及び使用に関するガイドに従って実施した。動物のプロトコルは、ドイツのシャリテベルリンの制度的倫理ガイドラインに従って行われ、Landesamt für Gesundheit と Soziales によって承認され、到着ガイドラインに準拠していました。
1. 脂肪性肝炎のダイエット誘発?...

<ol>
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脂肪性肝炎は、肥満、インスリン抵抗性および脂質異常症15などの代謝異常との強い関連を有する。複数の研究は、脂肪組織の炎症は、先天性および適応免疫系の両方の細胞の変化したレベルを含む2型糖尿病の病因を駆動することができることを示しています4,5,16,17.さらに、肥...

肥満は多因子性障害であり、心臓疾患、脳卒中、非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH)、2型糖尿病 (T2D) およびある種の癌を発症する主要な危険因子である。肥満の罹患率は急速に世界的に増加している。今日では、世界の人口の約 30% に21億人が肥満または太り気味の1です。肥満関連インスリン抵抗性は、T2D につながる可能性があり、枯渇した膵島ベータ細胞がグルコースホメオスタシス2を維持するためにインスリンの必要性の増大を補うのに失敗する。
脂肪組織は、脂肪細胞を含む様々な細胞タイプ、内皮細胞、線維芽細胞および免疫セルから構成される。肥満の進行中に、免疫細胞の数および活性の変化は、肥厚性脂肪組織の低悪性度の炎症をもたらす可能性があります3,4.具体的には、過剰なエネルギー摂取が、慢性的に上昇した血糖値、トリグリセリドおよび遊離脂肪酸を伴うことが、脂肪細胞低酸素症、小胞体ストレス、ミトコンドリア機能障害をもたらす、サイトカイン分泌の亢進は、炎症性脂肪免疫細胞5,6の活性化をもたらす。これまでの研究は自然免疫に着目してきましたが、最近では適応免疫細胞 (T 細胞、B 菌) がグルコース恒常性の重要な調節因子として浮上しています。それらは、炎症性 (CD8+ T 細胞、Th1、および B 細胞を含む) または主に調節機能 (調節 T (Treg) 細胞、Th2 細胞を含む) を有し、そしてインスリン抵抗性7、8に対して両方を増悪または保護することができる,9.
さらに、脂肪組織10によるサイトカインの産生増加を含めた肥満が脂肪肝炎を増加させる方法を説明するためのいくつかのメカニズムが提案された。NASH は、先進国における非アルコール性脂肪肝疾患と主要な健康負担の進行性形態であり、組織学的にはバルーン化された肝細胞、脂質蓄積、線維症および pericellular 炎症を特徴とし、進行肝硬変、末期肝疾患または肝細胞癌。いくつかのレジメン (例えばメチオニンおよびコリン欠乏性食餌11) は、非ヒト動物モデルにおいて NASH 様肝病理を誘発することが知られているが、これらのアプローチのほとんどは、nash 及びその代謝のヒト状態を不在しない結果は、それらが特定の遺伝子ノックアウト、非生理的食物操作を必要とするか、またはヒト NASH の典型的なインスリン抵抗性を欠いている。さらに、代謝性疾患の根底にあるメカニズムに関する我々の理解は、現在、標準特定病原体フリー (SPF) 条件下に収容された実験室マウスで行われる実験に基づいている。これらのバリア施設は異常に衛生的であり、人間が遭遇しなければならない微生物の多様性を考慮していないため、動物実験の翻訳プロセスが困難である可能性がある。臨床アプローチ12,13,14です。
ヒトの免疫学的状態を再現する高度なマウスモデルにおけるインスリン抵抗性および NASH の発症中の脂肪組織および肝臓における異なる免疫細胞サブセットを調査するために、マウスを半無菌で個々のケージに収容した障壁のない条件。抗原暴露状態の下に収容されたマウスは、既に15週目の高脂肪食 (HFD) 摂食13の後に NASH 様肝病理を発症した。年齢に一致した SPF マウスと比較して、彼らは macrovesicular 脂肪症、肝浸潤および免疫細胞の活性化を開発しました。
本稿では、マウスの脂肪組織と肝臓からの免疫細胞サブセットを NASH のモデルとして定義・カウントする、頑健なフローサイトメトリー解析について述べる。フローサイトメトリー解析により、RT-PCR または免疫組織化学アプローチとは対照的に、個々の細胞の複数のパラメータを同時に検出することができます。
要約すると、我々の研究は、インスリン抵抗性および NASH の発症を調査するための短期 HFD のマウスモデルと、人間の状態に対しても忠実さを示す基礎的なメカニズムを提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">100&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">26G x 5/8 needles&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">35mm Petri Dishes&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">40&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td style="width:169px;">GIBCO</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103127</td>
			<td>AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Analysis software&#160;</td>
			<td>FlowJo 10.0.8 software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">117309</td>
			<td>AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">138411</td>
			<td>AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse CD127 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135023</td>
			<td>AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">123131</td>
			<td>AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135219</td>
			<td>AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108739</td>
			<td>AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101239</td>
			<td>AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV711 anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103255</td>
			<td>AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV785 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100749</td>
			<td>AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:351px;">C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Forschungseinrichtungen f&#252;r experimentelle Medizin (FEM)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CaCl2&#160;</td>
			<td>Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td style="width:119px;">A119.1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Collagenase NB 4G Proved Grade&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SERVA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11427513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:351px;">Collagenase Typ I&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 15ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 50ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DNAse&#160;&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Filter 30&#181;m&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Celltrics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">400422316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FITC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100203</td>
			<td>AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD-LSR Fortessa&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Bioanalytic GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">085021-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">High-fat diet&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SSNIF</td>
			<td>E15741&#8211;34&#160;</td>
			<td>60 kJ% from fat, 19&#8201;kJ% from proteins, and 21&#8201;kJ% from carbohydrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">micro dissecting scissors&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S3146</td>
			<td>used for dissection purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE anti-mouse CD25 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101903</td>
			<td>AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">104417</td>
			<td>AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">107629</td>
			<td>AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td>AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Percoll solution&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103031</td>
			<td>AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108427</td>
			<td>AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Round-Bottom Tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:169px;">STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">38030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TruStain fcX anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101301</td>
			<td>AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">423105</td>
			<td>viablity stain&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes

