Name: preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

著者は BIOL 324 (遺伝学) と、アンチモンおよび鉛バイオセンサーの初期準備と試験に関与していた化学 403 (高度化学実験問題解決) の学生である、ロングウッド大学の学生を認めたいと思います。MicRoboCop のためのアイデアは、NSF とハワード・ヒューズ医学研究所によって資金を提供し、メリーランド大学ボルチモア郡によってホストされている GCAT SynBIO ワークショップ (夏の 2014) で構想されました。また、ロングウッド大学のクック・コール・カレッジ・オブ・アーツ・アンド・サイエンスと GCAT SynBio 同窓会の助成金も受領しています。

注: RFP を発現している大腸菌の合成が提示されている。
1.大腸菌からのプラスミド DNA の調製
<ol><li>RFP 遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を持つプラスミドを含む大腸菌を解凍し、 100 μ g/mL アンピシリンを含有する Luria ブロス (LB) 寒天プレートを24時間37° c で増殖させます。例えば、合成生物学に使用される標準的な生物学的部分のレジ?...

<ol>
	<li>Eschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;The+Story+of+the+Real+Canary+in+the+Coal+Mine.&#34;.">&#34;The Story of the Real Canary in the Coal Mine.&#34;.</a> The Smithsonian Magazine. , (2016).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors &#38; Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+genetically+engineered+microbial+whole-cell+biosensors+for+combined+chemosensing.">Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).</li><li>Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gunshot+Residue+and+Associated+Materials-A+Review.">Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).</li><li>Bell, S., Seitzinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+binary+presumptive+assays+to+probabilistic+assessments:+Differentiation+of+shooters+from+non-shooters+using+IMS,+OGSR,+neural+networks,+and+likelihood+ratios.">From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios.</a> Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).</li><li>O&#39;Mahony, A. M., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Detection+of+Gunshot+Residue+for+Forensic+Analysis:+A+Review.">Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review.</a> Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).</li><li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Biosensor+Technology+for+Potential+Applications+-+An+Overview.">Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).</li><li>Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralogous+Regulators+ArsR1+and+ArsR2+of+Pseudomonas+putida+KT2440+as+a+Basis+for+Arsenic+Biosensor+Development.">Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).</li><li>Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Biological+Organisms+as+Chemical+Sensors:+The+MicRoboCop+Project.">Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project.</a> Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).</li><li>Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+the+pbr+lead+resistance+determinant+of+Ralstonia+metallidurans+CH34.">Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34.</a> Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).</li><li>Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+coordination+of+Pb(II)+is+involved+in+the+PbrR-dependent+activation+of+the+lead-resistance+promoter,+PpbrA,+from+Cupriavidus+metallidurans+CH34.">Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34.</a> Bmc Microbiology. 12, (2012).</li><li>Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene+by+an+Escherichia+coli+bioreporter:+performance+enhancement+by+directed+evolution.">Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).</li><li>Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Guns+in+America:+The+Debate+Over+Lead+Based+Bullets.&#34;.">&#34;Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.&#34;.</a> Newsweek. , (2017).</li><li>Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAAS+Determination+of+Antimony,+Barium,+and+Lead+Levels+in+Gunshot+Residue+Swabs:+An+Application+in+Forensic+Chemistry.">GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry.</a> Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).</li><li>Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+and+Behavior+of+Gunshot+Residue-A+Review.">Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).</li><li>Yagur-Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+bioreporters+for+the+detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene.">Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).</li></ol>

修正とトラブルシューティング
表 4に記載した実験は、設計されたセンサに適切な任意の方法で修正することができる。化学センサーの最も重要な側面は、その感度と特異性を評価することです。センサの有用な分析範囲を決定するために、検体の濃度の広い範囲が分析されることを確実にすることが有益である。また、細胞のための検体の最?...

