Name: preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

ويرغب المؤلفون في الاعتراف بالطلاب في جامعه لونغوود في 324 BIOL (علم الوراثة) والطلاب في تشيم 403 (المختبر الكيميائي المتقدم لحل المشكلات) الذين شاركوا في الاعداد الاولي واختبار الإثمد والرصاص الحيوي. وقد تم تصور فكره MicRoboCop في ورشه عمل GCAT SynBIO (الصيف 2014) ، والتي يتم تمويلها من قبل NSF ومعهد هوارد هيوز الطبي والتي تستضيفها جامعه ميريلاند مقاطعه بالتيمور. ويعترف المؤلفون أيضا بالتمويل الوارد من كليه كوك-كول للفنون والعلوم بجامعه لونغوود ومنحه خريجي GCAT SynBio.

ملاحظه: يتم تقديم التوليف من e. كولاي التعبير عن العروض.
1. اعداد الحمض النووي البلازميد من e. كولاي
<ol><li>ذوبان e. القولونية التي تحتوي علي البلازميد مع جين عروض العروض وجين المقاومة الامبيسلين وتنمو e. كولاي علي المرق لوريا (LB) أجار لوحات تحتوي علي 100 ميكروغر?...

<ol>
	<li>Eschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;The+Story+of+the+Real+Canary+in+the+Coal+Mine.&#34;.">&#34;The Story of the Real Canary in the Coal Mine.&#34;.</a> The Smithsonian Magazine. , (2016).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors &#38; Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+genetically+engineered+microbial+whole-cell+biosensors+for+combined+chemosensing.">Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).</li><li>Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gunshot+Residue+and+Associated+Materials-A+Review.">Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).</li><li>Bell, S., Seitzinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+binary+presumptive+assays+to+probabilistic+assessments:+Differentiation+of+shooters+from+non-shooters+using+IMS,+OGSR,+neural+networks,+and+likelihood+ratios.">From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios.</a> Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).</li><li>O&#39;Mahony, A. M., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Detection+of+Gunshot+Residue+for+Forensic+Analysis:+A+Review.">Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review.</a> Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).</li><li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Biosensor+Technology+for+Potential+Applications+-+An+Overview.">Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).</li><li>Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralogous+Regulators+ArsR1+and+ArsR2+of+Pseudomonas+putida+KT2440+as+a+Basis+for+Arsenic+Biosensor+Development.">Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).</li><li>Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Biological+Organisms+as+Chemical+Sensors:+The+MicRoboCop+Project.">Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project.</a> Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).</li><li>Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+the+pbr+lead+resistance+determinant+of+Ralstonia+metallidurans+CH34.">Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34.</a> Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).</li><li>Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+coordination+of+Pb(II)+is+involved+in+the+PbrR-dependent+activation+of+the+lead-resistance+promoter,+PpbrA,+from+Cupriavidus+metallidurans+CH34.">Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34.</a> Bmc Microbiology. 12, (2012).</li><li>Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene+by+an+Escherichia+coli+bioreporter:+performance+enhancement+by+directed+evolution.">Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).</li><li>Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Guns+in+America:+The+Debate+Over+Lead+Based+Bullets.&#34;.">&#34;Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.&#34;.</a> Newsweek. , (2017).</li><li>Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAAS+Determination+of+Antimony,+Barium,+and+Lead+Levels+in+Gunshot+Residue+Swabs:+An+Application+in+Forensic+Chemistry.">GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry.</a> Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).</li><li>Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+and+Behavior+of+Gunshot+Residue-A+Review.">Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).</li><li>Yagur-Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+bioreporters+for+the+detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene.">Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).</li></ol>

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
ويمكن تعديل التجربة الموصوفة في الجدول 4 بأي شكل من الاشكال بما يتناسب مع أجهزه الاستشعار التي تم تصميمها. الجانب الأكثر اهميه في المستشعر الكيميائي هو تقييم حساسيته وخصوصيته. ومن المفيد ضمان تحليل مجموعه واسعه من ترك?...

