Name: preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Forfatterne ønsker at anerkende de studerende på Longwood University i BIOL 324 (genetik) og de studerende i CHEM 403 (avanceret kemisk laboratorium problem løsning), der var involveret i den indledende forberedelse og afprøvning af antimon og bly biosensorer. Ideen til MicRoboCop blev udtænkt på GCAT SynBIO workshop (sommer 2014), som er finansieret af NSF og Howard Hughes Medical Institute og hostet af University of Maryland Baltimore County. Forfatterne anerkender også støtte modtaget fra Longwood universitetets Cook-Cole College of Arts and Sciences og GCAT SynBio Alumni Grant.

Bemærk: syntesen af E. coli , der udtrykker RFP, præsenteres.
1. fremstilling af plasmid-DNA fra E. coli
<ol><li>Tø e. coli indeholder et plasmid med et RFP-gen-og ampicillin-resistens-gen og dyrker e. coli på Luria Broth (lb) agar-plader, der indeholder 100 μg/ml ampicillin ved 37 °c i 24 timer. For eksempel skal du bruge J10060 plasmid fra registret over standard biologiske dele, der anvendes til syntetisk biologi (Se tabel over materialer<...

<ol>
	<li>Eschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;The+Story+of+the+Real+Canary+in+the+Coal+Mine.&#34;.">&#34;The Story of the Real Canary in the Coal Mine.&#34;.</a> The Smithsonian Magazine. , (2016).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors &#38; Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+genetically+engineered+microbial+whole-cell+biosensors+for+combined+chemosensing.">Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).</li><li>Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gunshot+Residue+and+Associated+Materials-A+Review.">Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).</li><li>Bell, S., Seitzinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+binary+presumptive+assays+to+probabilistic+assessments:+Differentiation+of+shooters+from+non-shooters+using+IMS,+OGSR,+neural+networks,+and+likelihood+ratios.">From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios.</a> Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).</li><li>O&#39;Mahony, A. M., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Detection+of+Gunshot+Residue+for+Forensic+Analysis:+A+Review.">Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review.</a> Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).</li><li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Biosensor+Technology+for+Potential+Applications+-+An+Overview.">Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).</li><li>Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralogous+Regulators+ArsR1+and+ArsR2+of+Pseudomonas+putida+KT2440+as+a+Basis+for+Arsenic+Biosensor+Development.">Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).</li><li>Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Biological+Organisms+as+Chemical+Sensors:+The+MicRoboCop+Project.">Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project.</a> Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).</li><li>Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+the+pbr+lead+resistance+determinant+of+Ralstonia+metallidurans+CH34.">Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34.</a> Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).</li><li>Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+coordination+of+Pb(II)+is+involved+in+the+PbrR-dependent+activation+of+the+lead-resistance+promoter,+PpbrA,+from+Cupriavidus+metallidurans+CH34.">Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34.</a> Bmc Microbiology. 12, (2012).</li><li>Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene+by+an+Escherichia+coli+bioreporter:+performance+enhancement+by+directed+evolution.">Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).</li><li>Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Guns+in+America:+The+Debate+Over+Lead+Based+Bullets.&#34;.">&#34;Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.&#34;.</a> Newsweek. , (2017).</li><li>Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAAS+Determination+of+Antimony,+Barium,+and+Lead+Levels+in+Gunshot+Residue+Swabs:+An+Application+in+Forensic+Chemistry.">GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry.</a> Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).</li><li>Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+and+Behavior+of+Gunshot+Residue-A+Review.">Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).</li><li>Yagur-Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+bioreporters+for+the+detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene.">Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).</li></ol>

Ændringer og fejlfinding
Det i tabel 4 beskrevne eksperiment kan på enhver måde ændres, så det passer til de sensorer, der er konstrueret. Det vigtigste aspekt af en kemisk sensor er at vurdere dens følsomhed og specificitet. Det er gavnligt at sikre, at en lang række koncentrationer af analytten analyseres for at bestemme sensorens nyttige analytiske område. Det er også værd at fastsætte et maksimum niveau af analysand for cellerne. Da de analysand...

