Name: an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

Vi takker anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte og Cornelia Heckmann for hjelp med eksperimentelle prosedyrer og Benjamin Tiburzy fra Biolegend for nyttige kommentarer på gating strategi. JS ble støttet av Helmholtz Grant (ICEMED). Denne studien ble støttet av tilskudd fra klinisk forskning enhet av Berlin Institute of Health (BIH), den "BCRT-Grant" av det tyske føderale departementet for utdanning og forskning og Einstein Foundation. K.S.-B. og H.-D.V. er finansiert av FOR2165.

Denne studien ble utført i samsvar med guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr av National Institutes of Health and the Animal Welfare Act under tilsyn av våre institusjonelle Animal Care og use Committee. Dyre protokoller ble utført i henhold til institusjonelle etiske retningslinjer for Charité Berlin, Tyskland, og ble godkjent av Landesamt für Gesundheit und Soziales og overholder retningslinjene for ankomst.
1. Diet-indusert Animal modell av steatohepatitis
<ol><li>Transfer mus...

<ol>
	<li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis.</a> BMC Public Health. 9, 88 (2009).</li><li>Prentki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+&#946;+cell+failure+in+type.">Islet &#946; cell failure in type.</a> J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).</li><li>Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+insulin+resistance.">Inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444, 840 (2006).</li><li>Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+immune+system+and+adipose+tissue+in+obesity.">Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+fat,+and+the+emergence+of+immunometabolism.">Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).</li><li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies.">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610 (2011).</li><li>Onodera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+induce+PPAR&#947;-high+FOXP3(+)+regulatory+T+cells.">Adipose tissue macrophages induce PPAR&#947;-high FOXP3(+) regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).</li><li>Calle, E. E., Kaaks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overweight,+obesity+and+cancer:+epidemiological+evidence+and+proposed+mechanisms.">Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).</li><li>Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Nonalcoholic+Steatohepatitis:+Eat,+Delete,+and+Inflame.">Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame.</a> Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice+by+normalizing+environment.">Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment.</a> Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).</li><li>Sbierski-Kind, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Housing+Conditions+Reveal+a+Major+Impact+of+Adaptive+Immunity+on+the+Course+of+Obesity-Induced+Type+2+Diabetes.">Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes.</a> Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).</li><li>Japp, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+immunology+assessed+by+multidimensional+mass+cytometry.">Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).</li><li>Benedict, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease:+An+expanded+review.">Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review.</a> World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Immunity,+and+Metabolic+Disease.">Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+Cells+in+Adipose+Tissue.">The Immune Cells in Adipose Tissue.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 15, 34-38 (2013).</li><li>Bertola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+expression+patterns+of+inflammatory+and+immune+response+genes+associated+with+obesity+and+NASH+in+morbidly+obese+patients.">Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients.</a> PloS One. 5 (10), e13577 (2010).</li><li>Turnbaugh, P. J., B&#228;ckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-Induced+Obesity+Is+Linked+to+Marked+but+Reversible+Alterations+in+the+Mouse+Distal+Gut+Microbiome.">Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome.</a> Cell Host &amp; Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).</li><li>Singh, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+diet+on+the+gut+microbiome+and+implications+for+human+health.">Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).</li><li>M&#252;ller, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+barrier+impairment+by+high-fat+diet+in+mice+depends+on+housing+conditions.">Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions.</a> Molecular Nutrition &amp; Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).</li></ol>

Steatohepatitis har en sterk assosiasjon med metabolske unormalt som fedme, insulinresistens og dyslipidemi15. Flere studier tyder på at fettvev betennelse kan drive patogenesen av type 2 diabetes, inkludert endrede nivåer av celler av både medfødt og adaptive immunsystem4,5,16,17 . I tillegg har det blitt funnet at fedme modulerer aktiveringen av immun veier, som ka...

