Name: an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00
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우리는 Anke Jurisch, 다이아나 워 너, 닥터 카 린 위 테와 코르넬리아 헥 트만에 게 도움을 요청 하 여 바이오 레 전 드에서 Tiburzy 하는 실험 절차와 벤자민에 대 한 도움이 되는 정보를 제공 하 여 게이팅 전략에 대 한 의견을 주었다. J.S.는 헬름홀츠 교부 금 (ICEMED)에 의해 지지 되었다. 이 연구는 베를린 건강 연구소의 임상 연구 단위에서 보조금에 의해 지원 되었다 (BIH), "BCRT 보조금" 독일 연방 교육부와 연구와 아인슈타인 재단에 의해. K.S.-B. 그리고 h.-D.V.는 FOR2165에 의해 후원 된다.

이 연구는 우리 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 감독 하에 동물 복지 법 및 건강의 국립 연구소의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 가이드에 따라 수행 되었다. 동물 프로토콜은 독일 Charité 베를린의 제도적 윤리 지침에 따라 실시 되었으며, Landesamt의 Gesundheit und Soziales의 승인을 받았고, 도착 가이드라인을 준수 합니다.
1. 다이어트 유도 동물 모델
<ol><li>4 주의 나이에 ?...

<ol>
	<li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis.</a> BMC Public Health. 9, 88 (2009).</li><li>Prentki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+&#946;+cell+failure+in+type.">Islet &#946; cell failure in type.</a> J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).</li><li>Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+insulin+resistance.">Inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444, 840 (2006).</li><li>Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+immune+system+and+adipose+tissue+in+obesity.">Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+fat,+and+the+emergence+of+immunometabolism.">Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).</li><li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies.">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610 (2011).</li><li>Onodera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+induce+PPAR&#947;-high+FOXP3(+)+regulatory+T+cells.">Adipose tissue macrophages induce PPAR&#947;-high FOXP3(+) regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).</li><li>Calle, E. E., Kaaks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overweight,+obesity+and+cancer:+epidemiological+evidence+and+proposed+mechanisms.">Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).</li><li>Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Nonalcoholic+Steatohepatitis:+Eat,+Delete,+and+Inflame.">Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame.</a> Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice+by+normalizing+environment.">Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment.</a> Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).</li><li>Sbierski-Kind, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Housing+Conditions+Reveal+a+Major+Impact+of+Adaptive+Immunity+on+the+Course+of+Obesity-Induced+Type+2+Diabetes.">Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes.</a> Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).</li><li>Japp, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+immunology+assessed+by+multidimensional+mass+cytometry.">Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).</li><li>Benedict, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease:+An+expanded+review.">Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review.</a> World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Immunity,+and+Metabolic+Disease.">Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+Cells+in+Adipose+Tissue.">The Immune Cells in Adipose Tissue.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 15, 34-38 (2013).</li><li>Bertola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+expression+patterns+of+inflammatory+and+immune+response+genes+associated+with+obesity+and+NASH+in+morbidly+obese+patients.">Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients.</a> PloS One. 5 (10), e13577 (2010).</li><li>Turnbaugh, P. J., B&#228;ckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-Induced+Obesity+Is+Linked+to+Marked+but+Reversible+Alterations+in+the+Mouse+Distal+Gut+Microbiome.">Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome.</a> Cell Host &amp; Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).</li><li>Singh, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+diet+on+the+gut+microbiome+and+implications+for+human+health.">Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).</li><li>M&#252;ller, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+barrier+impairment+by+high-fat+diet+in+mice+depends+on+housing+conditions.">Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions.</a> Molecular Nutrition &amp; Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).</li></ol>

스 테아의 각 막 염은 비만, 인슐린 저항성 및 dyslipidemia15와 같은 대사 이상과 강한 연관이 있다. 여러 연구에 따르면, 지방 조직 염증은 선천적인 면역계와 적응형 면역 체계의 세포의 변화 된 수준을 포함 하 여 타입-2 당뇨병의 병 인을 구동할 수 있다는 것을 나타냅니다.4,5,17 . 또?...

