Name: preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

De auteurs willen de studenten te erkennen aan de Longwood Universiteit in BIOL 324 (genetica) en de studenten in CHEM 403 (Advanced Chemical Lab problem solving) die betrokken waren bij de initiële voorbereiding en het testen van de antimoon en lood biosensoren. Het idee voor MicRoboCop werd bedacht op de GCAT SynBIO workshop (zomer 2014), die wordt gefinancierd door NSF en Howard Hughes Medical Institute en gehost door de Universiteit van Maryland Baltimore County. De auteurs erkennen ook de financiering ontvangen van Longwood Universiteit Cook-Cole College of Arts and Sciences en de GCAT SynBio alumni Grant.

Nota: de synthese van E. coli die offerte uitdrukt wordt voorgesteld.
1. voorbereiding van plasmide DNA van E. coli
<ol><li>Dooi e. coli bevattend een plasmide met een gen van de offerte en het bestand van de weerstand AMPICILLIN en kweken e. coli op Luria Bouillon (lb) agar platen die 100 µ g/ml AMPICILLIN bij 37 °c voor 24 h bevatten. Gebruik bijvoorbeeld de J10060 plasmide uit het register van standaard biologische onderdelen die worden gebruikt voor ...

<ol>
	<li>Eschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;The+Story+of+the+Real+Canary+in+the+Coal+Mine.&#34;.">&#34;The Story of the Real Canary in the Coal Mine.&#34;.</a> The Smithsonian Magazine. , (2016).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors &#38; Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+genetically+engineered+microbial+whole-cell+biosensors+for+combined+chemosensing.">Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).</li><li>Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gunshot+Residue+and+Associated+Materials-A+Review.">Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).</li><li>Bell, S., Seitzinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+binary+presumptive+assays+to+probabilistic+assessments:+Differentiation+of+shooters+from+non-shooters+using+IMS,+OGSR,+neural+networks,+and+likelihood+ratios.">From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios.</a> Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).</li><li>O&#39;Mahony, A. M., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Detection+of+Gunshot+Residue+for+Forensic+Analysis:+A+Review.">Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review.</a> Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).</li><li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Biosensor+Technology+for+Potential+Applications+-+An+Overview.">Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).</li><li>Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralogous+Regulators+ArsR1+and+ArsR2+of+Pseudomonas+putida+KT2440+as+a+Basis+for+Arsenic+Biosensor+Development.">Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).</li><li>Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Biological+Organisms+as+Chemical+Sensors:+The+MicRoboCop+Project.">Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project.</a> Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).</li><li>Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+the+pbr+lead+resistance+determinant+of+Ralstonia+metallidurans+CH34.">Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34.</a> Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).</li><li>Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+coordination+of+Pb(II)+is+involved+in+the+PbrR-dependent+activation+of+the+lead-resistance+promoter,+PpbrA,+from+Cupriavidus+metallidurans+CH34.">Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34.</a> Bmc Microbiology. 12, (2012).</li><li>Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene+by+an+Escherichia+coli+bioreporter:+performance+enhancement+by+directed+evolution.">Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).</li><li>Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Guns+in+America:+The+Debate+Over+Lead+Based+Bullets.&#34;.">&#34;Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.&#34;.</a> Newsweek. , (2017).</li><li>Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAAS+Determination+of+Antimony,+Barium,+and+Lead+Levels+in+Gunshot+Residue+Swabs:+An+Application+in+Forensic+Chemistry.">GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry.</a> Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).</li><li>Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+and+Behavior+of+Gunshot+Residue-A+Review.">Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).</li><li>Yagur-Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+bioreporters+for+the+detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene.">Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).</li></ol>

Wijzigingen en probleemoplossing
Het in tabel 4 beschreven experiment kan op welke manier dan ook aangepast worden aan de ontworpen sensoren. Het belangrijkste aspect van een chemische sensor is het evalueren van de gevoeligheid en specificiteit. Het is nuttig om ervoor te zorgen dat een breed scala van concentraties van de analyt wordt geanalyseerd om de nuttige analytische bereik van de sensor te bepalen. Het is ook de moeite waard het bepalen van een maximu...

