Name: an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

Biz deneysel prosedürler ve gating stratejisi üzerinde yararlı yorumlar için Biolegend gelen Benjamin Tiburzy yardım için Anke hukuk, Diana Woellner, Dr Kathrin Witte ve Cornelia Heckmann teşekkür ederiz. JS, Helmholtz Grant (ıCEMED) tarafından destekleniyordu. Bu çalışmada, Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı ve Einstein Vakfı tarafından "BCRT-Grant" Berlin Sağlık Enstitüsü (BH) klinik araştırma birimi 'nden hibe tarafından destekleniyordu. KAHRAMAN-B. ve H.-D.V. tarafından finanse edilir FOR2165.

Bu çalışma, kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi gözetiminde Ulusal Sağlık Enstitüleri ve hayvan refah Yasası 'nın bakım ve laboratuar hayvanlarının kullanımı kılavuzu 'Na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan protokolleri, Almanya 'nın Charité Berlin 'in kurumsal etik yönergelerine göre yürütülmüştür ve Landesamt für Gesundheit und soziales tarafından onaylanmış ve VARıŞ yönergelerine uymalıdır.
1. diyet kaynaklı hayvan modeli steatohepatiti</...

<ol>
	<li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis.</a> BMC Public Health. 9, 88 (2009).</li><li>Prentki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+&#946;+cell+failure+in+type.">Islet &#946; cell failure in type.</a> J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).</li><li>Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+insulin+resistance.">Inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444, 840 (2006).</li><li>Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+immune+system+and+adipose+tissue+in+obesity.">Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+fat,+and+the+emergence+of+immunometabolism.">Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).</li><li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies.">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610 (2011).</li><li>Onodera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+induce+PPAR&#947;-high+FOXP3(+)+regulatory+T+cells.">Adipose tissue macrophages induce PPAR&#947;-high FOXP3(+) regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).</li><li>Calle, E. E., Kaaks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overweight,+obesity+and+cancer:+epidemiological+evidence+and+proposed+mechanisms.">Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).</li><li>Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Nonalcoholic+Steatohepatitis:+Eat,+Delete,+and+Inflame.">Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame.</a> Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice+by+normalizing+environment.">Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment.</a> Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).</li><li>Sbierski-Kind, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Housing+Conditions+Reveal+a+Major+Impact+of+Adaptive+Immunity+on+the+Course+of+Obesity-Induced+Type+2+Diabetes.">Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes.</a> Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).</li><li>Japp, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+immunology+assessed+by+multidimensional+mass+cytometry.">Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).</li><li>Benedict, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease:+An+expanded+review.">Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review.</a> World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Immunity,+and+Metabolic+Disease.">Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+Cells+in+Adipose+Tissue.">The Immune Cells in Adipose Tissue.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 15, 34-38 (2013).</li><li>Bertola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+expression+patterns+of+inflammatory+and+immune+response+genes+associated+with+obesity+and+NASH+in+morbidly+obese+patients.">Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients.</a> PloS One. 5 (10), e13577 (2010).</li><li>Turnbaugh, P. J., B&#228;ckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-Induced+Obesity+Is+Linked+to+Marked+but+Reversible+Alterations+in+the+Mouse+Distal+Gut+Microbiome.">Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome.</a> Cell Host &amp; Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).</li><li>Singh, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+diet+on+the+gut+microbiome+and+implications+for+human+health.">Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).</li><li>M&#252;ller, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+barrier+impairment+by+high-fat+diet+in+mice+depends+on+housing+conditions.">Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions.</a> Molecular Nutrition &amp; Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).</li></ol>

Steatohepatitin obezite, insülin direnci ve dislipidemi15gibi metabolik anomaliler ile güçlü bir ilişkisi vardır. Çoklu çalışmalar, yağ doku iltihabı tip 2 diyabet patogenezi sürücü olduğunu gösterir, hem doğuştan ve adaptif bağışıklık sistemi hücreleri değişen seviyeleri de dahil olmak üzere4,5,16,17 . Buna ek olarak, obezite karaciğer kompl...