비만은 심장 병, 치기, 무 알콜 항 암 각 막 염 (내 시), 타입-2 당뇨병 (T2D) 및 몇몇 유형의 암의 발달을 위한 다 인 성과 무질서 및 중요 한 위험 요소입니다. 비만의 보급은 급속 하 게 세계적으로 증가 하 고 있습니다. 오늘날 세계 인구의 약 30%가 21억 명이 비만 또는과 체중1입니다. 비만-관련 된 인슐린 저항은 포도 당 항상성2를 유지 하는 인슐린을 위한 증가 한 필요를 보충 하기 위하여 췌 장 섬 베타 세포가 소진 될 때 T2D로 이끌어 낼 수 있습니다.
지방 조직은 지방 세포를 포함 하는 다양 한 세포 유형으로 구성 되어 있으며, 내 피 셀, 섬유 아 세포 및 면역 세포. 비만의 진행 도중, 면역 세포의 수 그리고 활동에 있는 변경은 비 대 성 지방 조직3의 저급 한 염증을 이끌어 낼 수 있습니다,4. 구체적으로, 과도 한 에너지 섭취는 혈당, 중성 지방 및 유리 지방산의 만성 상승 수준을 동반 하 고, 지방 세포 저 산소 증, 내 소포체 스트레스, 손상 된 미토 콘 드리 아 기능 및 향상 된 사이토카인 분 비, 염증 성 지방 면역 세포의 활성화의 결과5,6. 과거 연구는 주로 선천적인 면제에 집중 했습니다, 그러나 더 최근에 적응 하는 면역 세포 (T와 B 세포)는 포도 당 항상성의 중요 한 규칙으로 부상 했습니다. 그들은 염증 성 (CD8+ t 세포, Th1 및 B 세포 포함) 또는 주로 조절 기능 (규제 T (treg) 세포, Th2 세포 포함)을 소유 하 고 인슐린 저항성을 악화 시키거나 보호 할 수 있습니다7,8 , 9.
또한, 지방 조직10에의 한 사이토카인의 증가 된 생산을 포함 하 여 비만이 증가 하는 방법을 설명 하기 위해 여러 가지 기전이 제안 되었다. 내 쉬, 무 알콜 지방 간 질환의 진보적 인 형태와 선진국의 주요 건강 부담은, 조직 학적으로 풍 화 된 간세포, 지질 축적, 섬유 증 및 연골 염을 특징으로 하 고 진행 될 수 있다 간 경 변, 단 부 질환 또는 간세포 암 종. 몇몇 식이요법 (예를 들면 메티오닌과 콜린 결핍 다이어트11)은 비 인간 동물 모델에서 내 시 같은 간 병리학을 유도 하는 것으로 알려져 있지만, 이러한 접근법의 대부분은 내 쉬와 그 대사에 대 한 인간의 상태를 탈환 하지 않는다 그들은 특정 유전자 녹아웃을 필요로 하는 결과, 비 생리 식이 조작 또는 인간의 내 쉬의 전형적인 인슐린 저항이 부족. 또한, 신진 대사 질환의 근본적인 메커니즘에 대 한 우리의 이해는 현재 표준 특정 병원 체 무료 (SPF) 조건 하에 보관 된 실험실 마우스를 사용 하 여 수행 된 실험을 기반으로 합니다. 이러한 장벽 시설은 비정상적으로 위생 적 이며 인간 들이 겪는 미생물 다양성을 고려 하지 않으며,이는 임상 접근법에 대 한 동물 연구의 번역 과정에서 어려움을 고려할 수 있는12,13 , 14.
인간 면 역학적 상태를 재생 하는 고급 마우스 모델에서 인슐린 저항성 및 내 시를 개발 하는 동안 지방 조직과 간에 서 상이한 면역 세포 서브 세트를 조사 하기 위해, 마우스를 반 멸 균 된 개별 케이지 내에 수납 하였다 장벽 없는 조건. 항 원 노출 조건 하에 보관 된 마우스는 이미 15 주 동안 고 지방 식이 요법 (HFD)을 먹이는13의 후 내 시 같은 간 병리학을 개발 했습니다. 그들은 나이 일치 하는 SPF 마우스에 비해 그들은 거 대 한 신경 병 증을 개발, 간 침투 및 면역 세포의 활성화.
이 원고는 내 시의 모델에서 마우스 지방 조직과 간에 서 면역 세포 서브 세트를 정의 하 고 계산 하는 강력한 유 세포 분석을 설명 합니다. 유 세포 분석기 분석은 RT-PCR 또는 면역 조직 화학 접근법과 달리 개별 세포의 여러 파라미터를 동시에 검출할 수 있게 합니다.
요약 하자면, 우리의 연구는 인슐린 저항과 내 쉬의 개발과 또한 인간의 상태에 대 한 충실도를 나타내는 기본 메커니즘을 조사 하기 위한 단기 HFD의 마우스 모델을 제공 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">100&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">26G x 5/8 needles&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">35mm Petri Dishes&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">40&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td style="width:169px;">GIBCO</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103127</td>
			<td>AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Analysis software&#160;</td>
			<td>FlowJo 10.0.8 software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">117309</td>
			<td>AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">138411</td>
			<td>AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse CD127 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135023</td>
			<td>AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">123131</td>
			<td>AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135219</td>
			<td>AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108739</td>
			<td>AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101239</td>
			<td>AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV711 anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103255</td>
			<td>AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV785 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100749</td>
			<td>AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:351px;">C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Forschungseinrichtungen f&#252;r experimentelle Medizin (FEM)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CaCl2&#160;</td>
			<td>Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td style="width:119px;">A119.1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Collagenase NB 4G Proved Grade&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SERVA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11427513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:351px;">Collagenase Typ I&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 15ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 50ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DNAse&#160;&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Filter 30&#181;m&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Celltrics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">400422316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FITC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100203</td>
			<td>AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD-LSR Fortessa&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Bioanalytic GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">085021-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">High-fat diet&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SSNIF</td>
			<td>E15741&#8211;34&#160;</td>
			<td>60 kJ% from fat, 19&#8201;kJ% from proteins, and 21&#8201;kJ% from carbohydrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">micro dissecting scissors&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S3146</td>
			<td>used for dissection purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE anti-mouse CD25 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101903</td>
			<td>AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">104417</td>
			<td>AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">107629</td>
			<td>AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td>AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Percoll solution&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103031</td>
			<td>AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108427</td>
			<td>AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Round-Bottom Tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:169px;">STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">38030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TruStain fcX anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101301</td>
			<td>AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">423105</td>
			<td>viablity stain&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes

비만은 만성 저 학년 염증과 인슐린 저항성과 관련 되어 있으며, 2 형 당뇨병 및 무 알콜 수 막 염 (내 쉬)과 같은 만성 대사 질환의 증가 하는 보급에 기여 합니다. 최근의 연구는 프로 염증 성 면역 세포가 비만 비 대 지방 조직과 간을 침투 시키는 것을 확립 했습니다. 신진 대사 항상 성의 맥락에서 면역 세포의 새로운 중요성을 감안할 때, 타입-2 당뇨병과 내 시의 개발 중에 그들의 수정 사항을 정량화 하 고 특성화 하는 중요 한 필요가 있다. 그러나, 인간 내 쉬의 전형적인 병 태 생리학적 특징을 유도 하는 동물 모델은 희소 하다.
이 문서에서는, 우리 내 시의 신뢰할 수 있는 마우스 모델에서 간 및 지방 조직에서 고립 된 면역 세포 하위 집합을 식별 하는 자세한 프로토콜을 제공 합니다, 비 특이 적 병원 체 없는 (SPF) 조건 하에서 주택 고 지방 다이어트 (HFD) 마우스에 의해 설립 적어도 7 주 동안 장벽. 우리는 유 세포 분석기에 의해 비-SPF 조건에서 마우스의 처리, 조직의 소화 및 대 식 세포, 천연 킬러 (NK) 세포, 수지상 세포, B 및 T 세포 서브 세트의 식별을 입증 한다. SPF HFD 마우스 및 비 SPF 마우스의 대표적인 유 세포 분석 플롯이 제공 된다. 신뢰할 수 있고 해석할 데이터를 얻기 위해 항 체의 사용, 조직 소화를 위한 정확 하 고 정밀한 방법 및 유 세포 분석 실험에서의 적절 한 게이팅을 중요 한 요소입니다.
미생물 항 원에 대 한 비-SPF 조건에서 그들을 주택에 의해 쥐에 있는 생리 적 항 원 노출을 복원 하는 내정간섭은 면역학 변경 사이 링크를 조사 하기를 위한 관련 도구를 제공할 수 있었습니다, 규정식에 의하여 유도 된 비만과 관련 된 장기 합병증.

설명 된 프로토콜은 식이 유도 된 내 쉬의 모델에서 뮤 린 perigonadal 지방 조직과 간에 서 분리 된 선천적인 및 적응 면역 세포의 표면 마커의 특성화를 허용 합니다. 이 모델에서, 내 시는 HFD 플러스 자당 (6%)의 투여에 의해 유도 되었다 이전에 보고 된 바와 같이 C57Bl/6J 마우스에서 7 내지 15 주 동안식 수를 한다. 중요 하 게는, 생쥐는 반 멸 균 상태에 보관 되었고, 따라서 실험 전반...