Een biosensor is een analytisch apparaat dat gebruikmaakt van biologische componenten (zoals eiwitten, nucleïnezuren of hele organismen) die een reactie produceren die kan worden gebruikt voor het opsporen van een chemische stof of analyt. Als voorbeeld, de kolenmijn industrie gebruikt een biosensor voor een groot deel van de 20e eeuw om de aanwezigheid van giftige mijn gassen te detecteren: de kanarie in de kolenmijn1. De (de) reactie van het biologische organisme (de dood of de nood) aan een chemische analyt (koolmonoxide) werd waargenomen door de mijnwerkers om de arbeiders te beschermen. In een meer moderne en verfijnde voorbeeld, bacteriën kunnen worden veranderd met behulp van synthetische biologietechnieken om te reageren op de aanwezigheid van een bepaalde chemische analyt door het tentoonstellen van een specifieke reactie, zoals de expressie van een fluorescerende eiwit.
Synthetische biologie is een brede term die verwijst naar de bouw van biologische apparaten en systemen die niet van nature bestaan, of het herontwerp van bestaande biologische systemen voor een specifiek doel2. Synthetische biologie onderscheidt zich van genetische manipulatie door een standaard methodologie en het bestaan van gestandaardiseerde onderdelen (standaard synthetische biologie genetische elementen) die kunnen worden gebruikt om apparaten en systemente synthetiseren. Een deel wordt geïntroduceerd in het genoom van een apparaat, een organisme zoals een bacterie, om een bepaalde eigenschap uit te drukken die als aanwijzing van functie zal dienen. Bijvoorbeeld, in vele synthetische apparaten, wordt de uitdrukking van een fluorescente proteïne geïntroduceerd in één eencellige organisme als verslaggever proteïne. Meerdere apparaten kunnen worden gecombineerd in een systeem. Het genoom van micro-organismen zoals bacteriën zijn gemakkelijk te manipuleren op deze manier. Talrijke voorbeelden van biosensoren die specifiek zijn voor een breed scala van chemische analyten zijn gerapporteerd in de literatuur over de laatste tien jaar3,4.
In dit werk wordt het MicRoboCop systeem gepresenteerd als een voorbeeld van een biosensor ontworpen met behulp van synthetische biologietechnieken met nieuwe toepassingen in de forensische en milieu-chemie. MicRoboCop is een systeem van drie afzonderlijke apparaten die, wanneer gecombineerd, zal Escherichia coli om rode fluorescerende eiwit (offerte) uit te drukken in de aanwezigheid van schot residu (GSR) die is verzameld uit handen van een persoon of een oppervlak. Elk van de drie apparaten reageert op een specifieke chemische analyt waarvan bekend is dat het een onderdeel van GSR5. De drie analyten waarop het systeem reageert zijn I. 2, 4, 6-trinitrotolueen (TNT) en aanverwante verbindingen, II. lood (in de vorm van lood ionen), en III. Antimoon (ook in de vorm van ionen).
GSR bestaat uit veel verschillende chemische stoffen, maar de drie meestal gebruikt om een residu te identificeren als GSR zijn barium, lood, en antimoon5. De standaard evidentiary test voor de identificatie van GSR is het gebruik van Scanning Electron microscopie (SEM) met energie Dispersive X-Ray fluorescentie (EDX)5. SEM-EDX staat analisten toe om de unieke morfologie en de elementaire componenten van GSR te identificeren. Momenteel zijn er weinig gebruikte binaire vermoedelijke tests beschikbaar. Een onlangs gepubliceerde vermoedelijke test maakt gebruik van Ion-Mobility spectroscopie (IMS), dat is gespecialiseerd apparatuur die misschien niet beschikbaar zijn in vele Labs6. Er zijn ook een paar kleur "spot" tests die kunnen worden gebruikt, hoewel ze meestal worden gebruikt voor afstand bepaling of voor GSR identificatie op kogelgaten en wonden5. Bovendien, er is enige beperkte aandacht in de literatuur aan elektrochemische tests voor GSR die voltammetric analyse, die het voordeel van potentieel wordt gebied draagbare, of anodische strippen voltammetry, dat is een uiterst gevoelige methode voor metallic elementen7. Er is zeer weinig vermelding in de literatuur van biosensoren speciaal ontworpen voor het doel van het opsporen van GSR, hoewel sommige biosensoren voor andere forensische toepassingen zijn gepubliceerd8.
De biologische elementen voor elk apparaat in het MicRoboCop systeem, en de plasmide constructie, worden geïllustreerd in Figuur 1. De gebogen pijl in Figuur 1b vertegenwoordigt de promotor regio die wordt geactiveerd in de aanwezigheid van de analyt, de ovaal is de ribosomale bindende site die het mogelijk maakt de vertaling van de verslaggever eiwit, de grijze doos met het label offerte is het gen dat rood uitdrukt fluorescerende eiwitten, en de rode Octagon is de transcriptie beëindiging site. Alle drie de apparaten zullen samen worden gebruikt als een systeem om GSR te detecteren. Elk apparaat met een specifieke promotor (SbRFP, PbRFP, en TNT-offerte) zal worden uitgebroed met het monster dat wordt getest en fluorescentie van offerte zal worden gemeten. OFFERTE zal alleen worden uitgedrukt als de juiste chemische analyt aanwezig is en de promotor regio activeert. Drie apparaten die reageren op een aantal van de chemische stoffen die aanwezig zijn in GSR zijn ontworpen en worden gepresenteerd in dit werk.