肥満は、慢性的な低品位の炎症およびインスリン抵抗性と関連しており、2型糖尿病および非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) などの慢性代謝性疾患の罹患率の増加に寄与している。最近の研究では、炎症性免疫細胞が肥満の肥大脂肪組織と肝臓に潜入することを確立しています。代謝恒常性の文脈における免疫細胞の重要性の出現を考えると、2型糖尿病と NASH の発症中にそれらの修飾を定量化し、特徴付けることが重要な必要性がある。しかしながら、ヒト NASH の典型である病態生理学的特徴を誘導する動物モデルはまばらである。
本稿では、非特異的病原体を含まない (HFD) マウスによって確立された NASH の信頼できるマウスモデルにおける肝臓および脂肪組織から分離された免疫細胞サブセットを同定するための詳細なプロトコルを提供する。少なくとも7週間の障壁.我々は、非 SPF 条件でのマウスの取扱い、組織の消化およびマクロファージ、ナチュラルキラー (NK) 細胞、樹状細胞、B および T 細胞サブセットの同定をフローサイトメトリーによって示す。SPF HFD マウスおよび非 SPF マウスからの代表的なフローサイトメトリープロットが提供される。信頼性が高く解釈されたデータを得るためには、抗体の使用、組織消化のための正確かつ正確な方法、およびフローサイトメトリーの実験における適切なゲーティングが不可欠です。
非 SPF 条件でそれらを収容することによって、マウスにおける生理的抗原曝露を回復するための介入および微生物抗原への非特異的暴露は、免疫学的変化の間のリンクを調査するための関連したツールを提供することができ、食餌誘発肥満および関連する長期合併症。

記載されているプロトコルにより、食餌誘導 NASH のモデルにおいてマウス perigonadal 脂肪組織と肝臓から分離した先天性および適応免疫細胞の表面マーカーの特徴付けが可能になる。このモデルでは、HFD の投与によって NASH が誘導されたが、スクロース (6%)C57Bl/6J マウスにおいて7〜15週間の飲用水において、以前に報告されたように13.重要なことに、マウスは半無菌状態で収...

