Name: an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

Мы благодарим Анке Журисч, Диана Woellner, д-р Катрин Витте и Корнелии Хекманн за помощь в экспериментальных процедурах и Бенджамин Tiburzy из Билегенда для полезные замечания по стратегии стробирования. И.С. был поддержан грантом Гельмхольца (ICEMED). Это исследование было поддержано грантами из отдела клинических исследований Берлинского института здравоохранения (БиГ), «БЭЛТ-гранта» федеральным министерством образования и исследований Германии и Фондом Эйнштейна. К.С.-Б. и H.-Д.В. финансируются FOR2165.

Это исследование проводилось в соответствии с руководством по уходу и использованию лабораторных животных национальных институтов здравоохранения и закона о защите животных под наблюдением нашего институционального Комитета по уходу за животными и использованию. Животные протокол...

<ol>
	<li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis.</a> BMC Public Health. 9, 88 (2009).</li><li>Prentki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+&#946;+cell+failure+in+type.">Islet &#946; cell failure in type.</a> J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).</li><li>Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+insulin+resistance.">Inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444, 840 (2006).</li><li>Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+immune+system+and+adipose+tissue+in+obesity.">Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+fat,+and+the+emergence+of+immunometabolism.">Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).</li><li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies.">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610 (2011).</li><li>Onodera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+induce+PPAR&#947;-high+FOXP3(+)+regulatory+T+cells.">Adipose tissue macrophages induce PPAR&#947;-high FOXP3(+) regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).</li><li>Calle, E. E., Kaaks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overweight,+obesity+and+cancer:+epidemiological+evidence+and+proposed+mechanisms.">Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).</li><li>Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Nonalcoholic+Steatohepatitis:+Eat,+Delete,+and+Inflame.">Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame.</a> Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice+by+normalizing+environment.">Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment.</a> Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).</li><li>Sbierski-Kind, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Housing+Conditions+Reveal+a+Major+Impact+of+Adaptive+Immunity+on+the+Course+of+Obesity-Induced+Type+2+Diabetes.">Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes.</a> Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).</li><li>Japp, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+immunology+assessed+by+multidimensional+mass+cytometry.">Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).</li><li>Benedict, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease:+An+expanded+review.">Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review.</a> World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Immunity,+and+Metabolic+Disease.">Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+Cells+in+Adipose+Tissue.">The Immune Cells in Adipose Tissue.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 15, 34-38 (2013).</li><li>Bertola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+expression+patterns+of+inflammatory+and+immune+response+genes+associated+with+obesity+and+NASH+in+morbidly+obese+patients.">Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients.</a> PloS One. 5 (10), e13577 (2010).</li><li>Turnbaugh, P. J., B&#228;ckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-Induced+Obesity+Is+Linked+to+Marked+but+Reversible+Alterations+in+the+Mouse+Distal+Gut+Microbiome.">Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome.</a> Cell Host &amp; Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).</li><li>Singh, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+diet+on+the+gut+microbiome+and+implications+for+human+health.">Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).</li><li>M&#252;ller, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+barrier+impairment+by+high-fat+diet+in+mice+depends+on+housing+conditions.">Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions.</a> Molecular Nutrition &amp; Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).</li></ol>

Стеатогепатит имеет сильную связь с метаболическими аномалиями, такими как ожирение, инсулинорезистентность и дислипидемия15. Многочисленные исследования показывают, что воспаление жировой ткани может стимулировать патогенез диабета типа 2, включая измененные уровни кл?...

