Name: preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר את התלמידים באוניברסיטת Longwood ב BIOL 324 (גנטיקה) והסטודנטים בכימיה 403 (פתרון בעיה כימית מתקדמת מעבדה) אשר היו מעורבים הכנה הראשונית ובדיקות של אנטימון וחיישנים ביולוגיים עופרת. הרעיון של MicRoboCop היה שנוצר ב-GCAT SynBIO הסדנה (קיץ 2014), אשר ממומן על ידי NSF והווארד יוז המכון הרפואי מתארח על ידי אוניברסיטת מרילנד בבולטימור קאונטי. המחברים גם להכיר מימון שהתקבלו באוניברסיטת Longwood המכללה לאמנויות ומדעים ומענק GCAT SynBio בוגרים.

הערה: סינתזה של E. coli המבטא rfp מוצג.
1. הכנת ה-DNA פלמיד מ E. coli
<ol><li>הפשרת e. coli המכיל פלבין עם גן rfp וגנים אמפיצילין התנגדות ולגדול E. Coli על לוריא ציר (LB) אגר לוחות המכילים 100 μg/ML אמפיצילין ב 37 ° צ' עבור 24 h. לדוגמה, השתמשו בJ10060 פלמיד מהרישום של חלקים ביולוגיים סטנדרט?...

<ol>
	<li>Eschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;The+Story+of+the+Real+Canary+in+the+Coal+Mine.&#34;.">&#34;The Story of the Real Canary in the Coal Mine.&#34;.</a> The Smithsonian Magazine. , (2016).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors &#38; Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+genetically+engineered+microbial+whole-cell+biosensors+for+combined+chemosensing.">Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).</li><li>Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gunshot+Residue+and+Associated+Materials-A+Review.">Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).</li><li>Bell, S., Seitzinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+binary+presumptive+assays+to+probabilistic+assessments:+Differentiation+of+shooters+from+non-shooters+using+IMS,+OGSR,+neural+networks,+and+likelihood+ratios.">From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios.</a> Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).</li><li>O&#39;Mahony, A. M., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Detection+of+Gunshot+Residue+for+Forensic+Analysis:+A+Review.">Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review.</a> Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).</li><li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Biosensor+Technology+for+Potential+Applications+-+An+Overview.">Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).</li><li>Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralogous+Regulators+ArsR1+and+ArsR2+of+Pseudomonas+putida+KT2440+as+a+Basis+for+Arsenic+Biosensor+Development.">Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).</li><li>Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Biological+Organisms+as+Chemical+Sensors:+The+MicRoboCop+Project.">Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project.</a> Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).</li><li>Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+the+pbr+lead+resistance+determinant+of+Ralstonia+metallidurans+CH34.">Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34.</a> Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).</li><li>Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+coordination+of+Pb(II)+is+involved+in+the+PbrR-dependent+activation+of+the+lead-resistance+promoter,+PpbrA,+from+Cupriavidus+metallidurans+CH34.">Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34.</a> Bmc Microbiology. 12, (2012).</li><li>Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene+by+an+Escherichia+coli+bioreporter:+performance+enhancement+by+directed+evolution.">Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).</li><li>Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Guns+in+America:+The+Debate+Over+Lead+Based+Bullets.&#34;.">&#34;Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.&#34;.</a> Newsweek. , (2017).</li><li>Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAAS+Determination+of+Antimony,+Barium,+and+Lead+Levels+in+Gunshot+Residue+Swabs:+An+Application+in+Forensic+Chemistry.">GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry.</a> Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).</li><li>Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+and+Behavior+of+Gunshot+Residue-A+Review.">Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).</li><li>Yagur-Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+bioreporters+for+the+detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene.">Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).</li></ol>

שינויים ופתרון בעיות
ניתן לשנות את הניסוי המתואר בטבלה 4 בכל דרך המתאימה לחיישנים שעוצבו. ההיבט החשוב ביותר של החיישן הכימי הוא להעריך את רגישותו ואת הספציפיות. זה מועיל כדי להבטיח כי מגוון רחב של ריכוזים של האנליטה מנותח כדי לקבוע את מגוון אנליטי שימושי ש...

