Name: preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00
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Die Autoren möchten die Studenten der Longwood University in BIOL 324 (Genetics) und die Studierenden von CHEM 403 (Advanced Chemical Laboratory Problem Solving) würdigen, die an der ersten Vorbereitung und Erprobung der Antimonie-und Bleibiosensoren beteiligt waren. Die Idee für MicRoboCop entstand auf dem GCAT SynBIO-Workshop (Sommer 2014), der vom NSF und Howard Hughes Medical Institute finanziert und von der University of Maryland Baltimore County veranstaltet wird. Die Autoren bestätigen auch die Förderung, die sie von der Cook-Cole College of Arts and Sciences der Longwood University und dem GCAT SynBio Alumni Grant erhalten haben.

NOTE: Synthese von E. coli Ausdruck RFP wird vorgestellt.
1. Zubereitung der Plasmid-DNA von E. coli
<ol><li>Tauen Sie E.coli , das ein Plasmid mit einem RFP-Gen und Ampicillin-Resistenz-Gen enthält, und wachsen Sie die E.coli auf Luria Broth (LB) Agarplatten, die 100 μg/mL Ampicillin bei 37 ° C für 24 Stunden enthalten. Verwenden Sie zum Beispiel das Plasmid J10060 aus der Registry der für die synthetische Biologie verwendeten Standardteile (siehe <s...

<ol>
	<li>Eschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;The+Story+of+the+Real+Canary+in+the+Coal+Mine.&#34;.">&#34;The Story of the Real Canary in the Coal Mine.&#34;.</a> The Smithsonian Magazine. , (2016).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors &#38; Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. 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Änderungen und Fehlerbehebungen
Das in Tabelle 4 beschriebene Experiment kann in jeder Weise modifiziert werden, die den entworfenen Sensoren entspricht. Der wichtigste Aspekt eines chemischen Sensors ist die Bewertung seiner Empfindlichkeit und Spezifität. Es ist von Vorteil, dass eine Vielzahl von Konzentrationen des Analyten analysiert wird, um den nützlichen Analysebereich des Sensors zu bestimmen. Es lohnt sich auch, ein Maximum an Analyte für die Zel...