En biosensor er enhver analytisk anordning, der anvender biologiske komponenter (såsom proteiner, nukleinsyrer eller hele organismer), der producerer et respons, der kan anvendes til påvisning af et kemisk stof eller analysand. F. eks. brugte kulmineindustrien en biosensor i meget af det 20. århundrede til at påvise tilstedeværelsen af giftige minegasser: Kanarieøerne i kulminen1. Den biologiske organismes (kanarieøens) respons (død eller angst) over for en kemisk analysand (carbonmonoxid) blev observeret af minearbejderne for at beskytte arbejderne. I et mere moderne og sofistikeret eksempel kan bakterier ændres ved hjælp af syntetisk biologi teknikker til at reagere på tilstedeværelsen af en bestemt kemisk analysand ved at udstille en specifik respons, såsom ekspression af et fluorescerende protein.
Syntetisk biologi er et bredt begreb, der refererer til konstruktionen af biologiske enheder og systemer, der ikke eksisterer naturligt, eller re-design af eksisterende biologiske systemer til et bestemt formål2. Syntetisk biologi skelnes fra genteknologi ved en standardmetode og eksistensen af standardiserede dele (standard syntetiske biologi genetiske elementer), der kan bruges til at syntetisere enheder og systemer. En del indføres i genomet af en anordning, en organisme som en bakterie, at udtrykke en bestemt egenskab, der vil tjene som en indikation af funktion. For eksempel, i mange syntetiske enheder, er udtrykket af et fluorescerende protein indført i en enkelt encellede organisme som en reporter protein. Flere enheder kan kombineres til et system. Genomer af mikroorganismer som bakterier er nemme at manipulere på denne måde. Talrige eksempler på biosensorer, der er specifikke for en lang række kemiske analyter, er blevet rapporteret i litteraturen i løbet af det sidste årti,3,4.
I dette arbejde, er MicRoboCop systemet præsenteret som et eksempel på en biosensor designet ved hjælp af syntetisk biologi teknikker med nye anvendelser i retsmedicinsk og miljømæssig kemi. MicRoboCop er et system af tre separate enheder, der, når de kombineres, vil gøre det muligt for Escherichia coli at udtrykke rødt fluorescerende protein (RFP) i tilstedeværelse af skud rester (GSR), der er blevet indsamlet fra en persons hænder eller en overflade. Hver af de tre enheder reagerer på en specifik kemisk analysand, der vides at være en bestanddel af GSR5. De tre analysander, som systemet reagerer på, er I. 2, 4, 6-trinitrotoluen (TNT) og beslægtede stoffer, II. bly (i form af bly ioner) og III. antimon (også i form af ioner).
GSR består af mange forskellige kemiske stoffer, men de tre bruges sædvanligvis til at identificere en rest, da GSR er barium, bly og antimon5. Den standard bevismæssige test til identifikation af GSR er at bruge scanning elektronmikroskopi (SEM) med energi udbredt røntgen fluorescens (EDX)5. SEM-EDX gør det muligt for analytikere at identificere de unikke morfologi og elementært komponenter i GSR. I øjeblikket er der kun få udbredte binære formodede tests til rådighed. En nylig offentliggjort formodede test bruger ion-Mobility spektroskopi (IMS), som er specialiseret udstyr, der måske ikke er tilgængelige i mange laboratorier6. Der er også et par farve "spot" tests, der kan anvendes, selv om de typisk anvendes til distance bestemmelse eller til GSR identifikation på kuglehuller og sår5. Derudover har der været en vis begrænset opmærksomhed i litteraturen til elektrokemiske tests for GSR, der anvender voltammetrisk analyse, som har den fordel, at de potentielt er felt bærbare, eller anodisk stripping voltammetry, som er en ekstremt følsom metode for metalliske elementer7. Der er meget lidt omtale i litteraturen af biosensorer designet specielt med henblik på at afsløre GSR, selv om nogle biosensorer til andre retsmedicinske applikationer er blevet offentliggjort8.
De biologiske elementer for hver anordning i MicRoboCop-systemet og plasmid-konstruktionen er illustreret i figur 1. Den buede pil i figur 1b repræsenterer den promotor region, der er aktiveret i nærværelse af analysand, den ovale er den ribosomale bindingssted, der tillader oversættelse af reporter protein, den grå boks mærket RFP er det gen, der udtrykker rødt fluorescerende protein, og den røde Oktagon er transkription termineringstedet. Alle tre enheder vil blive brugt sammen som et system til at detektere GSR. Hver enhed med en bestemt promotor (SbRFP, PbRFP og TNT-RFP) vil blive inkueret med den prøve, der testes, og fluorescens af RFP vil blive målt. RFP udtrykkes kun, hvis den relevante kemiske analysand er til stede og aktiverer initiativtageren. Tre enheder, der reagerer på nogle af de kemiske stoffer til stede i GSR er designet og præsenteres i dette arbejde.