ביוסנסור הוא כל מכשיר אנליטי המשתמשת ברכיבים ביולוגיים (כגון חלבונים, חומצות גרעין, או אורגניזמים שלמים) המייצרים תגובה כי ניתן להשתמש לאיתור חומר כימי או מכשיר. כדוגמה, תעשיית כריית הפחם בשימוש ביוסנסור עבור הרבה של המאהה -20 כדי לזהות את הנוכחות של גזים רעילים מוקש: הקנרית במכרה פחם1. תגובת האורגניזם הביולוגי (מוות או מצוקה) לאנליטה כימית (פחמן חד-חמצני) נצפתה על ידי הכורים כדי להגן על העובדים. בדוגמה מודרנית ומתוחכמת יותר, ניתן לשנות חיידקים באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטית כדי להגיב לנוכחות של משתמש כימי מסוים על ידי המציגות תגובה ספציפית, כגון ביטוי של חלבון פלורסנט.
ביולוגיה סינתטית היא מונח רחב המתייחס לבניית מכשירים ביולוגיים ומערכות שאינן קיימות באופן טבעי, או עיצוב מחדש של מערכות ביולוגיות קיימות למטרה מסוימת2. ביולוגיה סינתטית נבדל מהנדסה גנטית על-ידי מתודולוגיה סטנדרטית וקיום חלקים סטנדרטיים (אלמנטים גנטיים סטנדרטיים בביולוגיה סינתטי) שניתן להשתמש בהם כדי לסנתז מכשירים ומערכות. חלק מוצג לתוך הגנום של המכשיר, אורגניזם כגון חיידק, כדי לבטא תכונה מסוימת שתשמש כאינדיקציה לפונקציה. לדוגמה, במכשירים סינתטיים רבים, הביטוי של חלבון פלורסנט מוצג לתוך אורגניזם תא יחיד כחלבון עיתונאי. ניתן לשלב התקנים מרובים במערכת. הגנום של מיקרואורגניזמים כגון חיידקים קל לתמרן באופן זה. דוגמאות רבות של ביוחיישנים ספציפיים למגוון רחב של מנתחי כימיים דווחו בספרות בעשור האחרון3,4.
בעבודה זו, מערכת microbocop מוצג כדוגמה ביוסנסור שתוכננה באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטי עם יישומים חדשניים בכימיה משפטית וסביבתית. MicRoboCop היא מערכת של שלושה מכשירים נפרדים, כי, כאשר בשילוב, יאפשר es, coli לבטא חלבון פלורסנט אדום (rfp) בנוכחות של שאריות ירי (gsr) כי נאסף מידי אדם או משטח. כל אחד משלושת המכשירים מגיב למכשיר כימי מסוים שידוע כמרכיב של GSR5. שלושת האנליטים שבהם המערכת מגיבה הם אני. 2, 4, 6-trinitrotolene (TNT) ותרכובות קשורות, II. עופרת (בצורת יונים מובילים) ו-III. אנטימון (גם בצורת יונים).
GSR מורכב מחומרים כימיים רבים ושונים, אבל השלושה משמשים בדרך כלל כדי לזהות שאריות כמו GSR הם בריום, עופרת, ו אנטימון5. בדיקת הראיות הסטנדרטית לזיהוי של GSR היא להשתמש סריקת אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) עם אנרגיה מפזרים X-ray פלואורסצנטית (EDX)5. SEM-EDX מאפשר לאנליסטים לזהות את המבנה הייחודי ואת הרכיבים היסודיים של GSR. כיום, ישנם מספר בדיקות שימוש נרחב שוערת בינארי זמין. בדיקה שוערת שפורסמה לאחרונה משתמשת בספקטרוסקופיית מוביליות (IMS), שהיא ציוד מיוחד שעשוי שלא להיות זמין במעבדות רבות6. יש גם כמה צבעים "ספוט" בדיקות שניתן להשתמש בהם, למרות שהם משמשים בדרך כלל לקביעת מרחק או לזיהוי GSR על חורי קליע ופצעים5. בנוסף, יש כבר כמה תשומת לב מוגבלת בספרות כדי בדיקות אלקטרוכימי של GSR כי להעסיק ניתוח וולטמטרי, אשר יש את היתרון של הפוטנציאל להיות נייד בתחום, או בנוכחות אנוטמטריה הלונדית, שהיא מאוד שיטה רגישה לאלמנטים מתכתיים7. יש מעט מאוד להזכיר בספרות של אנלייזרים תוכנן במיוחד לצורך זיהוי gsr, למרות כמה ביולוגי יישומים משפטיים אחרים פורסמו8.
האלמנטים הביולוגיים של כל מכשיר במערכת המיקרובווטר, והבנייה הפלסמיד, מומחשים באיור 1. החץ המעוקל באיור 1b מייצג את אזור המקדם המופעל בנוכחות האנליטה, האליפסה היא אתר הכריכה הריבוזומלי המאפשר תרגום של חלבון הכתב, התיבה האפורה הנקראת rfp הוא הגן המבטא אדום חלבון פלורסנט, והמתומן האדום הוא האתר לסיום התמלול. כל שלושת המכשירים ישמשו יחד כמערכת כדי לזהות GSR. כל התקן עם מיזם מסוים (SbRFP, PbRFP, ו-TNT-RFP) יהיה מודבטים עם המדגם כי הוא נבדק והזריחה של RFP יהיה נמדד. RFP יהיה רק להתבטא אם האנליטה הכימי המתאים קיים ומפעיל את אזור היזם. שלושה מכשירים המגיבים לחלק מהחומרים הכימיים המצויים בתוך GSR תוכננו ומוצגים בעבודה זו.
