Name: preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne studentene ved Longwood University i BIOL 324 (genetikk) og studentene i CHEM 403 (Advanced kjemisk Laboratory problem løsning) som var involvert i den første forberedelse og testing av antimon og bly biosensors. Ideen til MicRoboCop ble unnfanget ved GCAT SynBIO workshop (sommer 2014), som er finansiert av NSF og Howard Hughes Medical Institute og drives av University of Maryland Baltimore County. Forfatterne erkjenner også finansiering mottatt fra Longwood University ' s Cook-Cole College of Arts and Sciences og GCAT SynBio Alumni Grant.

Merk: syntese av E. coli uttrykke RFP presenteres.
1. utarbeidelse av plasmider DNA fra E. coli
<ol><li>Tin e. coli som inneholder en plasmider med et RFP-gen og Ampicillin motstands gen og Øk e. coli på Luria buljong (LB) agar plater som inneholder 100 μg/ml Ampicillin ved 37 ° c i 24 timer. Bruk for eksempel J10060-plasmider fra registeret av standard biologiske deler som brukes til syntetisk biologi (se tabell over materialer). J100...

<ol>
	<li>Eschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;The+Story+of+the+Real+Canary+in+the+Coal+Mine.&#34;.">&#34;The Story of the Real Canary in the Coal Mine.&#34;.</a> The Smithsonian Magazine. , (2016).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors &#38; Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+genetically+engineered+microbial+whole-cell+biosensors+for+combined+chemosensing.">Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).</li><li>Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gunshot+Residue+and+Associated+Materials-A+Review.">Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).</li><li>Bell, S., Seitzinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+binary+presumptive+assays+to+probabilistic+assessments:+Differentiation+of+shooters+from+non-shooters+using+IMS,+OGSR,+neural+networks,+and+likelihood+ratios.">From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios.</a> Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).</li><li>O&#39;Mahony, A. M., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Detection+of+Gunshot+Residue+for+Forensic+Analysis:+A+Review.">Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review.</a> Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).</li><li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Biosensor+Technology+for+Potential+Applications+-+An+Overview.">Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).</li><li>Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralogous+Regulators+ArsR1+and+ArsR2+of+Pseudomonas+putida+KT2440+as+a+Basis+for+Arsenic+Biosensor+Development.">Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).</li><li>Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Biological+Organisms+as+Chemical+Sensors:+The+MicRoboCop+Project.">Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project.</a> Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).</li><li>Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+the+pbr+lead+resistance+determinant+of+Ralstonia+metallidurans+CH34.">Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34.</a> Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).</li><li>Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+coordination+of+Pb(II)+is+involved+in+the+PbrR-dependent+activation+of+the+lead-resistance+promoter,+PpbrA,+from+Cupriavidus+metallidurans+CH34.">Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34.</a> Bmc Microbiology. 12, (2012).</li><li>Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene+by+an+Escherichia+coli+bioreporter:+performance+enhancement+by+directed+evolution.">Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).</li><li>Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Guns+in+America:+The+Debate+Over+Lead+Based+Bullets.&#34;.">&#34;Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.&#34;.</a> Newsweek. , (2017).</li><li>Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAAS+Determination+of+Antimony,+Barium,+and+Lead+Levels+in+Gunshot+Residue+Swabs:+An+Application+in+Forensic+Chemistry.">GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry.</a> Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).</li><li>Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+and+Behavior+of+Gunshot+Residue-A+Review.">Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).</li><li>Yagur-Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+bioreporters+for+the+detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene.">Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).</li></ol>

Modifikasjoner og feilsøking
Eksperimentet beskrevet i Tabell 4 kan endres på en hvilken som helst måte som passer til sensorene som er utformet. Det viktigste aspektet ved en kjemisk sensor er å evaluere sin følsomhet og spesifisitet. Det er fordelaktig å sikre at et bredt spekter av konsentrasjoner av analytt analyseres for å fastslå den nyttige analytiske rekkevidden til sensoren. Det er også verdt å bestemme et maksimalt nivå av analytt for cell...

