Name: an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

Agradecemos a Anke Jurisch, Diana Woellner, Dra. Kathrin Witte y Cornelia Heckmann la asistencia con procedimientos experimentales y Benjamin Tiburzy de Biolegend para comentarios útiles sobre la estrategia de la puerta. J.S. fue apoyado por la beca Helmholtz (ICEMED). Este estudio fue apoyado por becas de la unidad de investigación clínica del Instituto de salud de Berlín (BIH), el "BCRT-Grant" por el Ministerio Federal alemán de educación e investigación y la Fundación Einstein. K.S.-B. y H.-D.V. son financiados por FOR2165.

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud y la ley de bienestar animal bajo la supervisión de nuestro Comité institucional de cuidado y uso de animales. Los protocolos de los animales se realizaron de acuerdo con las directrices éticas institucionales de la Charité Berlin, Alemania, y fueron aprobados por el Landesamt für Gesundheit und Soziales y cumplen con las pautas de llegada.
1. modelo a...

<ol>
	<li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis.</a> BMC Public Health. 9, 88 (2009).</li><li>Prentki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+&#946;+cell+failure+in+type.">Islet &#946; cell failure in type.</a> J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).</li><li>Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+insulin+resistance.">Inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444, 840 (2006).</li><li>Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+immune+system+and+adipose+tissue+in+obesity.">Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+fat,+and+the+emergence+of+immunometabolism.">Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).</li><li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies.">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610 (2011).</li><li>Onodera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+induce+PPAR&#947;-high+FOXP3(+)+regulatory+T+cells.">Adipose tissue macrophages induce PPAR&#947;-high FOXP3(+) regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).</li><li>Calle, E. E., Kaaks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overweight,+obesity+and+cancer:+epidemiological+evidence+and+proposed+mechanisms.">Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).</li><li>Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Nonalcoholic+Steatohepatitis:+Eat,+Delete,+and+Inflame.">Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame.</a> Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice+by+normalizing+environment.">Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment.</a> Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).</li><li>Sbierski-Kind, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Housing+Conditions+Reveal+a+Major+Impact+of+Adaptive+Immunity+on+the+Course+of+Obesity-Induced+Type+2+Diabetes.">Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes.</a> Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).</li><li>Japp, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+immunology+assessed+by+multidimensional+mass+cytometry.">Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).</li><li>Benedict, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease:+An+expanded+review.">Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review.</a> World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Immunity,+and+Metabolic+Disease.">Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+Cells+in+Adipose+Tissue.">The Immune Cells in Adipose Tissue.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 15, 34-38 (2013).</li><li>Bertola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+expression+patterns+of+inflammatory+and+immune+response+genes+associated+with+obesity+and+NASH+in+morbidly+obese+patients.">Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients.</a> PloS One. 5 (10), e13577 (2010).</li><li>Turnbaugh, P. J., B&#228;ckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-Induced+Obesity+Is+Linked+to+Marked+but+Reversible+Alterations+in+the+Mouse+Distal+Gut+Microbiome.">Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome.</a> Cell Host &amp; Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).</li><li>Singh, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+diet+on+the+gut+microbiome+and+implications+for+human+health.">Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).</li><li>M&#252;ller, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+barrier+impairment+by+high-fat+diet+in+mice+depends+on+housing+conditions.">Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions.</a> Molecular Nutrition &amp; Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).</li></ol>

La esteatohepatitis tiene una fuerte asociación con anomalías metabólicas como la obesidad, la resistencia a la insulina y la dislipidemia15. Varios estudios indican que la inflamación del tejido adiposo puede conducir la patogénesis de la diabetes tipo 2, incluidos los niveles alterados de células del sistema inmunitario innato y adaptativo4,5,16,17 . Además, se ...