היזמים המשמשים את שלושת המכשירים microbocop הם מקדם ארסן ו אנטימון רגיש, sbrfp9,10, מקדם רגיש להוביל, pbrfp11,12 ו מיזם רגיש TNT, TNT-RFP 13. בגלל חיפוש בספרות חשף מקדם שנועד להגיב בריום, מיזם TNT נבחר במקום מיזם זה הוא רגיש למספר תרכובות קשורות מבנית (בפרט, 2, 4-dinitrotoluene ו dinitrobenzene נזן) כי הם ידועים להיות חלק התרכובות אורגני שנותרו מאחור GSR. יזם זה בהצלחה שימש לזהות באופן ספציפי כמויות דקות של TNT ו 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) במכרות אדמה קבורים13. באמצעות שלושת המכשירים יחד כמערכת, בדיקה חיובית עבור GSR יפיק פלואורסצנטית בכל שלושת המכשירים. אות פלואורסצנטית רק אחד או שניים התקנים יציין מקור אחר של הסביבה של האנליטה (s) או במקרה של מקדם TNT, הפעלה על ידי תרכובת שאינה תרכובת אורגנית שנותרה מאחור ב-GSR. על ידי שימוש בכל שלושת המכשירים יחד, האפשרות של תוצאות חיוביות שווא בשל מקורות סביבתיים הוא ממוזער. תחמושת ללא עופרת, הצוברת פופולריות, עדיין מייצגת רק כ -5% ממכירת התחמושת בארצות הברית; מכאן, תוצאות שליליות שווא בשל היעדר העופרת עשויה להיות אפשרות אבל יש עדיין שירות בחיישן המשתמשת להוביל כסמן עבור GSR14. בנוסף ליישום המשפטי הספציפי הזה, ניתן להשתמש בכל אחד מההתקנים בנפרד לצורך זיהוי מזהמים סביבתיים.
הפרוטוקולים המוצגים כוללים את טכניקות ביולוגיה סינתטי המשמשים כדי ליצור את המכשירים (חיידקים חיישן) ואת הטכניקות האנליטיות כדי לבדוק את התפקוד של המכשירים ולנתח את אותות הזריחה שהתקבלו. הפרוטוקול כולל גם אוסף של ראיות משפטית בצורה של יד מנגב לאסוף GSR מידיהם של חשוד או שאיפה לאסוף את GSR מפני השטח. תוצאות מהתקן החיישן המוביל מוצגים כתוצאות לדוגמה, יחד עם הדגמה של בדיקה חיובית עבור GSR באמצעות מעטפת מחסנית בילה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3-dinitrobenzene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D194255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-dinitrotoluene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>101397-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA450-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duplex Buffer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-03-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, HPLC grade, denatured</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC611050040</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GTAAAACGACGGCCAGTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SL21-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes</td>
			<td>Hygenall</td>
			<td>45NRCN</td>
			<td>Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology</td>
			<td>Registry of Standard Biological Parts</td>
			<td></td>
			<td>http://parts.igem.org/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promoter Sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Sb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCAGTCAT 
			ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG 
			AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT 
			GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC 
			GTTGTTAGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			Pb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCGTCTTG 
			ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA 
			ACGCGAGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG 
			ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			TNT promoter: 5&#8217;GCATTCTAGATCAATT 
			TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT 
			TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA 
			CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT 
			CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3&#8217; 3&#8217;CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG 
			CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT 
			TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT 
			GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA 
			ATTAACTTAAGCGTA5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GGAAACAGCTATGACCATG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue

Microbocop הוא ביוסנסור כי תוכנן עבור יישום ייחודי בכימיה משפטית. MicRoboCop היא מערכת מורכבת משלושה מכשירים כי, כאשר משתמשים יחד, יכול להצביע על נוכחות של שאריות ירי (GSR) על ידי הפקת אות פלואורסצנטית בנוכחות של שלושה אנליטים מפתח (אנטימון, עופרת, ורכיבים אורגניים של GSR). הפרוטוקול מתאר את הסינתזה של הביוחיישנים באמצעות es, coli קולי (E. coli), ושיטות הכימיה האנליטיות המשמשות להערכת הסלקטיביות והרגישות של החיישנים. תפקוד המערכת מוצג באמצעות GSR שנאסף מתוך מעטפת מחסנית בילה. ברגע שהוכן, הביוחיישנים ניתן לאחסן עד הצורך, והוא יכול לשמש כמבחן עבור אלה מקשים מנתחי. תגובה חיובית של כל שלושת האנליטים מספק בדיקה חיובית שוערת עבור GSR, בעוד כל מכשיר בודד יש יישומים לגילוי האנליטים בדגימות אחרות (למשל, גלאי להוביל זיהום מים שתייה). המגבלה העיקרית של המערכת היא הזמן הנדרש עבור אות חיובי; עבודה עתידית עשויה להיות כרוכה בלימוד אורגניזמים שונים כדי למטב את זמן התגובה.