En Biosensor er enhver analytisk enhet som bruker biologiske komponenter (som proteiner, nukleinsyre syrer, eller hele organismer) som produserer et svar som kan brukes for påvisning av en kjemisk substans eller analytt. Som et eksempel, kullgruveindustrien brukt en Biosensor for mye av de 20th århundre for å oppdage tilstedeværelsen av giftige gruve gasser: kanarifuglen i kull gruven1. Den biologiske organisme (Canary ' s) respons (død eller nød) til en kjemisk analytt (karbonmonoksid) ble observert av gruvearbeiderne for å beskytte arbeiderne. I et mer moderne og sofistikert eksempel, kan bakterier endres ved hjelp av syntetiske biologi teknikker for å svare på tilstedeværelsen av en viss kjemisk analytt ved å stille et bestemt svar, for eksempeluttrykk for et fluorescerende protein.
Syntetisk biologi er et bredt begrep som refererer til bygging av biologiske enheter og systemer som ikke eksisterer naturlig, eller re-design av eksisterende biologiske systemer for et bestemt formål2. Syntetisk biologi skilles fra genetisk engineering av en standard metodikk og eksistensen av standardiserte deler (standard syntetisk biologi genetiske elementer) som kan brukes til å syntetisere enheter og systemer. En del er innført i Genova av en enhet, en organisme som en bakterie, for å uttrykke en viss egenskap som vil tjene som en indikasjon på funksjon. For eksempel, i mange syntetiske enheter, er uttrykket av et fluorescerende protein innført i en enkelt encellede organisme som reporter protein. Flere enheter kan kombineres til et system. Genomer av mikroorganismer som bakterier er lett å manipulere på denne måten. Mange eksempler på biosensors som er spesifikke for et bredt spekter av kjemiske analytter har blitt rapportert i litteraturen i løpet av det siste tiåret3,4.
I dette arbeidet, MicRoboCop systemet er presentert som et eksempel på en Biosensor utformet ved hjelp av syntetiske biologi teknikker med romanen programmer i rettsmedisinske og miljøkjemi. MicRoboCop er et system av tre separate enheter som, kombinert, vil tillate Escherichia coli å uttrykke rødt fluorescerende PROTEIN (RFP) i nærvær av skudd rester (GSR) som er samlet inn fra en persons hender eller en overflate. Hver av de tre enhetene reagerer på en bestemt kjemisk analytt som er kjent for å være en komponent i GSR5. De tre analytter som systemet svarer er jeg. 2, 4, 6-trinitrotoluene (TNT) og relaterte forbindelser, II. bly (i form av bly ioner), og III. antimon (også i form av ioner).
GSR består av mange forskjellige kjemiske stoffer, men de tre som vanligvis brukes til å identifisere en rest som GSR er barium, bly, og antimon5. Standard bevismessige test for identifisering av GSR er å bruke skanning elektron mikroskopi (SEM) med energi dispersive X-ray fluorescens (EDX)5. SEM-EDX lar analytikere å identifisere den unike morfologi og elementær komponenter av GSR. For tiden er det få mye brukt binære presumptive tester tilgjengelig. En nylig publisert presumptive test bruker ion-Mobility spektroskopi (IMS), som er spesialisert utstyr som kanskje ikke er tilgjengelig i mange laboratorier6. Det er også noen farge "spot" tester som kan brukes, selv om de vanligvis brukes for avstand besluttsomhet eller for GSR identifikasjon på bullet hull og sår5. I tillegg har det vært en viss begrenset oppmerksomhet i litteraturen til elektrokjemiske tester for GSR som benytter voltammetric analyse, som har fordelen av potensielt være feltet bærbare, eller anodisk stripping voltammetri, som er en ekstremt følsom metode for metalliske elementer7. Det er svært lite omtale i litteraturen i biosensors designet spesielt for det formål å oppdage GSR, men noen biosensors for andre rettsmedisinske søknader har blitt publisert8.
De biologiske elementene for hver enhet i MicRoboCop-systemet, og plasmider konstruksjonen, er illustrert i figur 1. Den buede pilen i figur 1B representerer arrangøren regionen som er aktivert i nærvær av analytt, er den ovale ribosomal bindende nettsted som tillater oversettelse av reporteren protein, den grå boksen er merket RFP er genet som uttrykker rød fluorescerende protein, og den røde Octagon er transkripsjon oppsigelse området. Alle tre enhetene vil bli brukt sammen som et system for å oppdage GSR. Hver enhet med en bestemt promoter (SbRFP, PbRFP og TNT-RFP) vil bli inkubert med prøven som blir testet og fluorescens av RFP vil bli målt. RFP vil bare bli uttrykt hvis den aktuelle kjemiske analytt er til stede og aktiverer promoter regionen. Tre enheter som responderer på noen av de kjemiske stoffene som finnes i GSR, er utformet og presenteres i dette arbeidet.