Fedme er en multifaktoriell lidelse og en stor risikofaktor for å utvikle hjertesykdom, hjerneslag, alkoholfritt steatohepatitis (NASH), type 2 diabetes (T2D) og noen typer kreft. Utbredelsen av fedme er raskt økende globalt. I dag, 2 100 000 000 mennesker-nesten 30% av verdens befolkning-er enten overvektige eller overvekt1. Fedme-assosiert insulinresistens kan føre til T2D, når oppbrukt bukspyttkjertel Holme beta celler ikke klarer å kompensere for økt behov for insulin for å opprettholde glukose homeostase2.
Fettvev består av ulike celletyper inkludert adipocytter, endothelial celler, fibroblaster og immunceller. Under progresjon av fedme, kan endringer i antall og aktivitet av immunceller føre til lav-grade betennelse i hypertrofisk fettvev3,4. Nærmere bestemt har det blitt funnet at overdreven energiinntak, ledsaget av kronisk forhøyede nivåer av blod glukose, triglyserider og frie fettsyrer, fører til adipocyte hypoksi, endoplasmatiske retikulum stress, nedsatt mitokondrie funksjon og forbedret cytokin sekresjon, noe som resulterer i aktivering av Pro-inflammatorisk fett immunceller5,6. Tidligere forskning har i hovedsak fokusert på medfødt immunitet, men mer nylig adaptive immunceller (T-og B-celler) har dukket opp som viktige regulatorer av glukose homeostase. De har inflammatoriske (inkludert CD8+ T celler, Th1, og B celler) eller primært regulatoriske funksjoner (inkludert regulatoriske T (treg) celler, Th2 celler) og kan både forverre eller beskytte mot insulinresistens7,8 , 9i.
Videre ble det foreslått flere mekanismer for å forklare hvordan Fedme øker steatohepatitis, inkludert økt produksjon av cytokiner av fettvev10. NASH, den progressive form av alkoholfrie fatty leversykdom og en stor helse byrde i utviklede land, er histologisk preget av ballong hepatocytter, lipid akkumulering, fibrose og pericellular betennelser og kan utvikle seg til skrumplever, sluttfasen leversykdom eller leverkreft. Flere diett (for eksempel metionin og kolin mangelfull diett11) er kjent for å indusere Nash-lignende leveren patologi i ikke-menneskelige dyr modeller, men de fleste av disse tilnærmingene ikke recapitulate menneskelige forhold av Nash og dens metabolske konsekvenser som de enten krever spesifikke gen knockout, ikke-fysiologiske kosttilskudd manipulasjoner eller mangel insulinresistens typisk for menneskelig NASH. Videre er vår forståelse av de underliggende mekanismene for metabolske sykdommer for tiden basert på eksperimenter utført med laboratoriet mus plassert under standard spesifikke patogen gratis (SPF) forhold. Disse barriere fasiliteter er unormalt hygienisk og ikke vurdere mikrobiell mangfold mennesker må møte, som kan gjøre rede for vanskeligheter i oversettelsesprosessen av dyrestudier til kliniske tilnærminger12,13 , 14i det.
For å undersøke de ulike immun celle undergrupper i fettvev og lever under utvikling av insulinresistens og NASH i en avansert mus modell reprodusere menneskelige immunologiske forhold, mus ble plassert i individuelle bur i semi sterile forhold uten barriere. Mus huset under antigen utsatte forhold utviklet NASH-like leveren patologi allerede etter 15 uker med høy fett diett (HFD) fôring13. Sammenlignet med alder-matchet SPF mus de utviklet macrovesicular steatosis, Hepatic infiltrasjon og aktivering av immunceller.
Dette manuskriptet beskriver en robust flyt flowcytometri analyse for å definere og telle immun celle undergrupper fra mus fettvev og lever i en modell av NASH. Flow flowcytometri analyse tillater påvisning av flere parametre for individuelle celler samtidig i motsetning til RT-PCR eller immunhistokjemi tilnærminger.
Oppsummert, vår studie tilbyr en musemodell av kortsiktige HFD for å undersøke utviklingen av insulinresistens og NASH og de underliggende mekanismene som også utstillinger troskap til den menneskelige tilstand.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">100&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">26G x 5/8 needles&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">35mm Petri Dishes&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">40&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td style="width:169px;">GIBCO</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103127</td>
			<td>AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Analysis software&#160;</td>
			<td>FlowJo 10.0.8 software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">117309</td>
			<td>AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">138411</td>
			<td>AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse CD127 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135023</td>
			<td>AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">123131</td>
			<td>AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135219</td>
			<td>AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108739</td>
			<td>AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101239</td>
			<td>AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV711 anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103255</td>
			<td>AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV785 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100749</td>
			<td>AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:351px;">C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Forschungseinrichtungen f&#252;r experimentelle Medizin (FEM)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CaCl2&#160;</td>
			<td>Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td style="width:119px;">A119.1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Collagenase NB 4G Proved Grade&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SERVA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11427513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:351px;">Collagenase Typ I&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 15ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 50ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DNAse&#160;&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Filter 30&#181;m&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Celltrics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">400422316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FITC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100203</td>
			<td>AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD-LSR Fortessa&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Bioanalytic GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">085021-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">High-fat diet&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SSNIF</td>
			<td>E15741&#8211;34&#160;</td>
			<td>60 kJ% from fat, 19&#8201;kJ% from proteins, and 21&#8201;kJ% from carbohydrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">micro dissecting scissors&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S3146</td>
			<td>used for dissection purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE anti-mouse CD25 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101903</td>
			<td>AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">104417</td>
			<td>AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">107629</td>
			<td>AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td>AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Percoll solution&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103031</td>
			<td>AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108427</td>
			<td>AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Round-Bottom Tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:169px;">STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">38030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TruStain fcX anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101301</td>
			<td>AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">423105</td>
			<td>viablity stain&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes

Fedme er assosiert med kronisk lav-grade betennelse og insulinresistens, bidrar til en økende utbredelse av kroniske metabolske sykdommer, slik som type 2 diabetes og alkoholfrie steatohepatitis (NASH). Nyere forskning har fastslått at Pro-inflammatorisk immunceller infiltrere overvektige hypertrofisk fettvev og lever. Gitt den nye betydningen av immunceller i sammenheng med metabolske homeostase, er det et kritisk behov for å kvantifisere og karakterisere deres modifikasjon under utviklingen av type 2 diabetes og NASH. Imidlertid, dyr modeller det indusere patofysiologiske vise egenskaper typisk av Human NASH er sparsom.
I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll for å identifisere immun celle delsett isolert fra lever og fettvev i en pålitelig musemodell av NASH, etablert av boliger høy fett diett (HFD) mus under ikke-spesifikke patogen-fri (SPF) forhold uten barriere i minst sju uker. Vi viser håndtering av mus i ikke-SPF forhold, fordøyelse av vev og identifisering av makrofager, naturlig Killer (NK) celler, dendrittiske celler, B og T celle delsett av Flow flowcytometri. Representant flyt flowcytometri tomter fra SPF HFD mus og ikke-SPF mus er gitt. For å få pålitelige og interpretable data, bruk av antistoffer, nøyaktige og presise metoder for vev fordøyelse og riktig gating i flyt flowcytometri eksperimenter er kritiske elementer.
Intervensjonen for å gjenopprette fysiologisk antigen eksponering i mus ved å bolig dem i ikke-SPF forhold og løs eksponering for mikrobiell antigener kan gi et relevant verktøy for å undersøke sammenhengen mellom immunologiske endringer, diett-indusert fedme og relaterte langsiktige komplikasjoner.

Protokollen beskrevet tillater karakterisering av overflaten markører for medfødte og adaptive immunceller isolert fra murine perigonadal fettvev og lever i en modell av diett-indusert NASH. I denne modellen ble NASH indusert ved administrering av HFD pluss sukrose (6%) i drikkevann i 7 til 15 uker i C57Bl/6J mus, som tidligere rapportert13. Viktigere, mus ble plassert i semi sterile forhold og dermed utsatt for miljømessige antigener gjennom hele eksperimentet. HFD matet mus ligger i SPF forho...

Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

En enkel og pålitelig diett-indusert gnager dyr modell for alkoholfrie steatohepatitis (NASH) er beskrevet, oppnås gjennom ikke-SPF boliger av dyrene og administrasjon av en bestemt høy-fett diett. Vi beskriver identifisering av lever-og fett immunceller undergrupper for å recapitulate menneskelige immunologiske tilstander ved å utsette mus for miljø bakterier.