Ожирение является многофакторным расстройством и основным фактором риска развития сердечных заболеваний, инсульта, безалкогольного стеатогепатита (Нэш), диабета 2 типа (T2D) и некоторых видов рака. Распространенность ожирения стремительно возрастает во всем мире. Сегодня 2 100 000 000 человек — почти 30% населения мира — страдают ожирением или имеют избыточный вес1. Ожирение-ассоциированные инсулинорезистентность может привести к T2D, когда исчерпаны поджелудочной железы островок бета-клеток не в состоянии компенсировать повышенную потребность в инсулине для поддержания глюкозы гомеостаза2.
Жировая ткань состоит из различных типов клеток, включая адипоциты, эндотелиальные клетки, фибробласты и иммунные клетки. При прогрессировании ожирения изменения количества и активности иммунных клеток могут приводить к низкосортных воспалений гипертрофической жировой ткани3,4. В частности, было установлено, что чрезмерное потребление энергии, сопровождается хронически повышенный уровень глюкозы в крови, триглицеридов и свободных жирных кислот, приводит к адипоцита гипоксии, эндоплазматический ретикулум стресс, нарушение митохондриальной функции и усиление секреции цитокинов, приводящее к активации про-воспалительных жировой иммунной клетки5,6. Прошлые исследования в основном сосредоточены на врожденный иммунитет, но в последнее время адаптивные иммунные клетки (т и в клетки) появились как важные регуляторы гомеостаза глюкозы. Они обладают воспалительными (в том числе CD8+ т-клеток, Th1 и B-клеток) или в первую очередь нормативные функции (в том числе нормативных т (TREG) клетки, Th2 клетки) и может как усугубить или защитить от инсулинорезистентности7,8 , 9. в
Кроме того, несколько механизмов было предложено объяснить, как ожирение увеличивает стеатогепатит, в том числе увеличение производства цитокинов жировой ткани10. Нэш, Прогрессивная форма безалкогольного жирных заболеваний печени и основных бремени для здоровья в развитых странах, гистологически характеризуется раздутый гепатоциты, накопление липидов, фиброз и периклеклеточного воспаления и может прогрессировать до Цирроз, стадия заболевания печени на конечной стадии или гео-клеточная карцинома. Некоторые схемы (например, метионин и холин дефицит диета11), как известно, ИНДУЦИРОВАТЬ Нэш-подобный патологии печени в не-человеческого животных моделей, но большинство из этих подходов не резюмировать человеческие условия НЭО и его метаболические последствия, поскольку они либо требуют конкретных ген нокаутом, не физиологические диетические манипуляции или отсутствие резистентности к инсулину типичный человеческий Нэш. Кроме того, наше понимание основных механизмов метаболических заболеваний в настоящее время основывается на экспериментах, проведенных с лабораторными мышами, размещенный под стандартными конкретными патогеном свободными (SPF) условиями. Эти барьерные сооружения являются аномально гигиеничными и не учитывают микробное разнообразие, с которым приходится сталкиваться людям, что может учитывать трудности в процессе перевода исследований на животных к клиническим подходам12,13 , 14-ое.
Для исследования различных иммунных подмножеств клеток в жировой ткани и печени во время развития инсулинорезистентности и Нэш в продвинутой модели мыши воспроизводства человеческих иммунологических состояний, мышей были размещены в отдельных клетках в полу стерильных условия без барьера. Мыши, размещенный под антигеном подвергается условий развитых Нэш-подобных патологии печени уже после 15 недель с высоким содержанием жиров диеты (ДФД) кормления13. По сравнению с возрастом, сопрягаемом SPF мышей они разработали макровезикулярного стеатоза, печеночной инфильтрации и активации иммунных клеток.
Эта рукопись описывает надежный анализ расхода цитометрии для определения и подсчета подмножеств иммунных клеток из жировой ткани мыши и печени в модели НЭША. Анализ расхода цитометрии позволяет обнаруживать множественные параметры отдельных клеток одновременно, в отличие от подходов РТ-ЦР или иммуногистохимии.
Таким образом, наше исследование предлагает мышь модель краткосрочного HФД для исследования развития резистентности к инсулину и Нэш и основные механизмы, которые также экспонатов верность состояния человека.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">100&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">26G x 5/8 needles&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">35mm Petri Dishes&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">40&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td style="width:169px;">GIBCO</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103127</td>
			<td>AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Analysis software&#160;</td>
			<td>FlowJo 10.0.8 software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">117309</td>
			<td>AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">138411</td>
			<td>AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse CD127 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135023</td>
			<td>AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">123131</td>
			<td>AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135219</td>
			<td>AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108739</td>
			<td>AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101239</td>
			<td>AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV711 anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103255</td>
			<td>AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV785 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100749</td>
			<td>AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:351px;">C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Forschungseinrichtungen f&#252;r experimentelle Medizin (FEM)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CaCl2&#160;</td>
			<td>Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td style="width:119px;">A119.1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Collagenase NB 4G Proved Grade&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SERVA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11427513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:351px;">Collagenase Typ I&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 15ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 50ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DNAse&#160;&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Filter 30&#181;m&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Celltrics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">400422316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FITC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100203</td>
			<td>AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD-LSR Fortessa&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Bioanalytic GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">085021-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">High-fat diet&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SSNIF</td>
			<td>E15741&#8211;34&#160;</td>
			<td>60 kJ% from fat, 19&#8201;kJ% from proteins, and 21&#8201;kJ% from carbohydrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">micro dissecting scissors&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S3146</td>
			<td>used for dissection purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE anti-mouse CD25 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101903</td>
			<td>AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">104417</td>
			<td>AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">107629</td>
			<td>AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td>AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Percoll solution&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103031</td>
			<td>AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108427</td>
			<td>AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Round-Bottom Tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:169px;">STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">38030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TruStain fcX anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101301</td>
			<td>AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">423105</td>
			<td>viablity stain&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes

Ожирение связано с хроническим низкосортным воспалением и инсулинорезистентностью, способствуя увеличению распространенности хронических метаболических заболеваний, таких как диабет 2 типа и безалкогольный стеатогепатит (Нэш). Недавние исследования установили, что про-воспалительные иммунные клетки проникают ожирением гипертрофической жировой ткани и печени. Учитывая возникающим важность иммунных клеток в контексте метаболического гомеостаза, существует критическая потребность в количественной оценке и характеризуют их модификации во время развития диабета 2 типа и НЭГ. Однако, Животные модели, которые индуцируют Патофизиологические особенности, характерные для человеческого НЭША, редки.
В этой статье мы предоставляем подробный протокол для выявления иммунных подмножеств клеток, изолированных от печени и жировой ткани в надежной модели мыши НАСГ, установленных жилья с высоким содержанием жиров (HФД) мышей в неспецифической без патогена (SPF) условия, не барьер не менее семи недель. Мы демонстрируем обработку мышей в не-SPF условиях, переваривание тканей и выявление макрофагов, естественных киллеров (НК) клеток, дендритных клеток, B и т-клеток подмножеств потока цитометрии. Предоставляются репрезентативные потоки тометриметрии от мышей SPF и не-SPF. Для получения надежных и интерпретируя данных, использование антител, точных и точных методов для переваривания тканей и правильного стробирования в опытах цитометрии являются важнейшими элементами.
Вмешательство для восстановления физиологических воздействия антигена у мышей на жилье их в не-SPF условиях и неспецифическое воздействие микробных антигенов может обеспечить соответствующий инструмент для исследования связи между иммунологическими изменениями, диета индуцированной Ожирение и связанных с ними долгосрочных осложнений.

Описанный протокол позволяет охарактеризовать поверхностные маркеры врожденных и адаптивных иммунных клеток, изолированных от Мурина перигонадной жировой ткани и печени, в модели индуцированного диетой НЭША. В этой модели, Нэш был вызван администрацией HFD плюс сахароза (6%) в питьевой ...

Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Простая и надежная диета индуцированной грызунов животных модель безалкогольного стеатогепатит (Нэш) описывается, достигается за счет не-SPF жилья животных и администрация конкретного высокого жира диета. Мы описываем определение печени и жировой подмножеств иммунных клеток, чтобы резюмировать человеческие иммунологические условия, подвергая мышей к экологическим ростков.