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An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

간단 하 고 신뢰할 수 있는 식이 유발 설치류 동물 모델에 대 한 무 알콜 지방 각 막 염 (내 쉬)에 대 한 설명, 동물의 비 SPF 주택을 통해 달성 하 고 특정 높은 뚱뚱한 다이어트의 관리. 우리는 마우스를 환경 세균에 노출 시 킴으로써 인간 면 역학적 조건을 다시 캡처하는 간 및 지방 면역 세포 하위 세트의 식별을 설명 합니다.

타입-2 당뇨병과 관련 하 여 무 알콜 수 막 염을 위한 진보 된 뮤 린 모형

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

이 방법은 면역 대사 분야에서 면역 세포의 기여에 대 한 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다 비만 유도 염증에 대 한 지방 및 간 간염 조직에서 간염. 이러한 기술은 비특이적 병원체가 없는 설치류 하우징 하우징을 통해 달성된 무알코올 성 지방 간염의 식이 유발 모델에서 지방 및 간 면역 세포의 분리에 최적화되어 있다. 이 방법은 신진 대사 항상성의 유지에 관련 된 면역 메커니즘의 우리의 이해를 심화 하는 데 도움이 수 있습니다.일반적으로, 이 기술에 새로운 개별은 기능적으로 실행 가능한 해리된 세포의 수율을 최대화하고 유동 세포 측정에 있는 적당한 게이팅을 설치하는 투쟁할 것입니다. 지방 조직 단일 세포 현탁액을 생성하려면 안락사 마우스의 가슴을 70 %에탄올로 분사하고 늑골 케이지의 전체 길이를 따라 정립 및 복벽을 통해 5 ~ 6 센티미터 의 중앙 절개를 조심스럽게 만들어 흉막과 심장을 노출시합니다. 26 게이지 바늘을 사용하여, 왼쪽 심실의 정점에 0.9 % 식염수 용액의 적어도 10 밀리리터를 주입하고 복막 구멍을 열기 위해 가위를 사용합니다.그런 다음 epigonadal 지방 조직을 해부하고 무게를 측정합니다. 50 밀리리터 원피스 튜브로 조직 조각을 옮기기 전에 4도에서 페트리 접시에 지방 조직을 기계적으로 분리합니다. 페트리 접시에 0.5%의 소 세럼 알부민 또는 BSA를 PBS에 넣고, 지방 조직 1그램당 3밀리리터의 지방 조직 소화 용액을 튜브에 첨가합니다.섭씨 37도, 분당 200회 회전에서 20분 후 PBS에 0.5%BSA의 5밀리리터를 추가하고 얼음 위에 지방 소화를 넣습니다. 10밀리리터 세로지컬 파이펫으로 솔루션을 여러 번 트리투레이하고 플런저를 사용하여 100마이크로미터 스트레이너를 통해 솔루션을 전달합니다. 조직 분획을 원심분리로 분리하고 파이펫을 사용하여 부동 지방 세포 분획을 버립니다.기질 혈관 분수 세포 펠릿을 암모늄 염화 칼륨 또는 ACK, 리시스 버퍼의 1 밀리리터로 재중단하여 몇 초 후 PBS에서 2 %의 태아 종아리 혈청 또는 FCS의 10 밀리리터로 용해 반응을 중지합니다. 이어서, 원심분리에 의해 고립된 백혈구를 수집하고, 계산을 위해 PBS에서 2%FCS의 250 마이크로리터에서 펠릿을 재중단한다. 주사기 스탬프를 사용하여 페트리 접시에 조직을 기계적으로 해리하기 전에 얼음에 PBS의 원추형 튜브로 간을 수확 4섭씨.해부된 간 조직 조각을 따뜻한 간 소화 용액 10밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 튜브로 옮기고, 신선한 간 소화 용액 3밀리리터로 페트리 접시를 헹굽니다. 섭씨 37도에서 20분, 분당 200회 회전 후 HBSS 20밀리리터로 소화를 멈추고 10밀리리터 세로지컬 파이펫으로 조직 슬러리를 여러 번 세리세타트합니다. 플런저를 사용하여 100마이크로미터 스트레이너를 통과하고 원심분리로 간 세포를 수집합니다.펠릿을 신선한 HBSS 20 밀리리터로 재중단하고 원심분리에 의해 간세포 매트릭스를 제거합니다. HBSS에서 33% 낮은 점도 밀도 그라데이션 배지 용액의 10 밀리리터에서 펠릿을 재중단하여 원심분리용 상체를 수집합니다. 간 면역 세포를 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 분리하고 ACK 용해 완충제의 1 밀리리터에서 백혈구 펠릿을 다시 중단합니다.