Obezite multifokal bir bozukluk ve kalp hastalığı, inme, alkolsüz steatohepatit (NASH), tip 2 diyabet (T2D) ve bazı kanser türleri geliştirmek için önemli bir risk faktörüdür. Obezite prevalansı hızla küresel olarak artmaktadır. Bugün, 2.100.000.000 kişi-dünyanın nüfusu yaklaşık% 30-ya obez ya da kilolu1vardır. Obezite-ilişkili insülin direnci T2D için yol açabilir, zaman tükenmiş pankreatik Islet Beta hücreleri glikoz homeostazı korumak için insülin için artan ihtiyaç telafi etmek için başarısız2.
Adipoz dokusu adipanosit, endotel hücreler, fibroblastlar ve immün hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücre türlerinden oluşur. Obezitenin ilerlemesi sırasında, immün hücrelerin sayısının ve aktivitesindeki değişiklikler hipertrofik adipoz dokusunun düşük dereceli iltihaplanmasına yol açabilir3,4. Özellikle, aşırı enerji alımı, kronik yüksek kan şekeri, trigliserid ve serbest yağ asitleri seviyeleri ile birlikte, adiposit hipoksi, endoplazmik retikulum stres, bozulmuş mitokondriyal fonksiyon ve yol açar bulunmuştur Gelişmiş sitokin salgılanması, Pro-inflamatuar yağ immün hücrelerin aktivasyonu ile sonuçlanan5,6. Geçmiş araştırmalar esas olarak doğuştan gelen bağışıklık odaklı, ama daha yakın zamanda adaptif bağışıklık hücreleri (T ve B hücreleri) glikoz homeostaz önemli regülatörler olarak ortaya çıkmıştır. İnflamatuar (CD8+ T hücreleri, Th1 ve B hücreleri dahil) veya öncelikle düzenleyici fonksiyonlar (düzenleyici T (Treg) hücreleri, TH2 hücreleri dahil) ve hem şiddetlendirebilir ya da insülin direnci karşı korumak7,8 , 9' a kadar.
Ayrıca, obezite steatohepatiti nasıl artırdığını açıklamak için çeşitli mekanizmalar önerildi, adipoz dokusu ile sitokinlerin artan üretimi de dahil olmak üzere10. Fizyolojik olmayan yağlı karaciğer hastalığının ilerici formu ve gelişmiş ülkelerde büyük bir sağlık yükünü kullanarak histolojik olarak balonlu hepatositler, lipid birikimi, fibrozis ve perikelüler inflamasyon ile karakterize edilir ve Siroz, son aşama karaciğer hastalığı veya hepatosellüler karsinom. Çeşitli rejim (örneğin metiyonin ve kolin eksikliği diyet11) olmayan insan hayvan modellerinde Nash benzeri karaciğer patolojisine neden olduğu bilinmektedir, ama bu yaklaşımların çoğu Nash insan koşulları ve metabolik özetlemek yok Onlar ya spesifik gen nakavt, fizyolojik olmayan diyet manipülasyonları veya eksikliği insülin direnci insan NASH tipik gerektirir gibi sonuçlar. Ayrıca, metabolik hastalıkların temel mekanizmalarının anlayışımız Şu anda standart spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında bulunan laboratuar fareler ile yürütülen deneyler dayanmaktadır. Bu bariyer tesisleri anormal hijyen ve insanlar karşılaşmak zorunda mikrobiyal çeşitlilik dikkate değil, hangi klinik yaklaşımlar hayvan çalışmaları çeviri sürecinde zorluklar için hesap olabilir12,13 , 14oldu.
İnsan immünolojik koşulları üreten gelişmiş bir fare modelinde insülin direnci ve Nash gelişimi sırasında adipoz doku ve karaciğer farklı immün hücre alt kümeleri araştırmak için, fareler yarı steril bireysel kafeslerde yer aldı Bariyersiz koşullar. Fareler antijen maruz koşullar altında bulunan NASH-benzeri karaciğer patolojisi zaten 15 hafta yüksek yağlı diyet (HFD) besleme13sonra geliştirilmiştir. Yaş eşlemeli SPF fareler ile karşılaştırıldığında macrovesicular steatosis, hepatik infiltrasyon ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu geliştirdi.
Bu yazıda, NASH modelinde fare adipoz dokusu ve karaciğerinden bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlamak ve saymak için sağlam bir akış sitometri Analizi açıklanmaktadır. Akış sitometri analizi, RT-PCR veya immünhistokimya yaklaşımlarının aksine, tek hücrelerin birden çok parametrenin aynı anda algılanmasını sağlar.
Özetle, bizim çalışma insülin direnci ve NASH ve aynı zamanda insan durumuna sadakat sergiler altta yatan mekanizmaları gelişimini araştırmak için kısa vadeli HFD bir fare modeli sunuyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">100&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">26G x 5/8 needles&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">35mm Petri Dishes&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">40&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td style="width:169px;">GIBCO</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103127</td>
			<td>AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Analysis software&#160;</td>
			<td>FlowJo 10.0.8 software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">117309</td>
			<td>AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">138411</td>
			<td>AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse CD127 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135023</td>
			<td>AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">123131</td>
			<td>AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135219</td>
			<td>AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108739</td>
			<td>AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101239</td>
			<td>AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV711 anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103255</td>
			<td>AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV785 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100749</td>
			<td>AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:351px;">C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Forschungseinrichtungen f&#252;r experimentelle Medizin (FEM)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CaCl2&#160;</td>
			<td>Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td style="width:119px;">A119.1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Collagenase NB 4G Proved Grade&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SERVA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11427513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:351px;">Collagenase Typ I&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 15ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 50ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DNAse&#160;&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Filter 30&#181;m&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Celltrics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">400422316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FITC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100203</td>
			<td>AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD-LSR Fortessa&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Bioanalytic GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">085021-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">High-fat diet&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SSNIF</td>
			<td>E15741&#8211;34&#160;</td>
			<td>60 kJ% from fat, 19&#8201;kJ% from proteins, and 21&#8201;kJ% from carbohydrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">micro dissecting scissors&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S3146</td>
			<td>used for dissection purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE anti-mouse CD25 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101903</td>
			<td>AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">104417</td>
			<td>AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">107629</td>
			<td>AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td>AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Percoll solution&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103031</td>
			<td>AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108427</td>
			<td>AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Round-Bottom Tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:169px;">STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">38030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TruStain fcX anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101301</td>
			<td>AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">423105</td>
			<td>viablity stain&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes

Obezite kronik düşük dereceli inflamasyon ve insülin direnci ile ilişkilidir, tip 2 diyabet ve alkolsüz steatohepatitler (NASH) gibi kronik metabolik hastalıkların artan prevalansı katkıda bulunur. Son araştırmalar, Pro-inflamatuar immün hücrelerin obez hipertrofik yağ dokusu ve karaciğer infiltrasyon kurdu. Metabolik homeostaz bağlamında bağışıklık hücrelerinin ortaya çıkan önemi göz önüne alındığında, kritik bir ihtiyaç türü 2 diyabet ve NASH gelişimi sırasında değişiklik ölçmek ve karakterize etmektir. Ancak, insan NASH tipik patofizyolojik özellikleri neden hayvan modelleri seyrek vardır.
Bu yazıda, yüksek yağlı diyet (HFD) fareler tarafından kurulan, özel olmayan patojen içermeyen (SPF) koşullar altında, bir NASH 'in güvenilir bir fare modelinde karaciğer ve adipoz dokusundan izole edilen bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. en az yedi hafta için bariyer. SPF olmayan koşullarda farelerin işlenmesini, dokuların sindirimi ve makrofajların, doğal katil (NK) hücrelerinin, dendritik hücrelerin, B ve T hücresi alt setlerinin akış sitometri tarafından belirlenmesini gösteriyoruz. SPF HFD fareler ve SPF olmayan farelerden temsilci akış sitometri araziler sağlanmaktadır. Güvenilir ve yorumlanabilir veriler elde etmek için, antikorların kullanımı, doku sindirimi için doğru ve hassas Yöntemler ve akış sitometri deneylerinde uygun şekilde gating önemli unsurlardır.
SPF dışı koşullarda ve mikrobiyal antijenlere spesifik olmayan maruz kalmalarına neden olan farelerde fizyolojik antijen pozlamasını geri yükleme müdahalesi, immünolojik değişiklikler arasındaki bağlantıyı araştırmak için ilgili bir araç sağlayabilir, diyet kaynaklı Obezite ve ilgili uzun vadeli komplikasyonlar.

Açıklanan protokol, diyet kaynaklı NASH modelinde murine perigonadal adipoz doku ve karaciğerden izole edilmiş, doğuştan ve adaptif immün hücrelerin yüzey işaretleyicilerinin karakterize edilmesini sağlar. Bu modelde, Nash HFD artı sakaroz (% 6) yönetimi ile indüklenmiş oldu İçme suyunda 7 ila 15 hafta C57Bl/6J fareler, daha önce bildirilen13. Önemlisi, fareler yarı steril koşullarda yer aldı ve böylece, deney boyunca çevresel antijenlere maruz. SPF koşullarında yer alan...

Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Alkolsüz steatohepatiti için basit ve güvenilir bir diyet kaynaklı kemirgen hayvan modeli (NASH) tarif edilir, hayvanlar ve özel bir yüksek yağ diyet uygulanması SPF olmayan konut aracılığıyla elde. Biz karaciğer ve adipoz immün hücre alt kümeleri tanımlamak için insan immünolojik koşulları farları çevresel mikroplar maruz tarafından yeniden tanımlamakta.