Расширенный murine модель безалкогольный стеатогепатит в ассоциации с сахарным диабетом 2 типа

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Этот метод может помочь ответить на вопросы в области иммунометаболизма о вкладе иммунных клеток в ожирение индуцированного воспаления в жировой и стеатогепатит в печеночные ткани. Эти методы были оптимизированы для изоляции жировых и печеночные иммунные клетки в диете индуцированной модели безалкогольного стеатогепатита, достигнутые через неспецифические патогена свободной грызунов жилья. Эти методы могут помочь углубить наше понимание иммунологических механизмов, участвующих в поддержании метаболического гомеостаза.Как правило, лица, новые для этой техники будет бороться с максимизацией урожайности функционально жизнеспособных диссоциированных клеток и создания надлежащего gating в потоке цитометрии. Для создания жировой ткани одноклеточной подвески, спрей груди усыпляемой мыши с 70% этанола, и тщательно сделать пять-шесть сантиметров центрального разреза через интеграмент и брюшной стенки по всей длине грудной клетки подвергать плевральной полости и сердца. Используя 26-калибровочной иглы, ввиснуть по крайней мере 10 миллилитров 0,9% солевого раствора в вершину левого желудочка, и использовать ножницы, чтобы открыть брюшной полости.Затем, вскрыть эпигонадной жировой ткани, и взвесить его. Механически отмежевать жировую ткань на мелкие кусочки в чашке Петри при четырех градусах по Цельсию, прежде чем передать фрагменты ткани в 50-миллилитровую коническую трубку. Промыть чашку Петри с одним миллилитром 0,5%бычьего альбумин сыворотки, или BSA, в PBS, и добавить три миллилитров свежеприготовленной жировой ткани дайджест раствора на грамм жировой ткани в трубку.Через 20 минут при 37 градусах Цельсия и 200 вращениях в минуту добавьте пять миллилитров 0,5%BSA в PBS и поместите жировой дайджест на лед. Тритурировать раствор несколько раз с помощью 10-миллилитрового серологического пипетки и использовать поршень, чтобы пройти раствор через 100-микрометровый ситечко. Разделите фракции тканей центрифугой и используйте пипетки, чтобы отбросить плавающую фракцию адипоцитов.Resuspend стромальной сосудистой фракционной клеточной гранулы в один миллилитр аммония-хлорид-калия, или ACK, лиз буфера, останавливая реакцию лиза с 10 миллилитров 2%fetal теленка сыворотки, или FCS, в PBS через несколько секунд. Затем соберите изолированные белые кровяные тельца путем центрифугации, и повторно посовестить гранулы в 250 микролитров 2%FCS в PBS для подсчета. Урожай печени в конической трубки PBS на льду, прежде чем использовать шприц марки механически разъедать ткани в чашке Петри на четыре градуса по Цельсию.Перенесите расчлененные фрагменты тканей печени в 50-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров раствора теплого пищеварения печени, и промойте чашку Петри тремя миллилитров свежего раствора для переваривания печени. После 20 минут при 37 градусах Цельсия и 200 вращениях в минуту, остановить пищеварение с 20 миллилитров HBSS, и тритурировать навоз ткани несколько раз с 10-миллилитровой серологической пипетки. Используйте поршень, чтобы пройти раствор ткани через 100-микрометровый ситечко, и собирать клетки печени центрифугации.Переусердствойте гранулы в 20 миллилитров свежего HBSS, и удалить матрицу гепатоцитов центрифугации. Соберите супернатант для центрифугации, повторно посовещение гранул в 10 миллилитров 33%низкой плотности вязкости среднего раствора в HBSS. Отделяйте иммунные клетки печени по плотности градиентной центрифугации и повторно помешайте гранулы лейкоцитов в один миллилитр буфера лиза ACK.Через четыре минуты при комнатной температуре, остановитьлиз с 10 миллилитров HBSS, и фильтровать клетки через 30-микрометровый поры ситечко в 15-миллилитровую трубку для центрифугации. Затем, повторно гранулы в 250 микролитров 2%FCS в PBS для подсчета. Для цитометрического анализа потока изолированных популяций лейкоцитов, добавить до трех раз 10 до шести клеток в 100 микролитров 2%FCS в PBS из ткани, представляющие интерес в отдельных полистирола флуоресценции активированной сортировки клеток, или FACS, трубки.