De promotors gebruikt in de drie MicRoboCop apparaten zijn een arseen en antimoon Sensitive promotor , SbRFP9,10, een lead Sensitive promotor, PbRFP11,12 en een TNT Sensitive promotor, TNT-offerte 13. omdat een zoekopdracht in de literatuur geen promotor ontwierp om te reageren op barium, werd de TNT promotor in plaats daarvan geselecteerd omdat deze promotor gevoelig is voor een aantal structureel verwante verbindingen (met name 2, 4-dinitrotoluene en dinitrobenzeen) waarvan bekend is dat ze deel uitmaken van de organische verbindingen die achterblijven in GSR. Deze promotor is met succes gebruikt om de minieme hoeveelheden TNT en dinitrotoluene (2, 4-DNT) in begraven landmijnen13specifiek te ontdekken. Met behulp van de drie apparaten samen als een systeem, een positieve test voor GSR zal produceren fluorescentie in alle drie de apparaten. Een fluorescentie signaal in slechts één of twee apparaten zal een andere milieu bron van de analyt (en) of in het geval van de promotor van TNT aangeven, activering door een verbinding die geen organische samenstelling is die achter in GSR wordt verlaten. Door alle drie de apparaten samen te gebruiken, wordt de mogelijkheid van een vals positieve resultaten toe te schrijven aan milieubronnen geminimaliseerd. Loodvrije munitie, die in populariteit wint, vertegenwoordigt nog slechts ongeveer 5% van de munitie verkoop in de Verenigde Staten; Vandaar, kunnen de valse negatieve resultaten toe te schrijven aan de afwezigheid van lood een mogelijkheid zijn maar er is nog nut in een sensor die lood als teller voor GSR14gebruikt. In aanvulling op deze specifieke forensische toepassing, kan elk apparaat afzonderlijk worden gebruikt voor het opsporen van milieuverontreinigingen.
De gepresenteerde protocollen omvatten de synthetische biologietechnieken gebruikt om de apparaten te maken (sensor bacteriën) en de analytische technieken om de functie van de apparaten te controleren en analyseren van de fluorescentie signalen verkregen. Het protocol omvat ook de verzameling van forensisch bewijs in de vorm van de hand af te vegen om GSR te verzamelen uit de handen van een verdachte of zwabberen om GSR te verzamelen van een oppervlak. Resultaten van de lead sensor apparaat worden gepresenteerd als voorbeeld resultaten, samen met een demonstratie van een positieve test voor GSR met behulp van een gebruikte cartridge behuizing.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3-dinitrobenzene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D194255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-dinitrotoluene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>101397-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA450-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duplex Buffer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-03-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, HPLC grade, denatured</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC611050040</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GTAAAACGACGGCCAGTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SL21-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes</td>
			<td>Hygenall</td>
			<td>45NRCN</td>
			<td>Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology</td>
			<td>Registry of Standard Biological Parts</td>
			<td></td>
			<td>http://parts.igem.org/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promoter Sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Sb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCAGTCAT 
			ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG 
			AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT 
			GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC 
			GTTGTTAGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			Pb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCGTCTTG 
			ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA 
			ACGCGAGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG 
			ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			TNT promoter: 5&#8217;GCATTCTAGATCAATT 
			TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT 
			TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA 
			CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT 
			CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3&#8217; 3&#8217;CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG 
			CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT 
			TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT 
			GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA 
			ATTAACTTAAGCGTA5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GGAAACAGCTATGACCATG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue

MicRoboCop is een biosensor die is ontworpen voor een unieke toepassing in de forensische Chemie. MicRoboCop is een systeem bestaande uit drie apparaten die, wanneer samen gebruikt, kan de aanwezigheid van schot residu (GSR) te geven door het produceren van een fluorescentie signaal in de aanwezigheid van drie belangrijke analyten (antimoon, lood, en organische componenten van GSR). Het protocol beschrijft de synthese van de biosensoren met behulp van Escherichia coli (E. coli), en de analytische chemie methoden die worden gebruikt om de selectiviteit en de gevoeligheid van de sensoren te evalueren. De werking van het systeem wordt aangetoond door het gebruik van GSR verzameld van de binnenkant van een gebruikte cartridge behuizing. Eenmaal voorbereid, kunnen de biosensoren worden opgeslagen tot ze nodig zijn en kunnen worden gebruikt als een test voor deze belangrijke analyten. Een positieve reactie van alle drie de analyten biedt een vermoedelijke positieve test voor GSR, terwijl elk afzonderlijk apparaat toepassingen heeft voor het opsporen van de analyten in andere monsters (bijv. een detector voor lood contaminatie in drinkwater). De belangrijkste beperking van het systeem is de tijd die nodig is voor een positief signaal; toekomstige werkzaamheden kunnen betrekken het bestuderen van verschillende organismen om de responstijd te optimaliseren.