Den arrangører som brukes i de tre MicRoboCop enhetene er en arsen og antimon følsom promoter, SbRFP, en bly følsom promoter, PbRFP11,12 og en TNT følsom promoter, TNT-RFP 13. fordi et søk i litteraturen avslørte ingen promoter utformet for å svare på barium, ble TNT arrangøren valgt i stedet siden denne arrangøren er følsom for en rekke strukturelt relaterte forbindelser (særlig 2, 4-dinitrotoluene og dinitrobenzene) som er kjent for å være en del av de organiske forbindelsene etterlatt i GSR. Denne arrangøren har med hell blitt brukt til å spesifikt oppdage minutt mengder TNT og 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) i begravd land gruver13. Ved å bruke de tre enhetene sammen som et system, vil en positiv test for GSR produsere fluorescens i alle tre enhetene. En fluorescens signal i bare én eller to enheter vil indikere en annen miljømessig kilde til analytt (e) eller i tilfelle av TNT arrangøren, aktivering av en forbindelse som ikke er en organisk sammensatt etterlatt i GSR. Ved å bruke alle tre enhetene sammen, er muligheten for et falskt positivt resultat på grunn av miljømessige kilder minimert. Blyfri ammunisjon, som er stadig i popularitet, representerer fortsatt bare ca 5% av ammunisjon salg i USA; Derfor, falske negative resultater på grunn av fravær av bly kan være en mulighet, men det er fortsatt verktøyet i en sensor som bruker bly som en markør for GSR14. I tillegg til dette spesifikke rettsmedisinske programmet, kan hver enhet brukes separat for å oppdage miljøgifter.
Protokollene som presenteres inkluderer syntetiske biologi teknikker som brukes til å lage enheter (sensor bakterier) og analytiske teknikker for å sjekke funksjonen til enhetene og analysere fluorescens signalene innhentet. Protokollen inkluderer også innsamling av rettsmedisinske bevis i form av hånden tørke for å samle GSR fra hendene på en mistenkt eller skure å samle GSR fra en overflate. Resultater fra bly sensor enheten presenteres som eksempel resultater, sammen med en demonstrasjon av en positiv test for GSR ved hjelp av en brukt patron casing.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3-dinitrobenzene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D194255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-dinitrotoluene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>101397-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA450-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duplex Buffer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-03-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, HPLC grade, denatured</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC611050040</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GTAAAACGACGGCCAGTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SL21-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes</td>
			<td>Hygenall</td>
			<td>45NRCN</td>
			<td>Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology</td>
			<td>Registry of Standard Biological Parts</td>
			<td></td>
			<td>http://parts.igem.org/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promoter Sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Sb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCAGTCAT 
			ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG 
			AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT 
			GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC 
			GTTGTTAGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			Pb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCGTCTTG 
			ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA 
			ACGCGAGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG 
			ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			TNT promoter: 5&#8217;GCATTCTAGATCAATT 
			TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT 
			TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA 
			CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT 
			CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3&#8217; 3&#8217;CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG 
			CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT 
			TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT 
			GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA 
			ATTAACTTAAGCGTA5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GGAAACAGCTATGACCATG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue

MicRoboCop er en Biosensor som er designet for en unik anvendelse innen rettsmedisinske kjemi. MicRoboCop er et system bestående av tre enheter som, når de brukes sammen, kan indikere tilstedeværelsen av skudd rester (GSR) ved å produsere et fluorescens signal i nærvær av tre viktige analytter (antimon, bly, og organiske komponenter av GSR). Protokollen beskriver syntesen av biosensors ved hjelp av Escherichia coli (E. coli), og de analytiske kjemi metodene som brukes til å evaluere selektivitet og følsomheten til sensorene. Funksjonen til systemet er demonstrert ved hjelp av GSR innhentet fra innsiden av en brukt patron casing. En gang forberedt, det biosensors kan lagret til behøvde og kan brukes som test for disse nøkkel analytter. En positiv respons fra alle tre analytter gir en Presumptive positiv test for GSR, mens hver enkelt enhet har søknader om påvisning av analytter i andre prøver (f.eks. en detektor for bly forurensning i drikkevann). Den viktigste begrensningen av systemet er tiden det tar for et positivt signal; fremtidig arbeid kan innebære å studere forskjellige organismer for å optimalisere responstiden.

Fluorescens Spectra for RFP-varianten som brukes i dette arbeidet, er vist i figur 2. Disse dataene er fra PbRFP enheten som den reagerer på bly og TNT-RFP enheten som den reagerer på to analytter, 2, 4-DNT og 1, 3-DNB. Denne illustrasjonen viser spekteret av en negativ kontroll (ingen analytt lagt til), og Spectra på to ulike nivåer av analytt lagt. Det maksimale fluorescens signalet for RFP-varianten som ble brukt ble observert ved 575 NM (eksitasjon bølgelengde 50...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

En protokoll presenteres ved hjelp av syntetiske biologi teknikker for å syntetisere et sett av bakteriell biosensors for analyse av skudd rester, og for å teste funksjon av enhetene for tiltenkt bruk ved hjelp av fluorescens spektroskopi.

Utarbeidelse og anvendelse av en ny bakteriell Biosensor for presumptive deteksjon av skudd rester