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An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) に対する簡便で信頼性の高い食餌誘発げっ歯類動物モデルについては、特定の高脂肪食の動物及び投与の SPF 以外の住居を通じて達成される。我々は、マウスを環境細菌に曝露することにより、ヒトの免疫学的状態を不在するための肝および脂肪免疫細胞サブセットの同定について述べる。

2型糖尿病と関連した非アルコール性脂肪性肝炎のための高度なマウスモデル

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

この方法は、脂肪および肝組織における脂肪肝炎における肥満誘発性炎症への免疫細胞の寄与に関する免疫代謝分野の質問に答える助けとなる。これらの技術は、非特異的な病原体を含まないげっ歯類ハウジングを通じて達成された非アルコール性脂肪性肝炎の食事誘発モデルにおける脂肪および肝性免疫細胞の単離のために最適化されている。これらの方法は、代謝性恒常性の維持に関与する免疫学的メカニズムの理解を深めるのに役立ちます。一般的に、この技術に新しい個人は、機能的に生存可能な解離細胞の収率を最大化し、フローサイトメトリーで適切な格子を設定することに苦労します。脂肪組織単細胞懸濁液を生成するには、安楽死させたマウスの胸部に70%エタノールをスプレーし、胸膜ケージの全長に沿って内面および腹壁を通して5〜6センチメートルの中央切開を慎重に行い、胸膜腔および心臓を露出させる。26ゲージの針を使用して、0.9%生理食塩水の少なくとも10ミリリットルを左心室の頂点に注入し、はさみを使用して腹腔を開きます。次いで、エピゴナダル脂肪組織を解剖し、それを秤量する。脂肪組織を摂氏4度のペトリ皿の中の細かい部分に機械的に解化してから、組織断片を50ミリリットルの円錐形チューブに移す。PBSで0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)の1ミリリットルでペトリ皿をリンスし、脂肪組織の1グラム当たり3ミリリットルの新しく調製した脂肪組織消化液をチューブに加えます。摂氏37度で20分、毎分200回転した後、PBSに0.5%BSAの5ミリリットルを加え、脂肪消化を氷の上に置きます。溶液を10ミリリットルの血清ピペットで複数回トリチュレートし、プランジャーを使用して100マイクロメートルのストレーナーを通して溶液を通過させます。遠心分離によって組織分数を分離し、ピペットを使用して浮遊アディポサイト画分を廃棄する。1ミリリットルのアンモニウム-塩化カリウム、またはACK、リシスバッファー中の間質血管分画細胞ペレットを再懸濁し、数秒後にPBSで2%胎児子牛血清、またはFCSの10ミリリットルでの溶血反応を停止する。次いで、遠心分離により単離された白血球を採取し、250マイクロリットルの2%FCSをPBSでカウントするためにペレットを再懸濁する。シリンジスタンプを使用してペトリ皿の組織を摂氏4度で機械的に解震する前に、肝臓を氷の上のPBSの円錐形のチューブに収穫します。解剖した肝臓組織断片を10ミリリットルの温かい肝臓消化液を含む50ミリリットルのチューブに移し、ペトリ皿を3ミリリットルの新鮮な肝臓消化溶液で洗いすす。摂氏37度で20分、毎分200回転後、20ミリリットルのHBSSで消化を止め、10ミリリットルの血清ピペットで組織スラリーを複数回トリチュレートします。プランジャーを使用して、100マイクロメートルのストレーナーを通して組織溶液を通過させ、遠心分離によって肝細胞を採取する。ペレットを20ミリリットルの新鮮なHBSSで再懸濁し、遠心分離により肝細胞マトリックスを除去する。遠心分離のための上清を収集し、HBSSで33%低粘度密度の勾配媒体溶液の10ミリリットルでペレットを再懸濁する。肝臓免疫細胞を密度勾配遠心分離により分離し、白血球ペレットをACKリシスバッファーの1ミリリットルで再懸濁する。室温で4分後、HBSSの10ミリリットルでライシスを停止し、遠心分離のために15ミリリットルのチューブに30マイクロメートルの細孔ストレーナーを介して細胞をフィルタリングします。