الجهاز الحيوي هو اي أداه تحليليه تستخدم المكونات البيولوجية (مثل البروتينات أو الأحماض النووية أو الكائنات الحية الكاملة) التي تنتج الاستجابة التي يمكن استخدامها للكشف عن ماده كيميائية أو تحليليه. وكمثال علي ذلك ، استخدمت صناعه تعدين الفحم البيولوجي لفتره طويلة من القرن العشرين للكشف عن وجود غازات ألغام السامة: الكناري في منجم الفحم1. وقد لاحظ عمال المناجم استجابه الكائن البيولوجي (الوفاة أو الكرب) لماده كيميائية (أول أكسيد الكربون) من أجل حماية العمال. في مثال أكثر حداثة وتطورا ، يمكن تغيير البكتيريا باستخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية للرد علي وجود تحلل كيميائي معين من خلال إظهار استجابه محدده ، مثل التعبير عن بروتين فلوري.
البيولوجيا التركيبية عبارة واسعه النطاق تشير إلى بناء الاجهزه والنظم البيولوجية التي لا توجد بشكل طبيعي ، أو أعاده تصميم النظم البيولوجية القائمة لغرض محدد2. وتتميز البيولوجيا التركيبية بالهندسة الوراثية بمنهجيه قياسيه وبوجود أجزاء موحده (عناصر وراثيه لعلم الاحياء التركيبية القياسية) يمكن استخدامها لتوليف الاجهزه والنظم. يتم إدخال جزء في جينوم الجهاز ، كائن حي مثل البكتيريا ، للتعبير عن سمه معينه من شانها ان تكون بمثابه مؤشر علي وظيفة. علي سبيل المثال ، في العديد من الاجهزه الاصطناعية ، يتم إدخال التعبير عن البروتين الفلوري في كائن واحد الخلية كبروتين مراسل. يمكن دمج أجهزه متعددة في نظام. الجينوم من الكائنات المجهرية مثل البكتيريا من السهل التلاعب بها بهذه الطريقة. وقد ابلغ عن العديد من الامثله علي المواد البيولوجية المحددة لمجموعه واسعه من التحاليل الكيميائية في الأدبيات علي مدي العقد الماضي3,4.
وفي هذا العمل ، يقدم نظام MicRoboCop كمثال علي الاستشعار البيولوجي أو المصمم باستخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية مع تطبيقات جديده في الكيمياء الشرعية والبيئية. MicRoboCop هو نظام من ثلاثه أجهزه منفصلة ، عندما مجتمعه ، وسوف تسمح القولونية للتعبير عن البروتين الفلوري الأحمر (العطاء) في وجود بقايا طلقات ناريه (GSR) التي تم جمعها من ايدي الشخص أو سطح. كل من الاجهزه الثلاثة يستجيب للتحليل الكيميائي المحدد الذي يعرف بأنه مكون من GSR5. التحاليل الثلاثة التي يستجيب لها النظام هي I. 2 ، 4 ، 6-ترينيتروولويني (TNT) والمركبات ذات الصلة ، ثانيا. الرصاص (في شكل أيونات الرصاص) ، وثالثا. الإثمد (أيضا في شكل أيونات).
GSR يتكون من العديد من المواد الكيميائية المختلفة ، ولكن الثلاثة عاده ما تستخدم لتحديد بقايا كما GSR هي الباريوم ، الرصاص ، والإثمد5. اختبار الادله القياسية لتحديد GSR هو استخدام المجهر الكترون المسح الضوئي (SEM) مع التشتت الطاقة الاشعه السينية فلوري (EDX)5. تسمح SEM-EDX للمحللين بتحديد الشكل الفريد والمكونات العنصرية لل GSR. في الحاضر ، هناك عدد قليل من الاختبارات الافتراضية الثنائية المستخدمة علي نطاق واسع المتاحة. ويستخدم أحد الاختبارات الافتراضية التي نشرت مؤخرا التحليل الطيفي للتنقل الأيوني (IMS) ، وهو معدات متخصصة قد لا تكون متاحه في العديد من المختبرات6. وهناك أيضا عدد قليل من ألوان "بقعه" الاختبارات التي يمكن استخدامها ، علي الرغم من انها تستخدم عاده لتحديد المسافة أو لتحديد GSR علي ثقوب الرصاصة والجروح5. بالاضافه إلى ذلك ، كان هناك بعض الاهتمام المحدود في الأدب إلى الاختبارات الكهروكيميائية ل GSR التي توظف تحليل فولتاممتري ، والتي لديها ميزه احتمال كونها الميدانية المحمولة ، أو انوديك تجريد voltammetric ، وهو غاية طريقه حساسة للعناصر المعدنية7. وهناك القليل جدا من الاشاره في أدبيات الاستشعار البيولوجي المصممة خصيصا لغرض الكشف عن GSR ، علي الرغم من نشر بعض المواد البيولوجية لتطبيقات الطب الشرعي الأخرى8.
وترد في الشكل 1العناصر البيولوجية لكل جهاز في نظام microbocop ، وبناء البلازميد. السهم المنحني في الشكل 1b يمثل المنطقة المروج التي يتم تنشيطها في وجود التحليلية ، والبيضاوي هو موقع ربط ريبوسومال الذي يسمح ترجمه البروتين المراسل ، المربع الرمادي المسمي عروض العروض هو الجين الذي يعبر عن الأحمر البروتين الفلوري ، والمثمن الأحمر هو موقع إنهاء النسخ. سيتم استخدام جميع الاجهزه الثلاثة معا كنظام للكشف عن GSR. سيتم احتضان كل جهاز مع مروج محدد (SbRFP ، PbRFP ، و TNT-عروض العروض) مع العينة التي يتم اختبارها سيتم قياس الفلورية لعروض العروض. ولن يتم التعبير عن تقديم العروض الا إذا كان التحلل الكيميائي المناسب موجودا وينشط منطقه المروج. وقد تم تصميم ثلاثه أجهزه تستجيب لبعض المواد الكيميائية الموجودة في GSR ويتم عرضها في هذا العمل.