バイオセンサは、化学物質または検体の検出に使用できる応答を生成する生物学的成分 (例えば、タンパク質、核酸、または生物全体) を使用する任意の分析装置です。例として、石炭鉱業は、有毒な鉱山ガスの存在を検出するために20世紀の多くのためにバイオセンサを使用しました: 炭鉱1のカナリア。生物の生物 (カナリア) は、化学物質 (一酸化炭素) への応答 (死または苦痛) を労働者を保護するために鉱夫によって観察されました。より現代的で洗練された例では、細菌は、蛍光タンパク質の発現のような特定の反応を示すことによって特定の化学分析物の存在に応答する合成生物学技術を使用して改変することができる。
合成生物学は、自然に存在しない生物学的デバイスやシステムの構築、または特定の目的のための既存の生物学的システムの再設計を指す広義の用語である2.合成生物学は、標準的な方法論と、デバイスやシステムの合成に使用できる標準化された部品(標準合成生物学の遺伝的要素) の存在によって、遺伝子工学とは区別される。ある部位は、細菌のような生物である装置のゲノムに導入され、機能の指標として役立つ特定の形質を発現する。例えば、多くの合成デバイスにおいて、蛍光タンパク質の発現は、レポータータンパク質として単細胞生物に導入される。複数のデバイスをシステムに結合することができます。細菌などの微生物のゲノムは、このように操作が容易です。様々な化学物質に特有のバイオセンサーの多くの例は、過去10年間の文献で報告されています3,4.
この研究では、MicRoboCop システムは、法医学および環境化学における新規アプリケーションと合成生物学技術を使用して設計されたバイオセンサの例として提示されています。MicRoboCop は3つの装置のシステムで、これを組み合わせることにより、ヒトの手や表面から採取された銃創 (GSR) によって、大腸菌が赤色蛍光タンパク質 (RFP) を発現することを可能にします。3つの装置の各々は、GSR5の構成要素であることが知られている特定の化学分析物に応答する。システムが応答する3つの分析対象は、I. 2, 4, 6-トリニトロトルエン (TNT) および関連化合物 II.鉛 (鉛イオンの形で)、および III.アンチモン (イオンの形態でも)。
GSR には多くの異なる化学物質が含まれていますが、主に GSR としての残渣を特定するために使用される3つは、バリウム、鉛、およびアンチモン5です。GSR の同定のための標準証拠試験は、エネルギー分散型 X 線蛍光 (EDX)5で走査電子顕微鏡 (SEM) を使用することである。SEM-BPS では、分析者が GSR の固有の形態および元素成分を特定することができます。現在、利用可能ないくつかの広く使用されているバイナリ推定試験があります。最近公表された推定試験の1つはイオンモビリティ分光法 (IMS) を使用しており、これは多くのラボ6では利用できないかもしれない特殊な装置です。また、使用できる色の「スポット」テストもいくつかありますが、通常は距離の決定や、弾丸穴や創傷5の GSR の識別に使用されます。さらに、ボルタンメトリー分析を使用する GSR のための電気化学試験に関する文献の一部には限定的な注意が払われており、これは潜在的に移植可能なフィールド、または陽極ストリッピングボルタンメトリーの利点があり、これは非常に金属元素の敏感な方法7.GSR を検出する目的のために特別に設計されたバイオセンサーの文献にはほとんど言及されていませんが、他の法医学アプリケーション用の一部のバイオセンサーは8を公開しています。
MicRoboCop システムにおける各デバイスの生物学的要素と、プラスミドの構造について、図 1に示します。図 1bにおいて湾曲した矢印は、検体の存在下で活性化されるプロモーター領域を表し、その楕円形は、レポータータンパク質の翻訳を可能にするリボソーム結合部位であり、RFP とラベル付けされた灰色のボックスは赤色を発現する遺伝子である蛍光タンパク質、および赤色八角形は転写終結部位である。3つのデバイスはすべて、GSR を検出するシステムとして一緒に使用されます。特定のプロモーター (SbRFP、PbRFP、TNT-RFP) を持つ各デバイスは、試験中のサンプルと共にインキュベートされ、RFP の蛍光が測定されます。RFP は、適切な化学物質が存在し、プロモーター領域を活性化する場合にのみ表現されます。GSR に存在する化学物質のいくつかに応答する3つのデバイスが設計されており、この作業で紹介しています。
3つの MicRoboCop デバイスで使用されるプロモーターは、ヒ素およびアンチモン感受性プロモーター、 SbRFP9、10、鉛感受性プロモーター、 PbRFP11、12および TNT 高感度プロモーター、TNT-RFP文献の検索は、バリウムに応答するように設計されたプロモーターを明らかにしなかったので、このプロモーターは、多くの構造的に関連する化合物 (特に、2, 4-dinitrotoluene およびdinitrobenzene) は、GSR に取り残された有機化合物の一部であることが知られている。このプロモーターは、埋設された地雷13における微小な量の TNT および 2, 4-dinitrotoluene (2, 4 DNT) を特異的に検出するために首尾よく用いられる。3つの装置をシステムとして一緒に使用すると、GSR のポジティブ・テストにより、3つのデバイスすべてに蛍光が生成されます。1つまたは2つの装置のみでの蛍光シグナルは、検体の別の環境源 (複数可)、または TNT プロモーターの場合、GSR において有機化合物が残されていない化合物による活性化を示す。すべての3つのデバイスを一緒に使用することにより、環境情報源による偽陽性の結果の可能性が最小限に抑えられます。人気が高まっている無鉛弾薬は、米国での弾薬販売量の約 5% しか占めていない。したがって、鉛が存在しないことによる偽陰性の結果は可能性があるが、GSR14のマーカーとしてリードを使用するセンサーには依然として有用性があります。この特定のフォレンジックアプリケーションに加えて、各デバイスは、環境汚染物質を検出する目的のために別々に使用することができます。