次いで、2%FCSの250マイクロリットルのペレットを、数えてPBSで再懸濁する。単離された白血球集団のフローサイトメトリック解析では、目的の組織から個々のポリスチレン蛍光活性化細胞選別、またはFACSチューブにPBSの100マイクロリットルの100マイクロリットルの6細胞に最大3倍の10を加える。各チューブに10マイクロリットルの抗CD16/CD32抗体を加えて氷上で10分間非特異的結合を遮断し、その後、適切な量の抗体混合物と1マイクロリットルの生存細胞識別を可能にするサンプル当たりの生存性染料を1マイクロリットルで染色します。光から保護された摂氏4度で20分後、1回の洗浄につき2%FCSとPBSの2ミリリットルでサンプルを2回洗浄し、遠心分離機を300倍gで摂氏4度で5分間洗浄します。次に、新鮮なPBSプラスFCSでペレットを再懸濁する。フローサイトメトリーで細胞を解析するには、未染色の陰性対照サンプルを使用して前方散乱と側面散乱を設定し、フローサイトメーターの電圧を調整して、生じ得る白血球集団を検出し、破片を除外します。次に、実験サンプルを実行する前に、多色補償のための単一の染色対照サンプルを実行し、チューブ当たり4つのイベントに少なくとも5回10を収集する。次に、分析のためにFCSデータファイルをエクスポートし、CD45陽性白血球の格子戦略を設定して、その後の対象の免疫細胞集団の同定を可能にする。ここで、ラット性分性およびマウスペリゴナリ脂肪における生存性染色を含むT細胞亜集団に対する代表的なゲーティング戦略が示されている。CD45陽性白血球は、最初にCD4およびCD8用にゲートされ、その後CD44およびCD62リガンドがナイーブ、中央記憶、エフェクター記憶およびエフェクターT細胞を区別する。CD44陽性細胞は、さらにCD127、キラー細胞レクチン様受容体G1、およびプログラム死-1で特徴付けられる。ここで、B細胞、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞を分析するための格言戦略が示されている。非SPF条件で収容される高脂肪食マウスではエフェクターメモリCD4陽性およびCD8陽性細胞の割合が高いのに対し、肝内ナイーブCD4陽性およびCD8陽性T細胞は、第7週のSPF高脂肪食マウスと比較して、これらの動物ではかなり低いことが判明した。重篤な脂肪滴の増加を含む、大行胞性脂肪症、小葉炎症、肝細胞バルーン、および破壊された小葉構造は、高脂肪食暴露マウスに見られるが、一部のSPFマウスだけが肝臓に軽度の脂肪蓄積を示す。さらに、ナチュラルキラー細胞の割合は、高脂肪食暴露マウスの末腸脂肪組織において高いが、一方、高脂肪食SPFマウスは樹状細胞のより高い割合を示した。この手順を試みる場合、特に明記されていない限り、細胞を氷の上や暗い状態に保つことが重要です。単細胞懸濁液を適切に調製する方法と、フローサイトメトリー実験のためにマウス脂肪と肝組織を分離する方法をよく理解する必要があります。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

ネズミ鞭虫感染症：腸内のタイプ2免疫と炎症のモデル

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

糖尿病CD4の養子移入+ T細胞によるマウスの加速された1型糖尿病の誘導

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

単純ヘルペスウイルス1型を持つマウス表皮の ex vivo 感染

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

マウス子牛に対する一貫したマッサージ様摂動の適用と、結果として生じる筋肉内圧変化のモニタリング

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

自己免疫性糖尿病モデルにおける機能試験用抗原特異的一次マウス細胞傷害性T細胞の高効率生成

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...