Ein Biosensor ist jedes Analysegerät, das biologische Komponenten (wie Proteine, Nukleinsäuren oder ganze Organismen) verwendet, die eine Reaktion erzeugen, die zur Erkennung einer chemischen Substanz oder eines Analyten verwendet werden kann. Zum Beispiel nutzte der Kohlebergbau einen Biosensor für einen Großteil des 20. Jahrhunderts, um das Vorhandensein giftiger Minengase zu erkennen: Den Kanarienvogel in der Kohlemine1. Die Reaktion des biologischen Organismus (Tod oder Bedrängnis) auf einen chemischen Analyten (Kohlenmonoxid) wurde von den Bergarbeitern beobachtet, um die Arbeiter zu schützen. In einem moderneren und ausgeklügelteren Beispiel können Bakterien mit synthetischen Biologie-Techniken verändert werden, um auf das Vorhandensein eines bestimmten chemischen Analyten zu reagieren, indem eine spezifische Reaktion, wie die Expression eines fluoreszierenden Proteins, angezeigt wird.
Die synthetische Biologie ist ein breiter Begriff, der sich auf den Bau biologischer Geräte und Systeme bezieht, die nicht auf natürliche Weise existieren, oder auf die Neugestaltung bestehender biologischer Systeme für einen bestimmten Zweck2. Die synthetische Biologie unterscheidet sich von der Gentechnik durch eine Standardmethodik und das Vorhandensein standardisierter Teile (Standard-synthetische Biologie-genetische Elemente), die zur Synthese von Geräten und Systemenverwendet werden können. Ein Teil wird in das Genom eines Gerätes,eines Organismus wie eines Bakteriums, eingeführt, um ein bestimmtes Merkmal auszudrücken, das als Funktionsindikation dienen wird. So wird bei vielen synthetischen Geräten der Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins als Reporter-Protein in einen einzigen zellenden Organismus eingeführt. Mehrere Geräte können zu einem Systemkombiniert werden. Die Genome von Mikroorganismen wie Bakterien lassen sich auf diese Weise leicht manipulieren. In den letzten zehn Jahren wurden in der Literatur zahlreiche Beispiele von Biosensoren berichtet,dieauf eine VielzahlchemischerAnalyten zugeschnitten sind.
In dieser Arbeit wird das MicRoboCop-System als Beispiel für einen Biosensor präsentiert, der mit synthetischen Biologie-Techniken mit neuartigen Anwendungen in der forensischen und ökologischen Chemie entwickelt wurde. MicRoboCop ist ein System von drei separaten Geräten, die, wenn sie kombiniert werden, es Escherichia coli ermöglichen, rotes fluoreszierendes Protein (RFP) in Anwesenheit von Schussrückständen (GSR) auszudrücken, die aus den Händen einer Person oder einer Oberfläche gesammelt wurden. Jedes der drei Geräte reagiert auf einen spezifischen chemischen Analyten, der als Bestandteil von GSR5bekannt ist. Die drei Analyten, auf die das System reagiert, sind I. 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) und verwandte Verbindungen, II. Blei (in Form von Blei-Ionen), und III. Antimon (auch in Form von Ionen).
GSR besteht aus vielen verschiedenen chemischen Substanzen, aber die drei, die normalerweise verwendet werden, um einen Rückstand zu identifizieren, wie GSR sind Barium, Blei und Antimon5. Der Standard-Nachweistest zur Identifizierung von GSR ist die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit energiedispergierender Röntgenfluoreszenz (EDX)5. SEM-EDX ermöglicht es Analysten, die einzigartigen Morphologie und die Elementarkomponenten der GSR zu identifizieren. Derzeit gibt es nur wenige weit verbreitete binäre Anmaßungstests zur Verfügung. In einem kürzlich veröffentlichten Präsenztest wird die Ionenbewegungsspektroskopie (IMS) verwendet, die spezialisierte Geräte ist, die in vielen Labors6nicht verfügbar sein könnten. Es gibt auch ein paar farbige "Spot"-Tests, die verwendet werden können, obwohl sie in der Regel für die Distanzbestimmung oder für die GSR-Identifikation auf Einschusslöchern und Wunden 5 verwendet werden. Darüber hinaus gab es in der Literatur eine begrenzte Aufmerksamkeit für elektrochemische Tests für GSR, die voltammetrische Analyse, die den Vorteil hat, dass potenziell Feld tragbar ist, oder anodic Stripping Voltammetry, die eine extrem Empfindliche Methode für metallische Elemente7. In der Literatur von Biosensoren, die speziell für die Erkennung von GSR entwickelt wurden, wird nur sehr wenig erwähnt, obwohl einige Biosensoren für andere forensische Anwendungen veröffentlicht wurden8.
Die biologischen Elemente für jedes Gerät im MicRoboCop-System und die Plasmid-Konstruktion sind in Abbildung1 dargestellt. Der geschwungene Pfeil in Abbildung 1b stellt die Promoter-Region dar, die in Anwesenheit des Analyten aktiviert wird, das Oval ist die ribosomale Bindungsstelle, die die Übersetzung des Reporter-Proteins ermöglicht, die graue Box mit der Bezeichnung RFP ist das Gen, das Rot drückt Fluoreszierendes Protein, und das rote Achteck ist die Transkriptionsabbruchstelle. Alle drei Geräte werden zusammen als System zur Erkennung von GSR eingesetzt. Jedes Gerät mit einem bestimmten Promoter (SbRFP, PbRFP und TNT-RFP) wird mit der Probe, die getestet wird, inkubiert und die Fluoreszenz von RFP wird gemessen. RFP wird nur dann zum Ausdruck gebracht, wenn der entsprechende chemische Analyt vorhanden ist und die Promoterregion aktiviert wird. Drei Geräte, die auf einige der in GSR vorhandenen chemischen Substanzen reagieren, wurden entworfen und werden in dieser Arbeit vorgestellt.