提示されたプロトコールには、デバイス (センサ細菌) を作成するために用いられる合成生物学技術と、デバイスの機能をチェックし得た蛍光シグナルを分析する分析技術が含まれる。プロトコルはまた、表面から GSR を収集するために、容疑者やスワブの手から GSR を収集するための手の拭き取りの形で法医学証拠の収集が含まれています。リードセンサー装置からの結果は、サンプル結果として、使用済みカートリッジケーシングを用いた GSR に対するポジティブテストのデモンストレーションとともに提示されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3-dinitrobenzene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D194255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-dinitrotoluene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>101397-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA450-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duplex Buffer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-03-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, HPLC grade, denatured</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC611050040</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GTAAAACGACGGCCAGTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SL21-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes</td>
			<td>Hygenall</td>
			<td>45NRCN</td>
			<td>Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology</td>
			<td>Registry of Standard Biological Parts</td>
			<td></td>
			<td>http://parts.igem.org/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promoter Sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Sb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCAGTCAT 
			ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG 
			AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT 
			GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC 
			GTTGTTAGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			Pb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCGTCTTG 
			ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA 
			ACGCGAGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG 
			ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			TNT promoter: 5&#8217;GCATTCTAGATCAATT 
			TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT 
			TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA 
			CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT 
			CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3&#8217; 3&#8217;CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG 
			CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT 
			TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT 
			GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA 
			ATTAACTTAAGCGTA5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GGAAACAGCTATGACCATG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue

MicRoboCop は法医学化学の独特な適用のために設計されていたバイオセンサーである。MicRoboCop は3つの装置で構成されるシステムで、一緒に使用すると、3つの主要な検体 (アンチモン、鉛、および GSR の有機成分) の存在下で蛍光シグナルを生成することによって、発射残渣 (GSR) の存在を示すことができます。本プロトコルは、大腸菌 (e.coli) を用いたバイオセンサーの合成と、センサの選択性と感度を評価するために用いられる分析化学法について述べる。システムの機能は、使用済みカートリッジケーシングの内部から GSR を収集することによって実証されます。一度準備すれば、バイオセンサーは必要になるまで貯えることができ、これらの主要な分析物のためのテストとして使用することができる。3つの検体すべてからの肯定的な反応は、GSR に対する推定陽性試験を提供し、個々のデバイスは、他のサンプル中の検体を検出するためのアプリケーション (例えば、飲料水中の鉛汚染の検出器) を有する。システムの主な制限は、正の信号に必要な時間です。今後の研究は、応答時間を最適化するために異なる生物を研究することを含むかもしれない。

この作業で使用した RFP バリアントの蛍光スペクトルを図 2に示します。これらのデータは、リードと TNT-RFP デバイスに応答する PbRFP デバイスからのもので、2つの分析対象、2、4の DNT および 1, 3-DNB に応答します。この図は、ネガティブコントロールのスペクトル (検体が追加されていない) を示し、2つの異なるレベルの検体が添加されたスペクトルを示?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

合成生物学技術を用いて、銃創の分析のために一連の細菌用バイオセンサーを合成し、蛍光分光法を用いてその使用目的に対してデバイスの機能をテストするプロトコルを提示します。