المروجين المستخدمة في الاجهزه microbocop الثلاثة هي الزرنيخ والداعم إثمد الحساسة, sbrfp9,10, المروج الحساسة الرصاص, pbrfp11,12 والمروج الحساسة TNT, TNT- عروض العروض 13. لان البحث في الأدبيات كشفت عن اي مروج مصممه للرد علي الباريوم ، تم اختيار المروج TNT بدلا من ذلك لان هذا المروج حساس لعدد من المركبات ذات الصلة هيكليا (علي وجه الخصوص ، 2 ، 4-dinitrotoluene و dinitrobenzene) التي من المعروف انها جزء من المركبات العضوية تركت وراءها في GSR. وقد استخدم هذا المروج بنجاح للكشف علي وجه التحديد كميات دقيقه من TNT و 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) في ألغام الارضيه المدفونة13. باستخدام الاجهزه الثلاثة معا كنظام ، سينتج اختبار إيجابي ل GSR مضان في جميع الاجهزه الثلاثة. اشاره مضان في جهاز واحد أو اثنين فقط سوف تشير إلى مصدر بيئي آخر للتحليل (ق) أو في حاله المروج TNT ، التنشيط من قبل مركب ليس مركب عضوي تركت وراءها في GSR. وباستخدام جميع الاجهزه الثلاثة معا ، يتم التقليل إلى ادني حد من امكانيه حدوث نتائج ايجابيه زائفه بسبب المصادر البيئية. ولا تزال الذخيرة الخالية من الرصاص ، التي تكتسب شعبيه ، لا تمثل سوي 5 في المائة من مبيعات الذخيرة في الولايات المتحدة ؛ التالي ، قد تكون النتائج السلبية كاذبه بسبب عدم وجود الرصاص احتمال ولكن لا يزال هناك فائده في جهاز استشعار يستخدم الرصاص كعلامة ل GSR14. الاضافه إلى هذا التطبيق المحدد للطب الشرعي ، يمكن استخدام كل جهاز بشكل منفصل لأغراض الكشف عن الملوثات البيئية.
وتشمل البروتوكولات المقدمة تقنيات البيولوجيا التركيبية المستخدمة لإنشاء الاجهزه (بكتيريا المستشعر) والتقنيات التحليلية للتحقق من وظيفة الاجهزه وتحليل الإشارات الفلورية التي تم الحصول عليها. ويشمل البروتوكول أيضا جمع أدله الطب الشرعي في شكل مسح اليد لجمع GSR من يد المشتبه به أو مسحه لجمع GSR من السطح. يتم عرض النتائج من جهاز استشعار الرصاص علي سبيل المثال النتائج ، إلى جانب إظهار اختبار إيجابي ل GSR باستخدام غلاف خرطوشه المستهلكة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3-dinitrobenzene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D194255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-dinitrotoluene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>101397-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA450-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duplex Buffer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-03-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, HPLC grade, denatured</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC611050040</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GTAAAACGACGGCCAGTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SL21-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes</td>
			<td>Hygenall</td>
			<td>45NRCN</td>
			<td>Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology</td>
			<td>Registry of Standard Biological Parts</td>
			<td></td>
			<td>http://parts.igem.org/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promoter Sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Sb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCAGTCAT 
			ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG 
			AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT 
			GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC 
			GTTGTTAGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			Pb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCGTCTTG 
			ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA 
			ACGCGAGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG 
			ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			TNT promoter: 5&#8217;GCATTCTAGATCAATT 
			TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT 
			TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA 
			CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT 
			CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3&#8217; 3&#8217;CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG 
			CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT 
			TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT 
			GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA 
			ATTAACTTAAGCGTA5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GGAAACAGCTATGACCATG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue

Microbocop هو هو استشعار التي تم تصميمها لتطبيق فريد من نوعه في الكيمياء الشرعية. MicRoboCop هو نظام يتكون من ثلاثه أجهزه التي ، عند استخدامها معا ، يمكن ان تشير إلى وجود بقايا الطلقات النارية (GSR) عن طريق إنتاج اشاره مضان في وجود ثلاثه التحاليل الرئيسية (الإثمد ، والرصاص ، والمكونات العضوية من GSR). ويصف البروتوكول توليف الاجهزه البيولوجية باستخدام القولونية (كولاي) ، وأساليب الكيمياء التحليلية المستخدمة لتقييم الانتقائية وحساسية المستشعرات. ويتجلى أداء النظام باستخدام GSR الذي تم جمعه من داخل غلاف خرطوشه مستهلكه. وبمجرد الاعداد ، يمكن تخزين العناصر البيولوجية حتى الحاجة ويمكن استخدامها كاختبار لهذه التحاليل الرئيسية. وتوفر الاستجابة الايجابيه من جميع التحاليل الثلاثة اختبارا إيجابيا افتراضيا لهذه الاداه ، في حين ان كل جهاز علي حده لديه تطبيقات للكشف عن التحاليل في عينات أخرى (مثل كاشف للتلوث بالرصاص في مياه الشرب). والقيد الرئيسي لهذا النظام هو الوقت اللازم للاشاره الايجابيه ؛ قد يتضمن العمل المستقبلي دراسة الكائنات الحية المختلفة لتحسين وقت الاستجابة.