Die Promoter, die in den drei MicRoboCop-Geräten eingesetzt werden, sind ein arsen-und antimonempfindlicher Promoter, SbRFP 9 , 10,ein bleisensibler Promoter, PbRFP11, 12und ein TNT-sensibler Promoter, TNT-RFP 13. Da eine Suche in der Literatur keinen Promoter ergab, der darauf reagiert, wurde stattdessen der TNT-Promoter ausgewählt, da dieser Promoter empfindlich auf eine Reihe von strukturell verwandten Verbindungen reagiert (insbesondere 2,4-Dinitrotoluene und Dinitrobenzol), die als Teil der organischen Verbindungen bekannt sind, die in der GSR zurückgelassen werden. Dieser Projektträger wurde erfolgreich eingesetzt, um in vergrabenen Landminen 13 Minenmengen von TNT und 2,4-Dinitrotoluol (2,4-DNT) gezielt zu erkennen. Mit den drei Geräten gemeinsam als System wird ein positiver Test für GSR in allen drei Geräten Fluoreszenz erzeugen. Ein Fluoreszenzsignal in nur einem oder zwei Geräten zeigt eine andere Umweltquelle der Analyten oder im Fall des TNT-Promoters an, die Aktivierung durch eine Verbindung, die keine organische Verbindung ist, die in GSR zurückgelassen wird. Durch die gemeinsame Nutzung aller drei Geräte wird die Möglichkeit eines falschen positiven Ergebnisses aufgrund von Umweltquellen minimiert. Bleifreie Munition, die an Popularität gewinnt, macht immer noch nur etwa 5% des Munitionsverkaufs in den USA aus; Daher können falsche negative Ergebnisse aufgrund des Fehlens von Blei möglich sein, aber es gibt immer noch einen Nutzen in einem Sensor, der Blei als Markerfür GSR 14 verwendet. Zusätzlich zu dieser speziellen forensischen Anwendung kann jedes Gerät separat zur Erkennung von Umweltbelastungen eingesetzt werden.
Zu den vorgestellten Protokollen gehören die synthetischen Biologietechniken, mit denen die Geräte (Sensorbakterien) erstellt werden, und die Analysetechniken, um die Funktion der Geräte zu überprüfen und die erhaltenen Fluoreszenzsignale zu analysieren. Das Protokoll umfasst auch die Sammlung von forensischen Beweisen in Form von Handwischungen, um GSR aus den Händen eines Verdächtigen oder Swabbing zu sammeln, um GSR von einer Oberfläche zu sammeln. Die Ergebnisse des Bleisensor-Gerätes werden als Beispielresultate dargestellt, zusammen mit der Demonstration eines positiven Tests für GSR mit einem verbrauchten Patronengehäuse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3-dinitrobenzene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D194255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-dinitrotoluene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>101397-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA450-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duplex Buffer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-03-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, HPLC grade, denatured</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC611050040</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GTAAAACGACGGCCAGTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SL21-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes</td>
			<td>Hygenall</td>
			<td>45NRCN</td>
			<td>Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology</td>
			<td>Registry of Standard Biological Parts</td>
			<td></td>
			<td>http://parts.igem.org/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promoter Sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Sb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCAGTCAT 
			ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG 
			AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT 
			GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC 
			GTTGTTAGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			Pb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCGTCTTG 
			ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA 
			ACGCGAGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG 
			ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			TNT promoter: 5&#8217;GCATTCTAGATCAATT 
			TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT 
			TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA 
			CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT 
			CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3&#8217; 3&#8217;CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG 
			CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT 
			TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT 
			GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA 
			ATTAACTTAAGCGTA5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GGAAACAGCTATGACCATG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue

MicRoboCop ist ein Biosensor, der für eine einzigartige Anwendung in der forensischen Chemie entwickelt wurde. MicRoboCop ist ein System, das aus drei Geräten besteht, die, wenn sie zusammen verwendet werden, das Vorhandensein von Schussrückständen (GSR) anzeigen können, indem sie ein Fluoreszenzsignal in Anwesenheit von drei Schlüsselanalyten (Antimon, Blei und organische Komponenten der GSR) erzeugen. Das Protokoll beschreibt die Synthese der Biosensoren mit Escherichia coli (E. coli) und die analytischen Methoden der Chemie, mit denen die Selektivität und Empfindlichkeit der Sensoren bewertet wird. Die Funktionsweise des Systems wird durch die Verwendung von GSR aus dem Inneren eines verbrauchten Patronenhülers gesammelt. Nach der Vorbereitung können die Biosensoren bis zum Bedarf gespeichert und als Test für diese Schlüsselanalysen verwendet werden. Eine positive Resonanz aller drei Analyten liefert einen voraussichtlichen positiven Test für GSR, während jedes einzelne Gerät Anwendungen zur Erkennung der Analyten in anderen Proben (z.B. ein Detektor für Bleikontamination im Trinkwasser) hat. Die Haupteinschränkung des Systems ist die Zeit, die für ein positives Signal erforderlich ist; In Zukunft kann es sein, verschiedene Organismen zu untersuchen, um die Reaktionszeit zu optimieren.

Fluoreszenzspektren für die RFP-Variante, die in dieser Arbeit verwendet wird, sind in Abbildung2 dargestellt. Diese Daten stammen vom PbRFP-Gerät, da es auf Blei und das TNT-RFP-Gerät reagiert, da es auf zwei Analyten reagiert, 2, 4-DNT und 1,3-DNB. Diese Abbildung zeigt das Spektrum einer negativen Kontrolle (kein Analyte hinzugefügt), und die Spektren auf zwei verschiedenen Ebenen der Analyse hinzugefügt. Das maximale Fluoreszenzsignal für die verwendete RFP-Vari...