発砲残渣の推定検出のための新しい細菌性バイオセンサの調製と適用

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

このプロトコルは、銃声残渣の化学成分を検出するように設計されたユニークなバイオセンサーの調製および分析を記述する。法医学アプリケーションのためのバイオセンサーの使用はユニークです。これは、法医学研究所で一般的に使用される高度に特殊化された機器に代わる、低コストでシンプルに使用できます。記載の合成生物学法は、標準的な合成生物学の部品を使用する任意のシステムに使用することができます。記載の化学分析は、赤色蛍光タンパク質を発現するあらゆるバイオセンサに適用可能である。この手順のデモンストレーションは、ロングウッド大学の学部生であるアンドレア・ソールズとエル・リチャードソンです。この手順を開始するには、マイクロ遠心チューブに、以前に単離されたJ10060プラスミドDNAの10マイクロリットルを加えます。8マイクロリットルの水を加え、EcoRI酵素とNHEL酵素のそれぞれに1マイクロリットルを1マイクロリットルのバッファーと事前に混合します。プロモーターDNAの場合、新鮮なマイクロ遠心分離チューブに10マイクロリットルのアニールプロモーターDNA配列を加えます。8マイクロリットルの水を加え、EcoRI酵素とNHEL酵素のそれぞれに1マイクロリットルを1マイクロリットルのバッファーと事前に混合します。10マイクロリットルに設定されたピペットを使用して、サンプルを上下にそっとピペットして混ぜます。37°Cで30分間インキュベートします。その後、酵素を80°Cで5分間加熱して活性させます。消化したDNAを冷凍庫に保管して、処理を進める準備が整います。まず、以前に消化されたプラスミドおよびプロモーターDNAを使用して、テキストプロトコルの表1に概説されているように、氷上のミクロセトリフュージチューブに反応を設定する。最後にT4 DNAリガーゼを追加することを確認してください。ピペットを上下に軽く混ぜ合わせ、遠心分離機を短く混ぜます。室温で10分間インキュベートします。その後、熱し、10分間摂氏65度で活性化します。テキスト プロトコルで説明されているように変換を実行します。まず、テキストプロトコルの表2に示すように、PCRの反応混合物を設定します。ピペットを上下に軽くして反応を混ぜます。黄色のピペットチップを使用して、変換された大腸菌のコロニーを削ります。この大腸菌のスワイプを、切り離された新しいLBアンピシリン寒天プレートに移し、ピペットチップをPCRチューブに挿入します。ピペットチップを振って、大腸菌とPCRミックスを混ぜます。追加のコロニーに対して、このプロセスをさらに3回繰り返します。次に、PCR チューブを PCR マシンにロードし、テキスト プロトコルの表 3 に示すようにサーモサイクリングを開始します。テキストプロトコルの表4に概説されているように、適切な数の無菌培養チューブにラベルを付け始める。各チューブに調製した培養液の2ミリリットルを加えます。表 4 に示すように、チューブにアニライト ストック ソリューションを追加します。次に、スナップキャップを培養管に置き、チューブに空気が流れるように緩みます。各培養管の渦。この後、チューブを摂氏37度、220 RPM以上で24時間揺れるインキュベーターに入れます。まず、指の間を含む手のすべての表面を拭くためにリードを取り除くために設計されたエタノールベースのワイプを使用してください。分析まで適切にラベル付けされた密封可能なバギーにワイプを保管してください。アルコールベースのワイプを使用して、テストする大きな表面を拭き取ります。エタノールで湿らせた綿のスワップを使用して、テストする小さな表面を拭き取ります。清潔な手袋を着用し、アルコール洗浄したはさみを使用して、ワイプの中心から約1平方センチメートルの部分を切ります。次に、切り取った部分のワイプ、または綿棒を、2ミリリットルのセンサー細菌を含む培養管に直接入れ、完全に水没していることを確認します。500ナノメートルの励起波長で、RFPバリアントの適切な波長で蛍光の提出を収集するために分光計を準備します。次に、ボルテックスミキサーを使用してチューブを振ります。各上清を少量キュベットに慎重に移し、発光強度を収集します。ボルテックスミキサーを使用して、チューブを振ります。200マイクロリットルのブロスをウェルプレートのウェルに移します。このプレートの各ウェルに入ったサンプルを記録します。RFPバリアントに適した波長で発光強度を収集するために、小麦粉計を設定します。代表的なRFP変異体の蛍光スペクトルは、2つの異なるレベルのアニライトを加えた陰性対照とスペクトルの両方を示す。この研究で使用されるRFP変異体の最大蛍光シグナルは、575ナノメートルで観測される。代表的なデータは、ポータブル分光計と蛍光計の両方から、同じソリューションのセットのために収集されます。アニライトの濃度が高くなるにつれて蛍光が増加する一般的な傾向がある。鉛センサーの10億分の800を超える高濃度では、このような高濃度での鉛の毒性のために応答が低下することは注目に値する。使用済みの40口径カートリッジケースの内部からエタノール綿棒サンプルを分析すると、原理的な結果を証明します。3つのセンサー細菌のそれぞれから陽性の結果は、銃声残渣に対する陽性試験を示す。このプロトコルで調製されたバイオセンサーは、食品、水、または環境サンプルの汚染を検出するために個別に使用することもできます。この技術は、研究者が様々な異なる化学アニライトのための標準的な合成生物学技術を使用してバイオセンサーを開発する道を開きます。個人的な保護具を着用する必要があり、アナリストは大腸菌を扱った後、手を洗い、表面を消毒する必要があります。廃棄物はオートクレーブ化し、重金属を含む廃棄物はこれに応じて処理する必要があります。

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

二ヨウ化サマリウム（SMIの調製および使用<sub&gt; 2</sub&gt;）有機合成における：サマリウムバルビエ反応におけるHMPAとNi（II）塩の力学的役割

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

生成Cyanocarbenesの適用のための超原子価ヨードニウムアルキニルトリフラートの合成

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

DNA折り紙解析と実験のためのマイカとシリコン基板の作製

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

の合成のためのプロトコル<em&gt;オルソ</em&gt; -trifluoromethoxylatedアニリン誘導体

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em&gt;経由で</em&gt;システイン - マレイミドケミストリー

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Photoredox触媒を用いた可視光媒介分散重合によるワームのようなミセルの簡便な合成

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

の調製と評価<sup&gt; 99メートル</sup&gt; Tc標識三座キレートバイオ直交化学反応を用いて事前ターゲティングするため

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...