ספקטרום של קרינה פלואורסצנטית עבור משתנה RFP המשמש בעבודה זו מוצגים באיור 2. נתונים אלה הם מן PbRFP המכשיר כפי שהוא מגיב להוביל ואת TNT-RFP המכשיר כפי שהוא מגיב לשני אנליטים, 2, 4-DNT ו 1, 3-DNT. איור זה מציג את הספקטרום של שליטה שלילית (לא הוסיף אנליטה), ואת ספקטרום בשתי רמות שונ?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

פרוטוקול מוצג באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטי כדי לסנתז סט של חיישנים ביולוגיים לניתוח שאריות ירי, כדי לבדוק את תפקוד המכשירים לשימוש המיועד שלהם באמצעות ספקטרוסקופיית הזריחה.

הכנה ויישום של ביוסנסור בקטריאלי חדש לאיתור שוערת של שאריות ירי

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה והניתוח של biosensor ייחודי שתוכנן לזהות את הרכיבים הכימיים של שאריות ירייה. השימוש בביוסנסורים ליישומים משפטיים הוא ייחודי. הוא מייצג בעלות נמוכה, פשוט לשימוש חלופה מכשור מיוחד מאוד המשמש בדרך כלל במעבדות משפטיות.ניתן להשתמש בשיטות הביולוגיה הסינתטיות המתוארות עבור כל מערכת המשתמשת בחלקי ביולוגיה סינתטיים סטנדרטיים. הניתוח הכימי המתואר חל על כל ביזנסור המבטא חלבון פלואורסצנטי אדום. הדגמת ההליך תהיה אנדריאה סולס ואל ריצ'רדסון, סטודנטים לתואר ראשון באוניברסיטת לונגווד.כדי להתחיל בהליך זה, להוסיף עשרה microliters של ה-DNA פלסמיד J10060 מבודד בעבר לצינור microcentrifuge. הוסף שמונה מיקרוליטרים של מים, ומיקרוליטר אחד של כל אחד מהאנזימים EcoRI ו- NHEL מעורבב מראש עם מיקרוליטר אחד של חיץ. לדנ"א של האמרגן, הוסיפו עשרה מיקרוליטרים של רצפי דנ"א של מקדמים חישולים לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי.הוסף שמונה מיקרוליטרים של מים, ומיקרוליטר אחד של כל אחד מהאנזימים EcoRI ו- NHEL מעורבב מראש עם מיקרוליטר אחד של חיץ. באמצעות פיפטה להגדיר עשרה microliters, בעדינות pipette את הדגימות למעלה ולמטה לערבב. דגירה הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר מכן, מחממים ופעילים את האנזימים ב 80 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחסן את ה-DNA מתעכל במקפיא עד מוכן להמשיך. ראשית, השתמש בדנ"א הפלסמיד והמקדם שעוכל בעבר כדי להגדיר את התגובה בצינור מיקרו-סטריפוגה על קרח, כמתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט.הקפד להוסיף את T4 DNA Ligase האחרון. פיפטה מעלה ומטה בעדינות כדי לערבב את התגובה, וצנטריפוגה בקצרה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות.לאחר מכן, מחממים ומפעילים ב 65 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות. בצע את ההמרה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. תחילה, הגדר את תערובות התגובה עבור PCR כמפורט בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט.בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התגובות. באמצעות קצה פיפטה צהוב, לגרד מושבה של E.coli טרנספורמציה. העבר החלקה של E.coli זה על לוחית אגר LB-אמפילין חדשה שנוקטעה, ולאחר מכן הכנס את קצה פיפטה לתוך צינור PCR.לנער את קצה פיפטה לערבב את E.Coli עם תערובת PCR. חזור על תהליך זה שלוש פעמים נוספות עבור מושבות נוספות. לאחר מכן, לטעון את צינורות PCR לתוך מכונת PCR, ולהתחיל תרמוסיקלינג כפי שמתואר בטבלה שלוש של פרוטוקול הטקסט.כדי להתחיל לתייג את המספר המתאים של צינורות תרבות סטרילית כמפורט בטבלה הרביעית של פרוטוקול הטקסט. מוסיפים שני מיליליטר של מרק התרבות המוכן לכל צינור. הוסף את פתרון מלאי אנילייט לצינורות כמתואר בטבלה ארבע.לאחר מכן, מניחים את כובעי הצמד על צינורות התרבות, כך שהם רופפים כדי לאפשר זרימת אוויר לתוך הצינור. וורטקס כל צינור תרבות. לאחר מכן, מניחים את הצינורות לתוך אינקובטור רועד ב 37 מעלות צלזיוס וב 220 סל"ד לפחות 24 שעות.