Добавьте 10 микролитров антител anti-CD16/CD32 к каждой пробке для того чтобы заблокирует любое non-специфическое связывание на 10 минут на льду, после этого после этого запятнать с совествующим томом смеси антитела и одним микролитером красителя жизнеспособности в образец для того чтобы позволить различеству живых и мертвых клеток. Через 20 минут при четырех градусах Цельсия защищены от света, мыть образцы два раза с двумя миллилитров 2%FCS плюс PBS за стирку, и центрифуга в 300 раз g в течение пяти минут при четырех градусах цельсия. Затем, повторное производство гранул в свежем PBS плюс FCS.Для анализа клеток по цитометрии потока используйте необлибряемый отрицательный контрольный образец для настройки рассеяния вперед и сбоку, а также для регулировки напряжения цитометра потока для обнаружения жизнеспособной популяции лейкоцитов и исключения мусора. Затем запустите одиночные окрашенные образцы управления для многоцветной компенсации перед запуском экспериментальных образцов, собирая по крайней мере пять раз 10 к четырем событиям на трубку. Затем экспорт файлы данных FCS для анализа, и установить стратегию gating для CD45-положительных лейкоцитов, чтобы позволить идентификацию последующих популяций иммунных клеток, представляющих интерес.Здесь показана репрезентативная стратегия гатинга для субпопуляций Т-клеток, включая двойную дискриминацию и жизнеспособность окрашивания в мурин перигонадальный жир. CD45-положительные лейкоциты сначала закрыты для CD4 и CD8, а затем для CD44 и CD62 лиганда, чтобы различать наивную, центральную память, память эффектора и эффектор Т-клеток. CD44-положительные клетки затем дополнительно характеризуется CD127, убийца клеток лектин-как рецептор G1, и запрограммирован смерть-1.Здесь показана стратегия анализа В-клеток, гранулоцитов, естественных клеток-убийц, макрофагов и дендритных клеток. Более высокий процент эффекторной памяти CD4-положительных и CD8-положительных клеток может быть обнаружен в высокожирных диетических мышей, размещенных в условиях, не в которых SPF, в то время как внутрицепочечные наивные CD4-положительные и CD8-положительные Т-клетки оказались значительно ниже у этих животных по сравнению с SPF с высоким содержанием жира диеты мышей на седьмой неделе. Тяжелый стеатоз, в том числе увеличение больших липидных капель в результате макровесикулярного стеатоза, лобкулярного воспаления, гепатоцеллюлярной воздухоплавания, и разрушенная лобкулярная структура находится в с высоким содержанием жира диеты подвергаются мышей в то время как только некоторые мышей SPF дисплей мягкого накопления жира в печени.Кроме того, процент естественных клеток-убийц выше в перигонадальной жировой ткани с высоким содержанием жира диеты подвергаются мышей, в то время как с высоким содержанием жира диета SPF мышей продемонстрировали более высокий процент дендритических клеток. При попытке этой процедуры, важно держать клетки на льду и в темноте, если не указано иное. Теперь вы должны иметь хорошее понимание того, как правильно подготовить одноклеточные суспензии и как изолировать мурин жировой и печеночной ткани для цитометрии потока экспериментов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris Muris Инфекция: Модель Тип 2 иммунитет и воспаление в кишечнике

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Ускоренное диабета 1 типа у мышей Индукционная приемными Передача диабетогенные CD4 + Т-клеток

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Использование изображения Цитометрии для количественного определения патогенных грибов в связи с клетки-хозяева

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Флуоресцентной микроскопии Методы определения жизнеспособности бактерий в ассоциации с клетках млекопитающих

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Выделение и внутривенное введение мышиных костного мозга моноцитов

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Экс Vivo Заражение мышиных эпидермиса с вирусом простого герпеса типа 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Анализ лимфоцитов экстравазации спользование<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель человеческого гематоэнцефалический барьер

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Применение последовательных массаж-как Пертурбации на мышителях и мониторинг результирующих внутримышечных изменений давления

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Высокоэффективная генерация антигена-специфических первичных мышей цитотоксических Т-клеток для функционального тестирования в модели аутоиммунного диабета

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...