ويرد في الشكل 2الأطياف الفلورية للخيار الخاص بعروض العروض المستخدمة في هذا العمل. هذه البيانات هي من جهاز PbRFP كما انه يستجيب للرصاص والجهاز TNT-العطاء كما انه يستجيب لاثنين من التحاليل ، 2 ، 4-DNT و 1 ، 3-DNT. يظهر هذا الرقم طيف السيطرة السلبية (لم تتم أضافه التحاليل) ، وال...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

يتم تقديم بروتوكول باستخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية لتوليف مجموعه من البكتيريا البيولوجية البكتيرية لتحليل بقايا الطلقات النارية ، واختبار أداء الاجهزه لاستخدامها المقصود باستخدام الطيفية الفلورية.

اعداد وتطبيق البكتيريا الجرثومية الجديدة للكشف المفترض لبقايا الطلقات النارية

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

يصف هذا البروتوكول إعداد وتحليل جهاز استشعار حيوي فريد تم تصميمه للكشف عن المكونات الكيميائية لبقايا الطلقات النارية. واستخدام أجهزة الاستشعار البيولوجية لتطبيقات الطب الشرعي فريد من نوعه. وهو يمثل بديلاً منخفض التكلفة وبسيط الاستخدام للأجهزة عالية التخصص التي تستخدم عادة في مختبرات الطب الشرعي.يمكن استخدام أساليب البيولوجيا التركيبية الموصوفة لأي نظام يستخدم أجزاء بيولوجية اصطناعية قياسية. التحليل الكيميائي الموصوف ينطبق على أي جهاز استشعار بيولوجي يعبر عن البروتين الفلوري الأحمر. وسيكون إثبات الإجراء أندريا سولس وإيل ريتشاردسون، الطلاب الجامعيين في جامعة لونغوود.لبدء هذا الإجراء، إضافة عشرة ميكرولترات من الحمض النووي J10060 المعزول سابقا إلى أنبوب microcentrifuge. إضافة ثمانية ميكرولترات من الماء، وميكر واحد من كل من EcoRI وNHEL الإنزيمات مختلطة مسبقا مع ميكرولتر واحد من العازلة. بالنسبة للحمض النووي المروج ، إضافة عشرة microliters من تسلسل الحمض النووي المروج محن إلى أنبوب جديد microcentrifuge.إضافة ثمانية ميكرولترات من الماء، وميكر واحد من كل من EcoRI وNHEL الإنزيمات مختلطة مسبقا مع ميكرولتر واحد من العازلة. باستخدام ماصة تعيينها إلى عشرة ميكروليترس، ماصة بلطف العينات صعودا وهبوطا لخلط. احتضان العينات في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.ثم، تسخين وتنشط الإنزيمات في 80 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تخزين الحمض النووي هضم في الثلاجة حتى تصبح جاهزة للشروع. أولاً، استخدم الحمض النووي البلازمي والمروج الذي تم هضمه سابقًا لإعداد التفاعل في أنبوب ميكروستريفوج على الجليد، كما هو موضح في الجدول الأول من بروتوكول النص.التأكد من إضافة T4 الحمض النووي Ligase الماضي. الماصات صعودا وهبوطا بلطف لخلط رد الفعل، والطرد المركزي لفترة وجيزة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.ثم، تسخين وتنشيط في 65 درجة مئوية لمدة عشر دقائق. تنفيذ التحويل كما هو موضح في بروتوكول النص. أولاً، إعداد مخاليط التفاعل ل PCR على النحو المبين في الجدول الثاني من بروتوكول النص.الماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط ردود الفعل. باستخدام طرف ماصة صفراء، كشط مستعمرة من القولونية المتحولة. نقل انتقاد من هذا الإشريكية القولونية على لوحة Agar LB-ampicillin الجديدة التي تم تقسيمها، ومن ثم إدراج تلميح ماصة في أنبوب PCR.يهز تلميح ماصة لخلط E.Coli مع مزيج PCR. كرر هذه العملية ثلاث مرات إضافية لمستعمرات إضافية. ثم، تحميل أنابيب PCR في جهاز PCR، والبدء في الدراجات الحرارية على النحو المبين في الجدول الثالث من بروتوكول النص.البدء في تسمية العدد المناسب من أنابيب الثقافة العقيمة كما هو موضح في الجدول الرابع من بروتوكول النص. إضافة ملليلترين من مرق الثقافة المعدة إلى كل أنبوب. إضافة حل الأسهم الanilite إلى الأنابيب على النحو المبين في الجدول الرابع.ثم، ضع القبعات المفاجئة على أنابيب الثقافة بحيث تكون فضفاضة للسماح تدفق الهواء إلى الأنبوب. دوامة كل أنبوب الثقافة. بعد ذلك، ضع الأنابيب في حاضنة مهزوزة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، و220 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة على الأقل.