ראשית, השתמש במגבון מבוסס אתנול המיועד להסרת עופרת כדי לנגב את כל משטחי הידיים, כולל בין האצבעות. לאחסן את המגבונים בשקית איטום שכותרתו כראוי עד לניתוח. השתמשו במגבון מבוסס אלכוהול כדי לנגב משטחים גדולים לבדיקה.השתמש בהחלפת כותנה לחה עם אתנול כדי לנגב את כל המשטחים הקטנים כדי להיבדק. לובש כפפות נקיות באמצעות מספריים כי כבר ניקה עם אלכוהול, לחתוך קטע כי הוא כ סנטימטר מרובע אחד ממרכז הניגוב. לאחר מכן, מניחים את חתיכת לחתוך של לנגב, או צמר גפן ספוגית, ישירות לתוך צינור תרבות המכיל שני מיליליטר של חיידקי החיישן, ולהבטיח כי הוא שקוע לחלוטין במרק.הכינו את הספקטרומטר לאיסוף הגשה פלואורסצנטית באורך הגל המתאים לגרסת RFP, עם אורך גל של 500 ננומטר. לאחר מכן, השתמש מערבל מערבולת לנער את הצינורות. מעבירים בזהירות כל על-טבעי לפחית בנפח נמוך, ואוסף את עוצמת הפליטה.באמצעות מערבל מערבולת, לנער את הצינורות. מעבירים 200 מיקרוליטרים של המרק לגם בצלחת הטובה. הקלט אילו דגימות נכנסו לכל באר של צלחת זו.הגדר את מד הקמח כדי לאסוף את עוצמת הפליטה באורך הגל המתאים עבור גרסה RFP. ספקטרום הפלואורסצנטיות עבור גרסה RFP מייצגת מראה הן את השליטה השלילית והן את הספקטרום בשתי רמות שונות של אנילייט שנוספו. האות הפלואורסצנטי המרבי עבור וריאנט RFP המשמש בעבודה זו נצפה ב 575 ננומטר.נתונים מייצגים נאספים עבור אותה קבוצת פתרונות, הן מהספקטרומטר הנייד והן מהנוהורמטר. יש מגמה כללית של הפלואורסצנטיות עולה כמו הריכוז של אנילייט עולה. ראוי לציין כי בריכוזים גבוהים, מעל 800 חלקים למיליארד עבור חיישן העופרת, התגובה יורדת בשל הרעילות של עופרת בריכוז כה גבוה.ניתוח של דגימות ספוגית אתנול מבפנים של מעטפת מחסנית 40 קליבר בילה מספק הוכחת תוצאות עקרוניות. התוצאות החיוביות מכל אחד משלושת חיידקי החיישן מצביעות על בדיקה חיובית לשאריות ירייה. ניתן להשתמש בביוסנסורים שהוכנו בפרוטוקול זה גם בנפרד כדי לזהות זיהום בדגימות מזון, מים או סביבה.טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לפתח biosensors באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטית סטנדרטית עבור מגוון רחב של אניליטים כימיים שונים. ציוד מגן אישי צריך להיות משוחק, אנליסטים צריכים לשטוף ידיים ולחטא משטחים לאחר טיפול E.coli. פסולת צריכה להיות autoclaved, וכל פסולת המכילה מתכת כבדה יש לטפל בהתאם.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

הכנה ושימוש של סמריום Diiodide (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) בסינתזה אורגנית: התפקיד מכניסטית של HMPA ומלחי ניקל (השני) בתגובת Barbier סמריום

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

סינתזה של Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates ליישום של יצירת Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

בידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוח קומפוזיציוני על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

הכנת מצעים נציץ והסיליקון לDNA אוריגמי ניתוח וניסויים

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

פרוטוקול לסינתזה של<em&gt; Ortho</em&gt; נגזרי אנילין -trifluoromethoxylated

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

סינתזה של חלבון Bioconjugates<em&gt; דרך</em&gt; כימיה ציסטאין-maleimide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

סינתזה קלילה של Micelles תולעת דמוית ידי גלוי אור מתווכת פילמור נפיצה שימוש Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

הכנה והערכה של<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc שכותרתו Tridentate chelates לחינוך קדם-מיקוד שימוש Bioorthogonal לכימיה

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...