En avansert murine modell for alkoholfrie steatohepatitis i samarbeid med type 2 diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Denne metoden kan bidra til å svare på spørsmål i immunometabolismefeltet om bidrag fra immunceller til fedmeindusert betennelse i fett og steatohepatit i levervev. Disse teknikkene har blitt optimalisert for isolering av fett- og levermunikaceller i en diettindusert modell av alkoholfri steatohepatitt oppnådd gjennom et ikke-spesifikt patogenfritt gnagerhus. Disse metodene kan bidra til å utdype vår forståelse av immunologiske mekanismer som er involvert i vedlikehold av metabolsk homeostase.Generelt vil personer som er nye i denne teknikken slite med å maksimere utbyttet av funksjonelt levedyktige dissosierte celler og sette opp riktig gating i strømningscytometri. For å generere et fettvev encellede suspensjon, spray brystet av en euthanized mus med 70% etanol, og forsiktig gjøre en fem til seks centimeter sentral snitt gjennom integument og bukveggen langs hele lengden av ribbeburet for å avsløre pleural hulrom og hjerte. Bruk en 26-gauge nål, injisere minst 10 milliliter av 0,9% saltvannsløsning i toppen av venstre ventrikkel, og bruk saks for å åpne bukhulen.Deretter dissekere epigonadale fettvev, og veie den. Mekanisk dissosiere fettvevet i fine biter i en petriskål ved fire grader Celsius før du overfører vevsfragmentene til et 50-milliliter konisk rør. Skyll petriskålen med en milliliter på 0,5 % storfe serumalbumin, eller BSA, i PBS, og tilsett tre milliliter nylaget fettvevsfordøyeløsning per gram fettvev til røret.Etter 20 minutter ved 37 grader Celsius og 200 rotasjoner per minutt, tilsett fem milliliter på 0,5% BSA i PBS, og legg fettet digest på is. Triturre oppløsningen flere ganger med en 10-milliliter serologisk pipette, og bruk et stempel for å passere løsningen gjennom en 100-mikrometersil. Skill vevsfraksjonene ved sentrifugering, og bruk en pipette til å kaste den flytende adipocyttfraksjonen.Resuspend stromal vaskulær fraksjon celle pellet i en milliliter ammonium-klorid-kalium, eller ACK, lysis buffer, stoppe lysis reaksjon med 10 milliliter på 2% fosterkalv serum, eller FCS, i PBS etter noen sekunder. Deretter samler du de isolerte hvite blodlegemene ved sentrifugering, og gjenbruker pelleten i 250 mikroliter på 2% FCS i PBS for telling. Høst leveren inn i et konisk rør med PBS på is før du bruker sprøytestempler for å mekanisk dissosiere vevet i en petriskål ved fire grader Celsius.Overfør dissekert levervev fragmenter i en 50-milliliter rør som inneholder 10 milliliter varm lever fordøye løsning, og skyll Petri parabolen med tre milliliter frisk lever fordøye løsning. Etter 20 minutter ved 37 grader Celsius og 200 rotasjoner per minutt, stopp fordøyelsen med 20 milliliter HBSS, og triturat vevsslurmen flere ganger med en 10-milliliter serologisk pipette. Bruk et stempel for å passere vevsoppløsningen gjennom en 100-mikrometersil, og samle levercellene ved sentrifugering.Resuspend pellet i 20 milliliter av fersk HBSS, og fjerne hepatocytt matrisen ved sentrifugering. Samle supernatant for sentrifugering, resuspending pellet i 10 milliliter av 33% lav viskositet tetthet gradient medium løsning i HBSS. Skill leveren immunceller ved tetthet gradient sentrifugasjon, og resuspend leukocytt pellet i en milliliter ACK lysis buffer.Etter fire minutter ved romtemperatur, stopp lysisen med 10 milliliter HBSS, og filtrer cellene gjennom en 30-mikrometer pore sil inn i et 15-milliliter rør for sentrifugering. Deretter bruker du pelleten på plass i 250 mikroliter på 2%FCS i PBS for telling. For flow cytometrisk analyse av de isolerte leukocyttpopulasjonene, legg til opptil tre ganger 10 til de seks cellene i 100 mikroliter på 2% FCS i PBS fra vevet av interesse i individuell polystyren fluorescensaktivert cellesortering, eller FACS, rør.Tilsett 10 mikroliter anti-CD16/CD32-antistoff til hvert rør for å blokkere eventuelle