La obesidad es un trastorno multifactorial y un factor de riesgo importante para desarrollar enfermedades cardíacas, accidentes cerebrovasculares, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes tipo 2 (T2D) y algunos tipos de cáncer. La prevalencia de la obesidad está aumentando rápidamente en todo el mundo. Hoy en día, 2,1 mil millones personas — casi el 30% de la población mundial — son obesas o con sobrepeso1. La resistencia a la insulina asociada a la obesidad puede conducir a T2D, cuando las células beta del islote pancreático agotado no logran compensar la mayor necesidad de insulina para mantener la la homeostasis de la glucosa2.
El tejido adiposo se compone de varios tipos de células, incluyendo adipocitos, células endoteliales, fibroblastos y células inmunitarias. Durante la progresión de la obesidad, los cambios en el número y la actividad de las células inmunitarias pueden provocar una inflamación de bajo grado del tejido adiposo hipertrófico3,4. Específicamente, se ha encontrado que la ingesta excesiva de energía, acompañada de niveles crónicamente elevados de glucosa en sangre, triglicéridos y ácidos grasos libres, conduce a la hipoxia adipocíta, estrés retículo endoplásmico, deterioro de la función mitocondrial y mejora de la secreción de citoquinas, lo que resulta en la activación de las células inmunitarias proinflamatorias de la adiposa5,6. Investigaciones pasadas se han centrado principalmente en la inmunidad innata, pero más recientemente las células inmunes adaptables (células T y B) han surgido como reguladores importantes de la homeostasis de la glucosa. Poseen inflamatorios (incluyendo células t CD8+ , Th1, y células B) o principalmente funciones regulatorias (incluyendo células reguladoras t (treg), células Th2) y pueden exacerbar o proteger contra la resistencia a la insulina7,8 , 9.
Además, se propusieron varios mecanismos para explicar cómo la obesidad aumenta la esteatohepatitis, incluyendo el aumento de la producción de citoquinas por tejido adiposo10. NASH, la forma progresiva de hígado graso no alcohólico y una importante carga sanitaria en los países desarrollados, se caracteriza histológicamente por los hepatocitos en globo, la acumulación de lípidos, la fibrosis y la inflamación pericelular y puede progresar hasta cirrosis, enfermedad hepática terminal o carcinoma hepatocelular. Varios régimen (por ejemplo, la dieta deficiente de metionina y colina11) se sabe que inducen la patología hepática como Nash en modelos animales no humanos, pero la mayoría de estos enfoques no recapitulan las condiciones humanas de Nash y su metabolismo consecuencias, ya sea que requieran un nocaut genético específico, manipulaciones dietéticas no fisiológicas o la falta de resistencia a la insulina típica de NASH humano. Por otra parte, nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes de las enfermedades metabólicas se basa actualmente en experimentos llevados a cabo con ratones de laboratorio alojados bajo condiciones estándar específicas libres de patógenos (SPF). Esas instalaciones de barrera son anormalmente higiénicas y no consideran la diversidad microbiana que los seres humanos tienen que encontrar, lo que puede tener en cuenta las dificultades en el proceso de traducción de los estudios en animales a los enfoques clínicos12,13 , 14.
Para investigar los diferentes subconjuntos de células inmunes en el tejido adiposo y el hígado durante el desarrollo de la resistencia a la insulina y NASH en un modelo avanzado de ratón que reproduce las condiciones inmunológicas humanas, los ratones se alojaron en jaulas individuales en semi estéril condiciones sin barreras. Los ratones alojados bajo condiciones expuestas al antígeno desarrollaron patología hepática como la de NASH ya después de 15 semanas de alimentación con dieta alta en grasas (HFD)13. En comparación con los ratones SPF adaptados a la edad, desarrollaron esteatosis macrovesicular, infiltración hepática y activación de células inmunitarias.
Este manuscrito describe un análisis robusto de citometría de flujo para definir y contar subconjuntos de células inmunitarias del tejido adiposo del ratón y del hígado en un modelo de NASH. El análisis de citometría de flujo permite la detección de múltiples parámetros de células individuales simultáneamente en contraste con los enfoques RT-PCR o inmunohistoquímica.
En Resumen, nuestro estudio ofrece un modelo de ratón de HFD a corto plazo para la investigación del desarrollo de la resistencia a la insulina y NASH y los mecanismos subyacentes que también exhibe la fidelidad a la condición humana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">100&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">26G x 5/8 needles&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">35mm Petri Dishes&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">40&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td style="width:169px;">GIBCO</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103127</td>
			<td>AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Analysis software&#160;</td>
			<td>FlowJo 10.0.8 software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">117309</td>
			<td>AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">138411</td>
			<td>AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse CD127 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135023</td>
			<td>AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">123131</td>
			<td>AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135219</td>
			<td>AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108739</td>
			<td>AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101239</td>
			<td>AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV711 anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103255</td>
			<td>AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV785 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100749</td>
			<td>AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:351px;">C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Forschungseinrichtungen f&#252;r experimentelle Medizin (FEM)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CaCl2&#160;</td>
			<td>Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td style="width:119px;">A119.1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Collagenase NB 4G Proved Grade&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SERVA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11427513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:351px;">Collagenase Typ I&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 15ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 50ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DNAse&#160;&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Filter 30&#181;m&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Celltrics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">400422316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FITC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100203</td>
			<td>AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD-LSR Fortessa&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Bioanalytic GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">085021-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">High-fat diet&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SSNIF</td>
			<td>E15741&#8211;34&#160;</td>
			<td>60 kJ% from fat, 19&#8201;kJ% from proteins, and 21&#8201;kJ% from carbohydrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">micro dissecting scissors&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S3146</td>
			<td>used for dissection purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE anti-mouse CD25 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101903</td>
			<td>AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">104417</td>
			<td>AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">107629</td>
			<td>AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td>AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Percoll solution&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103031</td>
			<td>AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108427</td>
			<td>AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Round-Bottom Tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:169px;">STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">38030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TruStain fcX anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101301</td>
			<td>AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">423105</td>
			<td>viablity stain&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes

La obesidad se asocia con la inflamación crónica de bajo grado y la resistencia a la insulina, contribuyendo a una creciente prevalencia de enfermedades metabólicas crónicas, como la diabetes tipo 2 y la esteatohepatitis no alcohólica (NASH). Investigaciones recientes han establecido que las células inmunes pro-inflamatorias infiltran tejido adiposo hipertrófico obeso y el hígado. Dada la importancia emergente de las células inmunitarias en el contexto de la homeostasis metabólica, hay una necesidad crítica de cuantificar y caracterizar su modificación durante el desarrollo de la diabetes tipo 2 y NASH. Sin embargo, los modelos animales que inducen características fisiopatológicas típicas del NASH humano son escasos.
En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para identificar subconjuntos de células inmunitarias aisladas del hígado y el tejido adiposo en un modelo de ratón confiable de NASH, establecido por la vivienda de ratones con dieta alta en grasas (HFD) bajo condiciones no específicas de patógenos (SPF) sin un barrera durante al menos siete semanas. Demostramos el manejo de ratones en condiciones no SPF, digestión de los tejidos y la identificación de macrófagos, células asesinas naturales (NK), células dendríticas, B y células T subconjuntos por citometría de flujo. Se proporcionan diagramas de citometría de flujo representativos de ratones con SPF HFD y ratones que no son SPF. Para obtener datos fiables e interpretables, el uso de anticuerpos, métodos precisos y precisos para la digestión de los tejidos y la correcta compuerta en los experimentos de citometría de flujo son elementos críticos.
La intervención para restaurar la exposición fisiológica del antígeno en ratones alojándolos en condiciones no SPF y la exposición no específica a antígenos microbianos podría proporcionar una herramienta relevante para investigar el vínculo entre las alteraciones inmunológicas, inducida por la dieta obesidad y complicaciones relacionadas a largo plazo.

El protocolo descrito permite la caracterización de marcadores superficiales de células inmunitarias innatas y adaptativas aisladas del tejido adiposo de la murina perigonadal y del hígado en un modelo de NASH inducido por la dieta. En este modelo, NASH fue inducido por la administración de HFD más sacarosa (6%) en el agua potable durante 7 a 15 semanas en ratones C57Bl/6J, como se informó anteriormente13. Es importante destacar que los ratones estaban alojados en condiciones semi estériles...