Tip 2 diyabet ile Ilişkisi olmayan alkollü steatohepatit için gelişmiş bir Murine modeli

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Bu yöntem, immünmetabolizma alanındaki immünmetabolizma alanındaki soruların yanıtlanarak, immün hücrelerin obeziteye bağlı inflamasyona katkısı ve karaciğer dokusunda steatohepatit yardımcı olabilir. Bu teknikler non-spesifik patojen içermeyen kemirgen muhafaza yoluyla elde edilen nonalkolik steatohepatit diyet kaynaklı bir model yağ ve hepatik bağışıklık hücrelerinin izolasyon uğrup için optimize edilmiştir. Bu yöntemler metabolik homeostazın bakımında rol oynayan immünolojik mekanizmaları anlamamızı derinleştirmeye yardımcı olabilir.Genel olarak, bu teknik yeni bireyler işlevsel olarak canlı ayrıştırılmış hücrelerin verimini maksimize ve akış sitometri uygun gating kurma ile mücadele edecek. Bir yağ dokusu tek hücreli süspansiyon oluşturmak için,% 70 etanol ile ötenazi li bir farenin göğüs sprey, ve dikkatle plevral kavite ve kalp ortaya çıkarmak için göğüs kafesi tüm uzunluğu boyunca integument ve karın duvarı ile beş ila altı santimetre merkezi kesi yapmak. 26-gauge iğne kullanarak, sol ventrikül apeks içine% 0.9 tuzlu çözeltien az 10 mililitre enjekte ve periton boşluğu açmak için makas kullanın.Sonra, epigonadal yağ dokusunu inceleyin ve tartın. Doku parçalarını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmadan önce, yağ dokusunu dört derece santigrat derecede bir Petri kabında ince parçalara ayırın. Petri kabını PBS'de %0,5 büyükbaş hayvan serum albumini veya BSA mililitresi ile durulayın ve tüpe yağ dokusunun gramı başına üç mililitre taze hazırlanmış yağ dokusu sindirimi çözeltisi ekleyin.37 santigrat derece ve dakikada 200 rotasyon 20 dakika sonra, PBS 0.5% BSA beş mililitre ekleyin ve buz üzerinde yağ sindirimi yerleştirin. Çözeltiyi 10 mililitrelik serolojik pipetle birden fazla triturate ve 100 mikrometrelik bir süzgeçten çözeltiyi geçirmek için bir piston kullanın. Santrifüj ile doku fraksiyonları ayırın ve yüzen adiposit fraksiyonu atmak için bir pipet kullanın.Birkaç saniye sonra PBS'de 10 mililitre fetal baldır serumu veya FCS ile lisis reaksiyonu durdurularak, bir mililitre amonyum-klorür-potasyum veya ACK,lysis tamponundaki stromal vasküler fraksiyon hücre peletini yeniden askıya alın. Sonra, santrifüj tarafından izole beyaz kan hücreleri toplamak ve sayma için PBS% 2 FCS 250 mikrolitre pelet resuspend. Dört santigrat derecede bir Petri kabındaki dokuyu mekanik olarak ayrıştırmak için şırınga pulları kullanmadan önce karaciğeri buz üzerinde konik bir PBS tüpüne toplayın.Parçalanmış karaciğer dokusu parçalarını 10 mililitre sıcak karaciğer sindirim solüsyonu içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve Petri kabını üç mililitre taze karaciğer sindirim çözeltisi ile durulayın. 37 santigrat derece ve dakikada 200 rotasyon 20 dakika sonra, HBSS 20 mililitre ile sindirimi durdurmak ve 10 mililitreserological pipet ile doku bulamaç birden fazla kez triturate. 100 mikrometrelik bir süzgeç yoluyla doku çözeltisi geçmek için bir piston kullanın ve santrifüj ile karaciğer hücreleri toplamak.Taze HBSS 20 mililitre pelet resuspend ve santrifüj ile hepatosit matris kaldırın. HBSS'de %33 düşük viskoziteli yoğunluk gradyan orta çözeltinin 10 mililitreiçinde peleti yeniden sulandırın. Yoğunluk gradyan santrifüj ile karaciğer bağışıklık hücrelerini ayırın ve ACK lysis tampon bir mililitre lökosit pelet resuspend.Oda sıcaklığında dört dakika sonra, 10 mililitre HBSS ile lysis durdurun ve santrifüj için 15 mililitrelik bir tüp içine 30 mikrometre gözenek süzgeci ile hücreleri filtre. Daha sonra, sayma için PBS% 