ikke-spesifikke bindinger i 10 minutter på is, etterfulgt av farging med riktig volum antistoffblanding og ett mikroliter levedyktighetsfargestoff per prøve for å tillate levende og død cellediskriminering. Etter 20 minutter ved fire grader Celsius beskyttet mot lys, vask prøvene to ganger med to milliliter på 2% FCS pluss PBS per vask, og sentrifuge på 300 ganger g i fem minutter ved fire grader Celsius. Deretter bruker du pelleten i fersk PBS pluss FCS.For å analysere cellene ved strømningscytometri, bruk en uoppfylt negativ kontrollprøve for å sette forover og side scatter, og justere spenningene i strømningssytometeret for å oppdage den levedyktige leukocytterpopulasjonen og for å utelukke rusk. Deretter kjører du enkeltfargede kontrollprøver for flerfarget kompensasjon før du kjører eksperimentelle prøver, og samler minst fem ganger 10 til de fire hendelsene per rør. Deretter eksporterer du FCS-datafilene for analyse, og setter gating-strategien for CD45-positive leukocytter for å tillate identifisering av de påfølgende immuncellepopulasjonene av interesse.Her vises en representativ gating strategi for T celle underpopulasjoner inkludert dobbel diskriminering og levedyktighet flekker i murine perigonadal fett. CD45-positive leukocytter er først inngjerdet for CD4 og CD8 og deretter for CD44 og CD62 ligand å diskriminere mellom naive, sentrale minne, effektorminne, og effektor T celler. CD44-positive celler karakteriseres deretter ytterligere med CD127, killer celle lectin-lignende reseptor G1, og programmert død-1.Her vises gatingstrategien for å analysere B-celler, granulocytter, naturlige morderceller, makrofager og dendrittiske celler. En høyere prosentandel av effector minne CD4-positive og CD8-positive celler kan oppdages i fettfattige diettmus plassert i ikke-SPF-forhold, mens intrahepatiske naive CD4-positive og CD8-positive T-celler er funnet å være betydelig lavere hos disse dyrene sammenlignet med SPF fettfattige diettmus ved uke syv. Alvorlig steatose, inkludert en økning av store lipiddråper som resulterer i makrofaglig steatose, lobulær betennelse, hepatocellulær ballonger og ødelagt lobular struktur finnes i fettfattig diett eksponert mus mens bare noen SPF-mus viser en mild fettakkumulering i leveren.I tillegg er prosentandelen av naturlige morderceller høyere i perigonadale fettvev av fettfattige diett eksponerte mus, mens fettrik diett SPF-mus viste høyere prosentandeler av dendrittiske celler. Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å holde cellene på is og i mørket med mindre annet er angitt. Du bør nå ha en god forståelse av hvordan du skal forberede encellede suspensjoner og hvordan du isolerer murine fett og levervev for strømningscytometrieksperimenter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering av Primary Murine Type II alveolære epitelceller for Funksjonell og molekylær studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Akselerert Type 1 Diabetes Induksjon i Mus ved Adoptive Overføring av diabetogenic CD4 + T celler

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Bruk av bildecytometri for kvantifisering av patogene sopper i foreningen med Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi metoder for å bestemme levedyktigheten til bakterier i foreningen med pattedyrceller

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolasjon og intravenøs injeksjon av murine Bone Marrow Avledet Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infeksjon av murine Epidermis med Herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Anvendelse av konsekvent massasje-lignende forstyrrelser på mus kalver og overvåking av resulterende intramuskulær trykk endringer

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Høy-effektivitet generasjon av antigen-spesifikke primær mus cytotoksisk T celler for funksjonell testing i en autoimmun diabetes modell

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...