أولاً، استخدم مسح الإيثانول المصمم لإزالة الرصاص لمسح جميع أسطح اليدين، بما في ذلك بين الأصابع. تخزين مناديل في حقيبة القابلة للختم المسمى بشكل مناسب حتى التحليل. استخدام الكحول على أساس مسح لمسح أسفل أي الأسطح الكبيرة ليتم اختبارها.استخدام مبادلة القطن مبللة بالإيثانول لمسح أسفل أي الأسطح الصغيرة ليتم اختبارها. ارتداء قفازات نظيفة واستخدام مقص التي تم تنظيفها مع الكحول، وقطع القسم الذي هو ما يقرب من سنتيمتر مربع واحد من وسط المسح. ثم، ضع قطعة من المسح، أو مسحة القطن، مباشرة في أنبوب الثقافة التي تحتوي على مليلتر اثنين من البكتيريا الاستشعار، وضمان أن تكون مغمورة تماما في مرق.إعداد المطياف لجمع الفلورسنت في الطول الموجي المناسب لمتغيرات RFP، مع طول موجي مثير من 500 نانومتر. ثم، استخدام خلاط دوامة لهز الأنابيب. نقل بعناية كل افرا إلى cuvette منخفضة الحجم، وجمع كثافة الانبعاثات.باستخدام خلاط دوامة، يهز الأنابيب. نقل 200 ميكرولترات من المرق إلى بئر في لوحة البئر. سجل العينات التي ذهبت إلى كل بئر من هذه اللوحة.إعداد مقياس الدقيق لجمع كثافة الانبعاثات عند الطول الموجي المناسب لمتغيرات طلب تقديم العروض. أطياف الفلوريسنس لمتغيرات RFP تمثيلية تظهر كل من التحكم السلبي والأطياف على مستويين مختلفين من الanilite المضافة. ويلاحظ الحد الأقصى للإشارة الفلورية لمتغيرات طلب العروض المستخدمة في هذا العمل عند 575 نانومتر.يتم جمع البيانات التمثيلية لنفس مجموعة الحلول، من كل من مطياف المحمولة ومقياس الفلور. هناك اتجاه عام من الفلوريسنس زيادة مع زيادة تركيز الanilite. ومن الجدير بالذكر أنه بتركيزات عالية، تزيد عن حوالي 800 جزء في البليون الواحد بالنسبة لأجهزة الاستشعار الرصاصية، تنخفض الاستجابة بسبب سمية الرصاص عند هذا التركيز العالي.تحليل عينات مسحة الإيثانول من داخل غلاف خرطوشة عيار 40 مستهلك يوفر دليلا على النتائج المبدئية. النتائج الإيجابية لكل من البكتيريا الاستشعار الثلاثة، يشير إلى اختبار إيجابي لبقايا طلقات نارية. ويمكن أيضاً استخدام أجهزة الاستشعار البيولوجية المعدة في هذا البروتوكول بشكل فردي للكشف عن التلوث في عينات الأغذية أو المياه أو البيئة.تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لتطوير أجهزة الاستشعار البيولوجية باستخدام تقنيات البيولوجيا الاصطناعية القياسية لمجموعة متنوعة من anilites الكيميائية المختلفة. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية، ويجب على المحللين غسل اليدين وتطهير الأسطح بعد التعامل مع الإشريكية القولونية. وينبغي أن تكون النفايات ذات نفايات ذاتية النفايات، وأن تعالج أي نفايات تحتوي على المعادن الثقيلة وفقاً لذلك.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

إعداد واستخدام ثنائي يوديد السمريوم (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) في التركيب العضوي: دور الميكنة من أملاح النيكل وHMPA (II) في رد فعل باربييه السمريوم

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

توليف Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates لتطبيق توليد Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

عزل وإعداد جدران الخلايا البكتيرية للتحليل التركيبي بواسطة الترا الأداء الكروماتوغرافيا السائلة

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

إعداد ميكا والسيليكون ركائز لDNA اوريغامي التحليل والتجريب

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

بروتوكول لتوليف<em&gt; أورثو</em&gt; مشتقات الانيلين -trifluoromethoxylated

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

تخليق البروتين Bioconjugates<em&gt; عبر</em&gt; سيستين-maleimide الكيمياء

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

توليف سطحي من المذيلات تشبه دودة من الضوء المرئي وساطة التشتت البلمرة عن طريق Photoredox محفز

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

إعداد وتقييم<sup&gt; 99m</sup&gt; ح المسمى ثلاثي الشعب يخلب لما قبل استهداف عن طريق Bioorthogonal الكيمياء

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...