De projektledere, der anvendes i de tre mikrobocop-enheder, er en arsen-og antimon følsom promotor, sbrfp9,10, en ledende følsom promotor, pbrfp11,12 og en TNT-følsom promotor. TNT-RFP 13. da en søgning i litteraturen afslørede, at der ikke var nogen promotor til at reagere på barium, blev TNT-promotoren valgt i stedet, da denne promotor er følsom over for en række strukturelt beslægtede forbindelser (især 2,4-dinitrotoluen og dinitrobenzen), som vides at være en del af de organiske forbindelser, der efterlades i GSR. Denne promotor er blevet brugt til specifikt at detektere minut mængderne af TNT og 2,4-dinitrotoluen (2,4-DNT) i begravede landminer13. Ved hjælp af de tre enheder sammen som et system, vil en positiv test for GSR producere fluorescens i alle tre enheder. Et fluorescens signal i kun én eller to enheder vil indikere en anden miljø kilde for analysand eller for TNT-promotoren, aktivering af en forbindelse, der ikke er en organisk forbindelse efterladt i GSR. Ved at bruge alle tre enheder sammen minimeres muligheden for falsk positive resultater på grund af miljømæssige kilder. Blyfri ammunition, der vinder i popularitet, udgør stadig kun ca. 5% af ammunitions salget i USA. Derfor kan falsk negative resultater på grund af fravær af bly være en mulighed, men der er stadig nytte i en sensor, der bruger bly som markør for GSR14. Ud over denne specifikke retsmedicinske anvendelse, kan hver anordning anvendes separat med henblik på påvisning af miljøforurenende stoffer.
De præsenterede protokoller omfatter syntetiske biologi teknikker, der anvendes til at skabe de anordninger (sensor bakterier) og de analytiske teknikker til at kontrollere funktionen af enhederne og analysere fluorescens signaler opnået. Protokollen omfatter også indsamling af retsmedicinske beviser i form af hånd aftørring at indsamle GSR fra hænderne på en mistænkt eller svaber prøven omfatter at indsamle GSR fra en overflade. Resultater fra bly Sensorenheden præsenteres som eksempelresultater, sammen med en demonstration af en positiv test for GSR ved hjælp af en brugt patron kabinet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3-dinitrobenzene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D194255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-dinitrotoluene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>101397-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA450-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duplex Buffer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-03-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, HPLC grade, denatured</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC611050040</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GTAAAACGACGGCCAGTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SL21-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes</td>
			<td>Hygenall</td>
			<td>45NRCN</td>
			<td>Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology</td>
			<td>Registry of Standard Biological Parts</td>
			<td></td>
			<td>http://parts.igem.org/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promoter Sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Sb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCAGTCAT 
			ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG 
			AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT 
			GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC 
			GTTGTTAGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			Pb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCGTCTTG 
			ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA 
			ACGCGAGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG 
			ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			TNT promoter: 5&#8217;GCATTCTAGATCAATT 
			TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT 
			TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA 
			CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT 
			CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3&#8217; 3&#8217;CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG 
			CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT 
			TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT 
			GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA 
			ATTAACTTAAGCGTA5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GGAAACAGCTATGACCATG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue

MicRoboCop er en biosensor, der er designet til en unik anvendelse i retsmedicinsk kemi. MicRoboCop er et system, der består af tre enheder, der, når de anvendes sammen, kan indikere tilstedeværelsen af skud rester (GSR) ved at fremstille et fluorescens signal ved tilstedeværelse af tre vigtige analysander (antimon, bly og organiske komponenter i GSR). Protokollen beskriver syntesen af de biosensorer, der anvender Escherichia coli (E. coli), og de analytiske kemi metoder, der anvendes til at vurdere Sensorernes selektivitet og følsomhed. Systemets funktion påvises ved hjælp af GSR, der er indsamlet fra indersiden af et brugt patronhylster. Når Biosensorerne er forberedt, kan de opbevares, indtil de er nødvendige, og kan bruges som test for disse vigtige analyter. En positiv respons fra alle tre analysander giver en formodet positiv test for GSR, mens hver enkelt anordning har applikationer til påvisning af analysander i andre prøver (f. eks. en detektor til blyforurening i drikkevand). Den vigtigste begrænsning af systemet er den tid, der kræves for et positivt signal; fremtidige arbejde kan indebære at studere forskellige organismer for at optimere responstid.

Fluorescens spektre for den RFP-variant, der anvendes i dette arbejde, er vist i figur 2. Disse data er fra PbRFP-enheden, da den reagerer på bly og TNT-RFP-enheden, da den reagerer på to analyter, 2,4-DNT og 1, 3-DNB. Dette tal viser spektret af en negativ kontrol (ingen analysand tilsat), og spektrene på to forskellige niveauer af analysand tilsættes. Det maksimale fluorescens signal for den anvendte RFP-variant blev observeret ved 575 nm (excitations bølgelængde ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

En protokol er præsenteret ved hjælp af syntetisk biologi teknikker til at syntetisere et sæt af bakterielle biosensorer til analyse af skudsår rester, og til at teste funktionen af anordningerne til deres tilsigtede anvendelse ved fluorescens spektroskopi.

Klargøring og anvendelse af en ny bakteriel biosensor til formodet påvisning af skud rester