Fluorescentie Spectra voor de in dit werk gebruikte offerte variant worden weergegeven in Figuur 2. Deze gegevens zijn afkomstig van het PbRFP-apparaat als het reageert op lead en de TNT-offerte apparaat als het reageert op twee analyten, 2, 4-DNT en 1, 3-DNB. Dit cijfer toont het spectrum van een negatieve controle (geen analyt toegevoegd), en de spectra op twee verschillende niveaus van analyt toegevoegd. Het maximum fluorescentie signaal voor de gebruikte offerte varia...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

Een protocol wordt gepresenteerd met behulp van synthetische biologietechnieken om een set van bacteriële biosensoren voor de analyse van schot residu te synthetiseren, en om de werking van de apparaten te testen voor het beoogde gebruik met behulp van fluorescentiespectroscopie.

Voorbereiding en toepassing van een nieuwe bacteriële biosensor voor de vermoedelijke detectie van schot residu

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Dit protocol beschrijft de voorbereiding en analyse van een unieke biosensor die is ontworpen om de chemische componenten van kruitresten te detecteren. Het gebruik van biosensoren voor forensische toepassingen is uniek. Het vertegenwoordigt een low-cost, eenvoudig te gebruiken alternatief voor de zeer gespecialiseerde instrumentatie meestal gebruikt in forensische laboratoria.De synthetische biologie methoden beschreven kan worden gebruikt voor elk systeem dat standaard synthetische biologie onderdelen gebruikt. De beschreven chemische analyse is van toepassing op elke biosensor die rood fluorescerend eiwit uitdrukt. Demonstreren van de procedure zal Andrea Soles en Elle Richardson, undergraduate studenten aan de Longwood University.Om deze procedure te beginnen, voeg tien microliters van de eerder geïsoleerde J10060 plasmide DNA toe aan een microcentrifugebuis. Voeg acht microliter water, en een microliter van elk van de EcoRI en NHEL enzymen voorgemixt met een microliter van buffer. Voor de promotor DNA, voeg tien microliters van geannealed promotor DNA sequenties aan een verse microcentrifuge buis.Voeg acht microliter water, en een microliter van elk van de EcoRI en NHEL enzymen voorgemixt met een microliter van buffer. Met behulp van een pipet ingesteld op tien microliters, voorzichtig pipette de monsters op en neer te mengen. Incubeer de monsters op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Verwarm en activeer de enzymen vervolgens gedurende vijf minuten bij 80 graden Celsius. Bewaar het verteerde DNA in een vriezer tot het klaar is om verder te gaan. Gebruik eerst het plasmide en promotor-DNA dat eerder werd verteerd om de reactie op te zetten in een microcetrifugebuis op ijs, zoals beschreven in tabel één van het tekstprotocol.Zorg ervoor dat de T4 DNA Ligase als laatste wordt toegevoegd. Pipet op en neer zachtjes om de reactie te mengen, en centrifuge kort. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende tien minuten.Verwarm en activeer vervolgens gedurende tien minuten bij 65 graden Celsius. Voer de transformatie uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Stel eerst de reactiemengsels voor PCR in, zoals beschreven in tabel twee van het tekstprotocol.Voorzichtig pipette op en neer om de reacties te mengen. Schraap met een gele pipetpunt een kolonie van de getransformeerde E.coli. Breng een veeg van deze E.coli over op een nieuwe LB-ampicilline agarplaat die is afgesneden en steek vervolgens de pipettepunt in de PCR-buis.Schud de pipettip om de E.Coli te mengen met de PCR mix. Herhaal dit proces nog drie keer voor extra kolonies. Laad vervolgens de PCR-buizen in een PCR-machine en begin met thermocycling zoals beschreven in tabel drie van het tekstprotocol.Om te beginnen met het labelen van het juiste aantal steriele kweekbuizen zoals beschreven in tabel vier van het tekstprotocol. Voeg twee milliliter van de bereide kweekbouillon toe aan elke buis. Voeg de anilietvoorraadoplossing toe aan de buizen zoals beschreven in tabel vier.Plaats vervolgens de snap caps op de kweekbuizen, zodat ze los zijn om de luchtstroom in de buis mogelijk te maken. Vortex elke cultuurbuis. Plaats de buizen hierna in een schuddende couveuse bij 37 graden Celsius en bij 220 rpm gedurende ten minste 24 uur.Gebruik eerst een op ethanol gebaseerde veeg die is ontworpen voor het verwijderen van lood om alle oppervlakken van de handen af te vegen, inclusief tussen de vingers. Bewaar de doekjes in een op de juiste manier gelabeld afsluitbaar zakje tot de analyse. Gebruik een op alcohol gebaseerde veeg om alle grote oppervlakken af te vegen die moeten worden getest.Gebruik een katoenen swap bevochtigd met ethanol om eventuele kleine oppervlakken af te vegen die moeten worden getest. Het dragen van schone handschoenen en met behulp van een schaar die zijn gereinigd met alcohol, snijd een sectie die ongeveer een vierkante centimeter uit het midden van de doekje. Plaats vervolgens het gesneden stuk doekje, of wattenstaafje, direct in een kweekbuis met twee milliliters van de sensorbacteriën en zorg ervoor dat het volledig in de bouillon wordt ondergedompeld.Bereid de spectrometer voor om fluorescerende onderwerping te verzamelen op de juiste golflengte voor de RFP-variant, met een excitatiegolflengte van 500 nanometer. Gebruik vervolgens een vortexmixer om de buizen te schudden. Breng elke supernatant voorzichtig over op een cuvette met een laag volume en verzamel de emissie-intensiteit.Met behulp van een vortex mixer, schud de buizen. Breng 200 microliter van de bouillon over naar een put in de putplaat. Noteren welke monsters ging in elke put van deze plaat.Stel de flourometer in om de emissie-intensiteit te verzamelen op de juiste golflengte voor de RFP-variant. De fluorescentie spectra voor een representatieve RFP variant toont zowel de negatieve controle en de spectra op twee verschillende niveaus van aniliet toegevoegd. Het maximale fluorescerende signaal voor de RFP-variant die in dit werk wordt gebruikt, wordt waargenomen op 575 nanometer.Representatieve gegevens worden verzameld voor dezelfde set oplossingen, zowel van de draagbare spectrometer als de fluorometer. Er is een algemene trend van de fluorescentie toeneemt naarmate de concentratie aniliet toeneemt. Het is vermeldenswaard dat bij hoge concentraties, meer dan ongeveer 800 delen per miljard voor de loodsensor, de respons daalt als gevolg van de toxiciteit van lood bij zo'n hoge concentratie.Analyse van ethanol wattenstaafje monsters van de binnenkant van een gebruikte 40 kaliber cartridge behuizing levert het bewijs van de belangrijkste resultaten. De positieve resultaten van elk van de drie sensorbacteriën wijzen op een positieve test op kruitresten. De biosensoren die in dit protocol worden bereid, kunnen ook individueel worden gebruikt om verontreiniging in voedsel-, water- of milieumonsters op te sporen.Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om biosensoren te ontwikkelen met behulp van standaard synthetische biologie technieken voor een verscheidenheid van verschillende chemische anilites. Persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gedragen en analisten moeten de handen wassen en oppervlakken ontsmetten na het hanteren van E.coli. Afvalstoffen moeten automatisch worden gehakt en afval dat zwaar metaal bevat, moet dienovereenkomstig worden behandeld.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

Voorbereiding en gebruik van samariumdijodide (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) In Organic Synthesis: The mechanische rol van HMPA en Ni (II) zouten in de Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Synthese van Hypervalente jodonium Alkynyl triflaten voor de toepassing van genereren Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Isolatie en bereiding van bacteriële celwanden voor compositorische analyse door Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Voorbereiding van Mica en Silicon substraten voor DNA Origami Analyse en Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol voor de synthese van<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated anilinederivaten

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Eiwitsynthese Bioconjugaten<em&gt; via</em&gt; Cysteïne-maleïmide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Synthese van Worm-micellen door het zichtbare licht Mediated Dispersion polymerisatie onder toepassing van Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Voorbereiding en evaluatie van<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-gelabelde tridentaat Chelates voor Pre-targeting Met behulp Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...