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An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Se describe un modelo animal simple y confiable para la esteatohepatitis no alcohólica inducida por la dieta, que se logra a través de la carcasa no SPF de los animales y la administración de una dieta alta en grasas específica. Describimos la identificación de los subconjuntos de células inmunes hepáticas y adiposas para recapitular las condiciones inmunológicas humanas exponiendo ratones a gérmenes ambientales.

Un modelo murino avanzado para esteatohepatitis no alcohólica en asociación con diabetes tipo 2

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo del inmunometabolismo sobre la contribución de las células inmunitarias a la inflamación inducida por la obesidad en adiposo y esteatohepatitis en el tejido hepático. Estas técnicas se han optimizado para el aislamiento de células inmunitarias adiposas y hepáticas en un modelo inducido por la dieta de esteatohepatitis no alcohólica lograda a través de una carcasa de roedores libre de patógenos no específica. Estos métodos pueden ayudar a profundizar nuestra comprensión de los mecanismos inmunológicos involucrados en el mantenimiento de la homeostasis metabólica.Generalmente, los individuos nuevos en esta técnica tendrán problemas para maximizar el rendimiento de las células disociadas funcionalmente viables y establecer el gating adecuado en la citometría de flujo. Para generar una suspensión de una sola célula de tejido adiposo, rocíe el pecho de un ratón eutanizado con 70%etanol, y cuidadosamente haga una incisión central de cinco a seis centímetros a través del integumento y la pared abdominal a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural y el corazón. Con una aguja de calibre 26, inyecte al menos 10 mililitros de solución salina al 0,9% en el ápice del ventrículo izquierdo y utilice tijeras para abrir la cavidad peritoneal.Luego, disecciona el tejido adiposo epigonadal, y pesa. Disocia mecánicamente el tejido adiposo en trozos finos en una placa de Petri a cuatro grados Celsius antes de transferir los fragmentos de tejido a un tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague el plato de Petri con un mililitro de albúmina sérica 0.5%bovina, o BSA, en PBS, y agregue tres mililitros de solución digestiva de tejido adiposo recién preparada por gramo de tejido adiposo al tubo.Después de 20 minutos a 37 grados celsius y 200 rotaciones por minuto, agregue cinco mililitros de 0.5%BSA en PBS, y coloque el resumen adiposo en hielo. Triturar la solución varias veces con una pipeta serológica de 10 mililitros, y utilizar un émbolo para pasar la solución a través de un colador de 100 micrómetros. Separe las fracciones tisulares por centrifugación y use una pipeta para desechar la fracción de adipocitos flotantes.Resuspender el gránulo de células de fracción vascular estromal en un mililitro de amonio-cloruro-potasio, o ACK, tampón de lelisis, deteniendo la reacción de la lysis con 10 mililitros de 2%suero de ternera fetal, o FCS, en PBS después de unos segundos. Luego, recoger los glóbulos blancos aislados por centrifugación, y resuspender el pellet en 250 microlitros de 2%FCS en PBS para el conteo. Cosecha el hígado en un tubo cónico de PBS sobre hielo antes de usar sellos de jeringa para disociar mecánicamente el tejido en una placa de Petri a cuatro grados centígrados.Transfiera los fragmentos de tejido hepático diseccionados en un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de solución de digestión hepática caliente, y enjuague el plato Petri con tres mililitros de solución de digestión hepática fresca. Después de 20 minutos a 37 grados centígrados y 200 rotaciones por minuto, detenga la digestión con 20 mililitros de HBSS, y triturar la lodo tisular varias veces con una pipeta serológica de 10 mililitros. Utilice un émbolo para pasar la solución de tejido a través de un colador de 100 micrómetros y recoger las células hepáticas por centrifugación.Resuspender el pellet en 20 mililitros de HBSS fresco, y eliminar la matriz de hepatocitos por centrifugación. Recoger el sobrenadante para centrifugación, resuspendiendo el pellet en 10 mililitros de 33% de baja densidad de densidad gradiente de solución media en HBSS. Separe las células inmunitarias hepáticas por centrifugación de gradiente de densidad, y resuspenda el pellet de leucocitos en un mililitro de tampón de lisis ACK.Después de cuatro minutos a temperatura ambiente, detenga la lelisis con 10 mililitros de