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Denne protokol beskriver forberedelse og analyse af en unik biosensor, der er designet til at detektere de kemiske komponenter i skudrester. Brugen af biosensorer til retsmedicinske anvendelser er unik. Det repræsenterer en billig, enkel at bruge alternativ til den højt specialiserede instrumentering typisk anvendes i retsmedicinske laboratorier.De beskrevne syntetiske biologimetoder kan anvendes til ethvert system, der anvender standarddele i syntetisk biologi. Den beskrevne kemiske analyse gælder for enhver biosensor, der udtrykker rødt fluorescerende protein. Demonstration af proceduren vil være Andrea Soles og Elle Richardson, bachelorstuderende på Longwood University.For at begynde denne procedure, tilføje ti mikroliter af den tidligere isolerede J10060 plasmid DNA til en mikrocentrifuge rør. Tilsæt otte mikroliter vand, og en mikroliter af hver af EcoRI og NHEL enzymer forblandet med en mikroliter buffer. For promotor DNA, tilføje ti mikroliter af udglødede promotor DNA-sekvenser til en frisk mikrocentrifuge rør.Tilsæt otte mikroliter vand, og en mikroliter af hver af EcoRI og NHEL enzymer forblandet med en mikroliter buffer. Ved hjælp af en pipette sat til ti mikroliter, forsigtigt pipette prøverne op og ned for at blande. Inkuber prøverne ved 37 grader Celsius i 30 minutter.Derefter varme og aktive enzymer ved 80 grader Celsius i fem minutter. Opbevar det fordøjede DNA i en fryser, indtil det er klar til at fortsætte. Først skal du bruge plasmid og promotor DNA, der tidligere blev fordøjet til at oprette reaktionen i en microcetrifuge rør på is, som skitseret i tabel et af tekstprotokollen.Sørg for at tilføje T4 DNA Ligase sidste. Pipette op og ned forsigtigt at blande reaktionen, og centrifuge kort. Inkuberes ved stuetemperatur i ti minutter.Derefter varme og aktivere ved 65 grader Celsius i ti minutter. Udfør transformeringen som beskrevet i tekstprotokollen. Først skal du konfigurere reaktionsblandingerne for PCR som beskrevet i tabel to i tekstprotokollen.Pipetter forsigtigt op og ned for at blande reaktionerne. Brug en gul pipettespids, skrabe en koloni af den transformerede E.coli. Overfør en knalde af denne E.coli på en ny LB-ampicillin agar plade, der er blevet afskåret, og derefter indsætte pipette spidsen i PCR rør.Ryst pipettespidsen for at blande E.Coli med PCR-blandingen. Gentag denne proces tre gange mere for yderligere kolonier. Indlæs derefter PCR-rørene i en PCR-maskine, og begynd termocykling som beskrevet i tabel tre i tekstprotokollen.For at begynde at mærke det relevante antal sterile kulturrør som beskrevet i tabel fire i tekstprotokollen. Tilføj to milliliter af den forberedte kultur bouillon til hvert rør. Tilsæt anilite stock løsning til rørene som skitseret i tabel fire.Derefter placere snap hætter på kultur rør, så de er løse for at tillade luftstrøm ind i røret. Vortex hver kultur rør. Herefter anbringes rørene i en rystende inkubator ved 37 grader Celsius og ved 220 omdr./min. i mindst 24 timer.Først skal du bruge en ethanol baseret tørre designet til at fjerne bly til at tørre alle overflader af hænderne, herunder mellem fingrene. Opbevar kludene i en passende mærket forseglelig baggie indtil analyse. Brug en alkoholbaseret tørre til at tørre ned store overflader, der skal testes.Brug en bomuld swap fugtet med ethanol til at tørre ned eventuelle små overflader, der skal testes. Iført rene handsker og ved hjælp af en saks, der er blevet renset med alkohol, skæres en sektion, der er ca. en kvadratcentimeter ud af midten af tørret. Derefter placeres det afskårne stykke tør, eller vatpind, direkte ind i en kultur rør, der indeholder to milliliter af sensoren bakterier, og sikre, at det er helt nedsænket i bouillon.Forbered spektrometeret til at indsamle fluorescerende indsendelse på den relevante bølgelængde for RFP-varianten med en excitation bølgelængde på 500 nanometer. Brug derefter en vortex mixer til at ryste rørene. Overfør forsigtigt hver supernatant til en lav volumen cuvette, og opsaml emissionsintensiteten.Brug en vortex mixer, ryste rørene. Overfør 200 mikroliter af bouillon til en brønd i brøndpladen. Optag, hvilke prøver der gik ind i hver brønd af denne plade.Opsæt flourometeret for at indsamle emissionsintensiteten ved den relevante bølgelængde for RFP-varianten. Fluorescensspektrene for en repræsentativ RFP-variant viser både den negative kontrol og spektrene på to forskellige niveauer af anilite tilføjet. Det maksimale fluorescerende signal for RFP-varianten, der anvendes i dette arbejde, observeres ved 575 nanometer.Der indsamles repræsentative data for det samme sæt opløsninger fra både det bærbare spektrometer og fluoretometeret. Der er en generel tendens til fluorescens stigende som koncentrationen af anilite stiger. Det er værd at bemærke, at ved høje koncentrationer, større end omkring 800 dele per milliard for bly sensor, reaktionen falder ud på grund af toksiciteten af bly ved en så høj koncentration.Analyse af ethanol podning prøver fra indersiden af en brugt 40 kaliber patron hus giver bevis for princippet resultater. De positive resultater fra hver af de tre sensorbakterier indikerer en positiv test for skudrester. De biosensorer, der fremstilles i denne protokol, kan også anvendes individuelt til at påvise forurening i fødevare-, vand- eller miljøprøver.Denne teknik baner vejen for forskere til at udvikle biosensorer ved hjælp af standard syntetisk biologi teknikker til en række forskellige kemiske anilites. Personlige værnemidler skal bæres, og analytikere bør vaske hænder og desinficere overflader efter håndtering E.coli. Affald skal autoklaveres, og alt affald, der indeholder tungmetaller, bør behandles i overensstemmelse hermed.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

Fremstilling og anvendelse af Samarium Diiodide (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) I Organic Synthesis: Den mekanistiske rolle HMPA og Ni (II) salte i Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Syntese af hypervalente iodonium Alkynyl Triflater om anvendelse af Generering Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Isolering og forberedelse af bakteriecellevægge til kompositorisk analyse af ultraperformet væskekromatografi

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Udarbejdelse af Mica og Silicon Substrater for DNA Origami Analyse og eksperimenter

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protokol til syntese af<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated anilinderivater

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese af Protein biokonjugater<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Kemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Syntese af ormelignende Miceller af synligt lys Mediated Dispersion polymerisering Brug Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Udarbejdelse og evaluering af<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-mærket tridentat Chelater for Pre-targeting Brug Bioorthogonal Kemi

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...