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Denne protokollen beskriver utarbeidelse og analyse av en unik biosensor som er designet for å oppdage de kjemiske komponentene i skuddrester. Bruken av biosensorer for rettsmedisinske applikasjoner er unik. Det representerer en rimelig, enkel å bruke alternativ til den høyt spesialiserte instrumentering vanligvis brukes i rettsmedisinske laboratorier.De syntetiske biologimetodene som er beskrevet, kan brukes til alle system som bruker standard syntetiske biologideler. Den kjemiske analysen som er beskrevet gjelder for enhver biosensor som uttrykker rødt fluorescerende protein. Demonstrere prosedyren vil være Andrea Soles og Elle Richardson, lavere studenter ved Longwood University.For å starte denne prosedyren, legg til ti mikroliter av det tidligere isolerte J10060 plasmid-DNA til et mikrocentrifugerør. Tilsett åtte mikroliter vann, og ett mikroliter av hvert av EcoRI- og NHEL-enzymene som er forhåndsblandet med ett mikroliter buffer. For promotor-DNA, legg til ti mikroliter av glødede promotor DNA-sekvenser til et nytt mikrocentrifugerør.Tilsett åtte mikroliter vann, og ett mikroliter av hvert av EcoRI- og NHEL-enzymene som er forhåndsblandet med ett mikroliter buffer. Bruk en pipette satt til ti mikroliter, rør forsiktig prøvene opp og ned for å blande. Inkuber prøvene ved 37 grader Celsius i 30 minutter.Deretter varme og aktiv enzymene ved 80 grader Celsius i fem minutter. Oppbevar det fordøyde DNA-et i en fryser til det er klart til å fortsette. Bruk først plasmid- og promotor-DNA-et som tidligere ble fordøyd for å sette opp reaksjonen i et mikrocetrigerør på is, som beskrevet i tabell en av tekstprotokollen.Pass på å legge til T4 DNA Ligase sist. Pipetten opp og ned forsiktig for å blande reaksjonen, og sentrifuge kort. Inkuber ved romtemperatur i ti minutter.Deretter varme og aktivere på 65 grader Celsius i ti minutter. Utfør transformasjonen som beskrevet i tekstprotokollen. Først setter du opp reaksjonsblandingene for PCR som beskrevet i tabell to av tekstprotokollen.Pipette forsiktig opp og ned for å blande reaksjonene. Bruk en gul pipettespiss til å skrape en koloni av den forvandlede E.coli. Overfør et sveip av denne E.coli til en ny LB-ampicillin agar plate som er delt av, og sett deretter pipettespissen inn i PCR-røret.Rist pipettespissen for å blande E.Coli med PCR-blandingen. Gjenta denne prosessen tre ganger til for flere kolonier. Deretter laster du PCR-rørene inn i en PCR-maskin, og begynner termocycling som beskrevet i tabell tre av tekstprotokollen.For å begynne å merke riktig antall sterile kulturrør som beskrevet i tabell fire av tekstprotokollen. Tilsett to milliliter av den tilberedte kulturbuljongen til hvert rør. Tilsett anilittlagerløsningen i rørene som beskrevet i tabell fire.Deretter plasserer du snap caps på kulturrørene slik at de er løse for å tillate luftstrøm inn i røret. Vortex hver kultur tube. Etter dette plasserer du rørene i en ristende inkubator ved 37 grader Celsius og ved 220 rpm i minst 24 timer.Bruk først en etanolbasert klut designet for å fjerne bly for å tørke av alle overflater i hendene, inkludert mellom fingrene. Oppbevar serviettene i en passende merket pose med forseglet pose til analyse. Bruk en alkoholbasert klut til å tørke ned store overflater som skal testes.Bruk en bomullsbytte fuktet med etanol for å tørke ned eventuelle små overflater som skal testes. Bruk rene hansker og bruk saks som har blitt rengjort med alkohol, kutt en seksjon som er omtrent en kvadratcentimeter ut av midten av tørken. Deretter plasserer du det kuttede tørkestykket, eller bomullspinnen, direkte inn i et kulturrør som inneholder to milliliter av sensorbakteriene, og sikrer at den er helt nedsenket i buljongen.Forbered spektrometeret for å samle fluorescerende innsending ved riktig bølgelengde for RFP-varianten, med en eksitasjonsbølgelengde på 500 nanometer. Deretter bruker du en vortex mikser for å riste rørene. Overfør hver supernatant til et lavt volum cuvette, og samle utslippsintensiteten.Bruk en vortex mikser til å riste rørene. Overfør 200 mikroliter av buljongen til en brønn i brønnplaten. Ta opp hvilke prøver som gikk inn i hver brønn av denne platen.Sett opp melometeret for å samle utslippsintensiteten ved riktig bølgelengde for RFP-varianten. Fluorescensspektra for en representativ RFP-variant viser både den negative kontrollen og spektra på to forskjellige nivåer av anilitt lagt til. Det maksimale fluorescerende signalet for RFP-varianten som brukes i dette arbeidet, observeres ved 575 nanometer.Representative data samles inn for samme sett med løsninger, fra både det bærbare spektrometeret og fluorometeret. Det er en generell trend av fluorescensen øker etter hvert som konsentrasjonen av anilit øker. Det er verdt å legge til at ved høye konsentrasjoner, større enn ca 800 deler per milliard for blysensoren, faller responsen av på grunn av toksisiteten av bly ved en så høy konsentrasjon.Analyse av etanol vattpinne prøver fra innsiden av en brukt 40 kaliber patron casing gir bevis på prinsippet resultater. De positive resultatene fra hver av de tre sensorbakteriene indikerer en positiv test for skuddrester. Biosensorene som er utarbeidet i denne protokollen, kan også brukes individuelt til å oppdage forurensning i mat, vann eller miljøprøver.Denne teknikken baner vei for forskere å utvikle biosensorer ved hjelp av standard syntetiske biologi teknikker for en rekke ulike kjemiske anilitter. Personlig verneutstyr bør brukes, og analytikere bør vaske hender og desinfisere overflater etter håndtering av E.coli. Avfall skal autoklaveres, og avfall som inneholder tungmetall bør behandles tilsvarende.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

Forberedelse og bruk av Samarium Diiodide (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) I Organic Synthesis: det mekanistiske rolle HMPA og Ni (II) salter i Samarium Barbier Reaksjon

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Syntese av Hypervalent jod Alkynyl Triflates for anvendelse av Generering Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Isolering og fremstilling av bakterielle cellevegger for komposisjonsanalyse ved ultraytelses væskekromatografi

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Utarbeidelse av Mica og Silicon Underlag for DNA Origami analyse og eksperimentering

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protokoll for syntese av<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated anilinderivater

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese av Protein Bioconjugates<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimide kjemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Synthesis of Worm-lignende Miceller av synlig lys mediert dispersjonspolymeriseringen Bruke Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Utarbeidelse og evaluering av<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-merket tredentat Chelates for Pre-måls Bruke Bioorthogonal kjemi

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...