HBSS, y filtre las células a través de un colador de poro de 30 micrómetros en un tubo de 15 mililitros para la centrifugación. Luego, resuspender el pellet en 250 microlitros de 2%FCS en PBS para el conteo. Para el análisis citométrico de flujo de las poblaciones aisladas de leucocitos, sume hasta tres veces 10 a las seis células en 100 microlitros de 2%FCS en PBS desde el tejido de interés en la clasificación celular activada por fluorescencia de poliestireno individual, o FACS, tubos.Añadir 10 microlitros de anticuerpos anti-CD16/CD32 a cada tubo para bloquear cualquier unión no específica durante 10 minutos en hielo, seguido de tinción con el volumen adecuado de mezcla de anticuerpos y un microlitro de tinte de viabilidad por muestra para permitir la discriminación de células vivas y muertas. Después de 20 minutos a cuatro grados centígrados protegidos de la luz, lave las muestras dos veces con dos mililitros de 2%FCS más PBS por lavado, y centrífuga a 300 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego, resuspender el pellet en PBS fresco más FCS.Para analizar las células por citometría de flujo, utilice una muestra de control negativo no manchada para establecer la dispersión hacia adelante y hacia un lado, y ajuste las tensiones del citometro de flujo para detectar la población viable de leucocitos y para excluir los desechos. A continuación, ejecute muestras de control de manchas individuales para una compensación multicolor antes de ejecutar las muestras experimentales, recogiendo al menos cinco veces 10 a los cuatro eventos por tubo. A continuación, exporte los archivos de datos FCS para su análisis y establezca la estrategia de medición para los leucocitos CD45 positivos para permitir la identificación de las poblaciones de células inmunitarias subsiguientes de interés.Aquí, se muestra una estrategia representativa de gating para subpoblaciones de células T que incluye discriminación por doblete y tinción de viabilidad en la grasa perigonadal murina. Los leucocitos CD45 positivos se cierran primero para CD4 y CD8 y, posteriormente, para que el ligando CD44 y CD62 discrimine entre células T ingenuas, memoria central, efectores y efectores. Las células CD44 positivas se caracterizan con CD127, receptor similar a la lectina de células asesinas G1 y muerte programada-1.Aquí, se muestra la estrategia de gating para analizar células B, granulocitos, células asesinas naturales, macrófagos y células dendríticas. Un mayor porcentaje de memoria efectora CD4 positivo y células CD8 positivas se puede detectar en ratones de dieta alta en grasas alojados en condiciones no SPF, mientras que las células T intrahepáticas ingenuas CD4 positivas y CD8 positivas se encuentran considerablemente más bajas en estos animales en comparación con los ratones con dieta baja en grasas SPF en la semana siete. Esteatosis grave, incluyendo un aumento de grandes gotas de lípidos que resultan en esteatosis macrovesicular, inflamación lobular, globo hepatocelular, y la estructura lobular destruida se encuentra en ratones expuestos a dieta alta en grasa, mientras que sólo algunos ratones SPF muestran una leve acumulación de grasa en el hígado.Además, el porcentaje de células asesinas naturales es mayor en el tejido adiposo perigonadal de ratones expuestos con dieta alta en grasas, mientras que los ratones SPF de dieta alta en grasas demostraron mayores porcentajes de células dendríticas. Al intentar este procedimiento, es importante mantener las células en hielo y en la oscuridad a menos que se indique lo contrario. Ahora debe tener una buena comprensión de cómo preparar correctamente las suspensiones de una sola célula y cómo aislar el tejido adiposo y hepático murino para los experimentos de citometría de flujo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris infección: un modelo de tipo 2 inmunidad y la inflamación en el intestino

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Investigación

Inmunología e Infección

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescencia métodos de microscopía para determinar la viabilidad de las bacterias en asociación con las células de mamíferos

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infección de murino Epidermis con virus herpes simplex tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Aplicación de Perturbaciones Consistentes Similares al Masaje en Los terneros de ratón y Monitoreo de los Cambios de Presión Intramuscular Resultantes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...