2 FCS 250 mikrolitre pelet resuspend. İzole lökosit popülasyonlarının akış sitometrik analizi için, pbs'de %2 FCS'nin 100 mikrolitresinde altı hücreye üç kat 10'a kadar ekleyip, ilgi dokusundan bireysel polistiren floresan aktif hücre sıralamasına veya FACS, tüplere ekleyin.Buz üzerinde 10 dakika boyunca spesifik olmayan herhangi bir bağlamayı engellemek için her tüpe 10 mikrolitre anti-CD16/CD32 antikor ekleyin, ardından canlı ve ölü hücre ayrımcılığına izin vermek için numune başına uygun hacimde antikor karışımı ve bir mikrolitre canlı boya ile boyama yapın. Işıktan korunan dört santigrat derecede 20 dakika sonra, numuneleri yıkama başına %2 FCS artı PBS'nin iki mililitresi ile iki kez yıkayın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın. Sonra, taze PBS artı FCS pelet resuspend.Akış sitometrisi ile hücreleri analiz etmek için, ileri ve yan dağılım ayarlamak için lekelenmemiş bir negatif kontrol örneği kullanın ve geçerli lökosit popülasyonu tespit etmek ve enkaz hariç tutmak için akış sitometrevoltajlarını ayarlayın. Daha sonra, deney numunelerini çalıştırmadan önce çok renkli kompanzasyon için tek lekeli kontrol numuneleri çalıştırın ve tüp başına dört olaydan en az beş kat 10 toplayın. Daha sonra, analiz için FCS veri dosyalarını dışa aktarın ve sonraki bağışıklık hücre popülasyonlarının tanımlanmasına olanak sağlayacak ŞEKILDE CD45-pozitif lökositler için gating stratejisini ayarlayın.Burada, çift ayrımcılık ve rürin perigonadal yağda canlılık boyama dahil olmak üzere T hücre alt popülasyonları için temsili bir gating stratejisi gösterilmiştir. CD45-pozitif lökositler ilk cd4 ve CD8 için ve daha sonra CD44 ve CD62 ligand için naif, merkezi bellek, efektör bellek ve efektör T hücreleri arasında ayrım yapmak için kapılı. CD44-pozitif hücreler daha sonra CD127, öldürücü hücre lektin benzeri reseptör G1 ve programlanmış ölüm-1 ile karakterizedir.Burada, B hücreleri, granülositler, doğal öldürücü hücreler, makrofajlar ve dendritik hücreleri analiz etmek için gating stratejisi gösterilmiştir. SPF olmayan koşullarda bulunan yüksek yağlı diyet farelerde daha yüksek bir etkileyici bellek CD4-pozitif ve CD8-pozitif hücreler tespit edilebilirken, intrahepatik naif CD4-pozitif ve CD8-pozitif T hücrelerinin bu hayvanlarda spf yüksek yağlı diyet farelere göre yedi hafta daki yüksek yağlı diyet farelere göre oldukça düşük olduğu saptanmıştır. Makrovesiküler steatoz, lobüler inflamasyon, hepatosellüler balonlama ile sonuçlanan büyük lipid damlacıklarının artması da dahil olmak üzere şiddetli steatoz, ve yok edilmiş lobüler yapı yüksek yağlı diyet maruz farelerde bulunurken sadece bazı SPF farelerkaraciğerde hafif bir yağ birikimi gösterir.Buna ek olarak, doğal öldürücü hücrelerin yüzdesi yüksek yağlı diyet maruz farelerin perigonadal yağ dokusunda daha yüksek, yüksek yağlı diyet SPF fareler dendritik hücrelerin daha yüksek yüzdeleri gösterdi ise. Bu yordamı denerken, aksi belirtilmedikçe hücreleri buz üzerinde ve karanlıkta tutmak önemlidir. Şimdi düzgün tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır ve nasıl akış sitometri deneyleriçin murine adipoz ve hepatik doku izole etmek.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Enfeksiyon: Gut Tip 2 Bağışıklık ve İnflamasyon Bir Model

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Ana Hücreler ile Derneği Patojen Mantarlar miktarının Image for Sitometrinin kullanın

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Fare Buzağılarına Tutarlı Masaj Benzeri Pertürbasyonların Uygulanması ve Bunun Sonucu Kas içi Basınç Değişikliklerinin İzlenmesi

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...