실온에서 4분 후, HBSS 10밀리리터로 용액을 멈추고 30마이크로미터 모공 스트레이너를 통해 세포를 원심분리를 위한 15밀리리터 튜브로 필터링합니다. 그런 다음, 계산을 위해 PBS에서 2%FCS의 250 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 고립 된 백혈구 집단의 유동 세포 측정 분석을 위해, 개별 폴리스티렌 형광 활성화 세포 선별, 또는 FACS, 튜브로 관심의 조직에서 PBS에서 2 %FCS의 100 마이크로 리터의 6 세포에 최대 3 배 10을 추가합니다.각 튜브에 10개의 항 CD16/CD32 항체를 첨가하여 얼음에 10분 동안 비특이적 결합을 차단한 다음, 항체 혼합물의 적절한 부피와 시료당 생존성 염료 1편으로 염색하여 살아있는 세포 차별을 허용합니다. 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 20분 후, 시료를 2밀리리터 2밀리리터와 세척당 PBS, 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분간 300배씩 세척합니다. 그런 다음, 신선한 PBS 플러스 FCS에서 펠릿을 다시 중단합니다.유동 세포측정에 의해 세포를 분석하려면, 스테인드 네거티브 제어 샘플을 사용하여 전방 및 측면 산란을 설정하고, 유동 세포계의 전압을 조정하여 실행 가능한 백혈구 집단을 감지하고 이물질을 배제한다. 다음으로, 실험 샘플을 실행하기 전에 다색 보정을 위해 단일 스테인드 컨트롤 샘플을 실행하고 튜브 당 4개의 이벤트에 대해 최소 5회 10회 수집합니다. 그런 다음 분석을 위해 FCS 데이터 파일을 내보내고 CD45 양성 백혈구에 대한 게이팅 전략을 설정하여 후속 면역 세포 집단의 식별을 허용합니다.여기서, 뮤린 페리고나달 지방에서 이중 차별 및 생존성 스테인링을 포함하는 T 세포 하위 집단을 위한 대표적인 게이팅 전략이 나타난다. CD45 양성 백혈구는 CD4 및 CD8에 대해 먼저 게이트되고 그 후 CD44 및 CD62 리간드에 대해 순진한, 중앙 메모리, 이펙터 메모리 및 이펙터 T 세포를 구별합니다. CD44 양성 세포는 CD127, 킬러 셀 렉틴 과 같은 수용체 G1 및 프로그램된 데스-1을 더 특징으로 합니다.여기서, B 세포, 과립구, 자연 킬러 세포, 대식세포 및 수지상 세포를 분석하기 위한 게이팅 전략이 도시된다. 이펙터 메모리 CD4 양성 및 CD8 양성 세포의 높은 비율은 비 SPF 조건에 수용 된 고지방 다이어트 마우스에서 검출 될 수 있지만, 반면 간 내 순진한 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포는 7 주에 SPF 고지방 다이어트 마우스에 비해 이러한 동물에서 상당히 낮은 것으로 나타났습니다. 중증 스테토시스는 대식체 스테토시스, lobular 염증, 간세포 풍선 및 파괴 된 lobular 구조의 증가를 포함하여 고지방 식단에서 발견되는 반면 일부 SPF 마우스만이 간에서 온화한 지방 축적을 나타낸다.또한, 천연 킬러 세포의 비율은 고지방 식이 요법의 지방 조직에서 더 높으며, 고지방 식단 SPF 마우스는 수지상 세포의 높은 비율을 입증했다. 이 절차를 시도할 때, 그렇지 않으면 언급되지 않는 한 얼음과 어둠 속에서 세포를 유지하는 것이 중요합니다. 이제 단일 세포 현탁액을 올바르게 준비하는 방법과 유동 세포 측정 실험을 위해 뮤린 지방과 간 조직을 격리하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris 감염 : 굿에서 2 형 내성 및 염증의 모델

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

연구

면역학 및 감염병학

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

마우스 종아리에 일관된 마사지와 같은 섭동을 적용하고 근육 내 압력 변화를 모니터링

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...