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Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

Ein Protokoll wird mit synthetischen Biologie-Techniken vorgestellt, um eine Reihe von bakteriellen Biosensoren zur Analyse von Schussrückständen zu synthetischen Biologiesensoren zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetischen Sensoren zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisch zu synthetisieren und die Funktionsweise der Geräte mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie auf ihren beabsichtigten Einsatz zu testen.

Vorbereitung und Anwendung eines neuen bakteriellen Biosensors für die präventive Erkennung von Gunshot Residue

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Analyse eines einzigartigen Biosensors, der entwickelt wurde, um die chemischen Komponenten von Schussrückständen zu erkennen. Der Einsatz von Biosensoren für forensische Anwendungen ist einzigartig. Es stellt eine kostengünstige, einfach zu bedienende Alternative zu den hochspezialisierten Instrumenten dar, die typischerweise in forensischen Laboratorien verwendet werden.Die beschriebenen Methoden der synthetischen Biologie können für jedes System verwendet werden, das standardsynthetische Biologieteile verwendet. Die beschriebene chemische Analyse ist auf jeden Biosensor anwendbar, der rotes fluoreszierendes Protein ausdrückt. Demonstriert wird das Verfahren von Andrea Soles und Elle Richardson, Studenten der Longwood University.Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie zehn Mikroliter der zuvor isolierten J10060-Plasmid-DNA in ein Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie acht Mikroliter Wasser und je einen Mikroliter der EcoRI- und NHEL-Enzyme vorgemischt mit einem Mikroliter Puffer hinzu. Für die Promotor-DNA fügen Sie zehn Mikroliter geglühter Promotor-DNA-Sequenzen in ein frisches Mikrozentrifugenrohr ein.Fügen Sie acht Mikroliter Wasser und je einen Mikroliter der EcoRI- und NHEL-Enzyme vorgemischt mit einem Mikroliter Puffer hinzu. Mit einer Auf zehn Mikroliter eingestellten Pipette pipette die Proben vorsichtig nach oben und unten, um sie zu mischen. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.Dann die Enzyme bei 80 Grad Celsius fünf Minuten lang erhitzen und aktivieren. Bewahren Sie die verdaute DNA in einem Gefrierschrank auf, bis sie fertig ist. Verwenden Sie zunächst die Plasmid- und Promotor-DNA, die zuvor verdaut wurden, um die Reaktion in einem Mikrocetrifugenrohr auf Eis einzurichten, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben.Achten Sie darauf, die T4 DNA Ligase zuletzt hinzuzufügen. Pipette sanft nach oben und unten, um die Reaktion zu mischen, und Zentrifugieren Sie kurz. Bei Raumtemperatur zehn Minuten lang inkubieren.Dann erhitzen und bei 65 Grad Celsius für zehn Minuten aktivieren. Führen Sie die Transformation wie im Textprotokoll beschrieben durch. Richten Sie zunächst die Reaktionsgemische für PCR ein, wie in Tabelle 2 des Textprotokolls beschrieben.Sanft Pipette nach oben und unten, um die Reaktionen zu mischen. Mit einer gelben Pipettespitze eine Kolonie des transformierten E.coli kratzen. Übertragen Sie einen Wisch dieses E.coli auf eine neue LB-Ampicillin-Agarplatte, die abgetrennt wurde, und legen Sie dann die Pipettenspitze in das PCR-Rohr ein.Schütteln Sie die Pipettenspitze, um den E.Coli mit dem PCR-Mix zu mischen. Wiederholen Sie diesen Vorgang drei weitere Male für zusätzliche Kolonien. Laden Sie dann die PCR-Röhren in eine PCR-Maschine und beginnen Sie mit dem Thermocycling, wie in Tabelle 3 des Textprotokolls beschrieben.Um mit der Bezeichnung der entsprechenden Anzahl steriler Kulturröhren zu beginnen, wie in Tabelle 4 des Textprotokolls beschrieben. Fügen Sie zwei Milliliter der vorbereiteten Kulturbrühe zu jeder Röhre hinzu. Fügen Sie die Anilite-Stammlösung zu den Rohren hinzu, wie in Tabelle 4 beschrieben.Legen Sie dann die Schnappkappen auf die Kulturrohre, damit sie lose sind, um Luftinlauf in das Rohr zu ermöglichen. Wirbel jede Kulturröhre. Danach die Rohre bei 37 Grad Celsius und mindestens 24 Stunden in einen Schüttel-Inkubator geben.Verwenden Sie zunächst ein Aufdemaum basierendes Tuch auf Ethanolbasis zum Entfernen von Blei, um alle Oberflächen der Hände, einschließlich zwischen den Fingern, abzuwischen. Bewahren Sie die Tücher bis zur Analyse in einem entsprechend beschrifteten verschließbaren Baggie auf. Verwenden Sie ein alkoholbasiertes Tuch, um alle zu prüfenden großen Oberflächen abzuwischen.Verwenden Sie einen mit Ethanol befeuchteten Baumwolltausch, um zu prüfende kleine Oberflächen abzuwischen. Mit sauberen Handschuhen und mit einer Schere, die mit Alkohol gereinigt wurde, schneiden Sie einen Abschnitt, der etwa einen Quadratzentimeter aus der Mitte des Wischens ist. Legen Sie dann das geschnittene Stück Wisch, oder Wattestäbchen, direkt in ein Kulturrohr mit zwei Millilitern der Sensorbakterien, und stellen Sie sicher, dass es vollständig in der Brühe versunken ist.Bereiten Sie das Spektrometer vor, um fluoreszierende Unterwerfung bei der entsprechenden Wellenlänge für die RFP-Variante mit einer Anregungswellenlänge von 500 Nanometern zu sammeln. Dann verwenden Sie einen Wirbelmischer, um die Rohre zu schütteln. Übertragen Sie jeden Überstand vorsichtig auf eine Küvette mit geringem Volumen und erfassen Sie die Emissionsintensität.Schütteln Sie die Rohre mit einem Wirbelmischer. 200 Mikroliter der Brühe in einen Brunnen in der Brunnenplatte geben. Zeichnen Sie auf, welche Proben in jeden Brunnen dieser Platte gelangt sind.Richten Sie das Mehlometer ein, um die Emissionsintensität bei der entsprechenden Wellenlänge für die RFP-Variante zu erfassen. Die Fluoreszenzspektren für eine repräsentative RFP-Variante zeigen sowohl die Negativkontrolle als auch die Spektren auf zwei verschiedenen Anilite-Stufen. Das maximale Fluoreszenzsignal für die bei dieser Arbeit verwendete RFP-Variante wird bei 575 Nanometern beobachtet.Repräsentative Daten werden für den gleichen Satz von Lösungen gesammelt, sowohl vom tragbaren Spektrometer als auch vom Fluorometer. Es gibt einen allgemeinen Trend der Fluoreszenz steigt mit der Konzentration von Anlit zu erhöhen. Es ist erwähnenswert, dass bei hohen Konzentrationen, die für den Bleisensor über 800 Teile pro Milliarde liegen, die Reaktion aufgrund der Toxizität von Blei bei einer so hohen Konzentration abfällt.Die Analyse von Ethanol-Tupferproben von der Innenseite eines verbrauchten 40-Kaliber-Patronengehäuses liefert einen Beweis für die wichtigsten Ergebnisse. Die positiven Ergebnisse von jedem der drei Sensorbakterien deuten auf einen positiven Test auf Schussrückstände hin. Die in diesem Protokoll hergestellten Biosensoren können auch einzeln eingesetzt werden, um Verunreinigungen in Lebensmitteln, Wasser oder Umweltproben zu erkennen.Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, Biosensoren mit Standard-Synthetikbiologie-Techniken für eine Vielzahl von verschiedenen chemischen Aniliten zu entwickeln. Persönliche Schutzausrüstung sollte getragen werden, und Analysten sollten Hände waschen und Oberflächen nach dem Umgang mit E.coli desinfizieren. Abfälle sollten autoklaviert werden, und alle altmetallhaltigen Abfälle sollten entsprechend behandelt werden.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

Herstellung und Verwendung von Samariumdiiodid (SmI<sub&gt; 2</sub&gt;) In der organischen Synthese: die mechanistische Rolle von HMPA und Ni (II)-Salzen in Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Forschung

Chemie

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Synthese von hypervalenten Iodonium Alkinyl triflaten für die Anwendung der Gene Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Herstellung von Mica und Siliziumsubstraten für die DNA-Origami-Analyse und Experimentieren

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

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Protokoll für die Synthese von<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated Anilin-Derivate

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

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Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Einfache Synthese von wurmartigen Mizellen durch sichtbares Licht Mediated Dispersion Polymerisation mit Photoredox Katalysator

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

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Herstellung und Auswertung der<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-markierte Dreizähnige Chelate für Pre-Targeting Bioorthogonale Chemie

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...