Name: preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Os autores desejam reconhecer os alunos da Universidade de Longwood em BIOL 324 (genética) e os alunos em CHEM 403 (Advanced Chemical laboratório resolução de problemas) que estiveram envolvidos na preparação inicial e testes dos biosensores de antimônio e chumbo. A idéia para MicRoboCop foi concebida no workshop GCAT SynBIO (verão 2014), que é financiado pela NSF e Howard Hughes Medical Institute e hospedado pela Universidade de Maryland Baltimore County. Os autores também reconhecem o financiamento recebido da escola de artes e Ciências Cook-Cole, da Universidade Longwood, e do GCAT SynBio Alumni Grant.

Nota: a síntese de E. coli expressando RFP é apresentada.
1. preparação do DNA plasmídeo de E. coli
<ol><li>Thaw e. coli contendo um plasmídeo com um gene RFP e Gene de resistência ampicilina e crescer o e. coli em placas de agar de caldo de Luria (lb) contendo 100 μg/mL ampicilina a 37 ° c por 24 h. Por exemplo, use o plasmídeo J10060 do registro de peças biológicas padrão usadas para a biologia sintética (ver tabela de materiais</st...

<ol>
	<li>Eschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;The+Story+of+the+Real+Canary+in+the+Coal+Mine.&#34;.">&#34;The Story of the Real Canary in the Coal Mine.&#34;.</a> The Smithsonian Magazine. , (2016).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors &#38; Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+genetically+engineered+microbial+whole-cell+biosensors+for+combined+chemosensing.">Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).</li><li>Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gunshot+Residue+and+Associated+Materials-A+Review.">Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).</li><li>Bell, S., Seitzinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+binary+presumptive+assays+to+probabilistic+assessments:+Differentiation+of+shooters+from+non-shooters+using+IMS,+OGSR,+neural+networks,+and+likelihood+ratios.">From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios.</a> Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).</li><li>O&#39;Mahony, A. M., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Detection+of+Gunshot+Residue+for+Forensic+Analysis:+A+Review.">Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review.</a> Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).</li><li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Biosensor+Technology+for+Potential+Applications+-+An+Overview.">Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).</li><li>Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralogous+Regulators+ArsR1+and+ArsR2+of+Pseudomonas+putida+KT2440+as+a+Basis+for+Arsenic+Biosensor+Development.">Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).</li><li>Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Biological+Organisms+as+Chemical+Sensors:+The+MicRoboCop+Project.">Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project.</a> Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).</li><li>Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+the+pbr+lead+resistance+determinant+of+Ralstonia+metallidurans+CH34.">Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34.</a> Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).</li><li>Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+coordination+of+Pb(II)+is+involved+in+the+PbrR-dependent+activation+of+the+lead-resistance+promoter,+PpbrA,+from+Cupriavidus+metallidurans+CH34.">Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34.</a> Bmc Microbiology. 12, (2012).</li><li>Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene+by+an+Escherichia+coli+bioreporter:+performance+enhancement+by+directed+evolution.">Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).</li><li>Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Guns+in+America:+The+Debate+Over+Lead+Based+Bullets.&#34;.">&#34;Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.&#34;.</a> Newsweek. , (2017).</li><li>Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAAS+Determination+of+Antimony,+Barium,+and+Lead+Levels+in+Gunshot+Residue+Swabs:+An+Application+in+Forensic+Chemistry.">GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry.</a> Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).</li><li>Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+and+Behavior+of+Gunshot+Residue-A+Review.">Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).</li><li>Yagur-Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+bioreporters+for+the+detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene.">Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).</li></ol>

Modificações e resolução de problemas
O experimento descrito na tabela 4 pode ser modificado de qualquer forma adequada aos sensores que foram projetados. O aspecto mais importante de um sensor químico é avaliar sua sensibilidade e especificidade. É benéfico assegurar-se de que uma escala larga das concentrações do analito esteja analisada para determinar a escala analítica útil do sensor. Também vale a pena determinar um nível máximo de analito...

Um biosensor é qualquer dispositivo analítico que utiliza componentes biológicos (tais como proteínas, ácidos nucleicos ou organismos inteiros) que produzem uma resposta que pode ser usada para a detecção de uma substância química ou analito. Como exemplo, a indústria de mineração de carvão usou um biosensor para grande parte do século 20 para detectar a presença de gases tóxicos da mina: o canário na mina de carvão1. A resposta do organismo biológico (canário) (morte ou angústia) a um analito químico (monóxido de carbono) foi observada pelos mineiros, a fim de proteger os trabalhadores. Em um exemplo mais moderno e sofisticado, as bactérias podem ser alteradas usando técnicas de biologia sintética para responder à presença de um determinado analisador químico, exibindo uma resposta específica, como a expressão de uma proteína fluorescente.
A biologia sintética é um termo amplo que se refere à construção de dispositivos e sistemas biológicos que não existem naturalmente, ou o redesenho de sistemas biológicos existentes para uma finalidade específica2. A biologia sintética distingue-se da engenharia genética por uma metodologia padrão e pela existência de peças padronizadas (elementos genéticos de biologia sintética padrão) que podem ser usadas para sintetizar dispositivos e sistemas. Uma parte é introduzida no genoma de um dispositivo, um organismo como uma bactéria, para expressar uma certa característica que servirá como uma indicação de função. Por exemplo, em muitos dispositivos sintéticos, a expressão de uma proteína fluorescente é introduzida em um único organismo unicelulares como uma proteína do repórter. Vários dispositivos podem ser combinados em um sistema. Os genomas dos micro-organismos tais como as bactérias são fáceis de manipular desta maneira. Vários exemplos de biosensores específicos para uma ampla gama de analisadores químicos têm sido relatados na literatura na última década3,4.
Neste trabalho, o sistema MicRoboCop é apresentado como um exemplo de um biosensor projetado usando técnicas de biologia sintética com novas aplicações em química forense e ambiental. MicRoboCop é um sistema de três dispositivos separados que, quando combinados, permitirão que Escherichia coli expresse a proteína vermelha fluorescente (RFP) na presença de resíduo de bala (GSR) que foi coletado das mãos de uma pessoa ou de uma superfície. Cada um dos três dispositivos responde a um analito químico específico que seja sabido para ser um componente de GSR5. Os três analitos aos quais o sistema responde são I. 2, 4, 6-trinitrotolueno (TNT) e compostos relacionados, II. chumbo (sob a forma de íons de chumbo), e III. antimônio (também a forma de íons).
GSR consiste em muitas substâncias químicas diferentes, mas os três usados geralmente para identificar um resíduo como GSR são bário, ligação, e antimônio5. O teste probatório padrão para a identificação de GSR é usar a microscopia de elétron de exploração (sem) com fluorescência dispersiva da energia do raio X (EDX)5. O SEM-EDX permite que os analistas identifiquem a morfologia única e os componentes elementares da GSR. Atualmente, existem poucos testes presumptivos binários amplamente utilizados disponíveis. Um teste presuntivo recentemente publicado utiliza espectroscopia de mobilidade iônica (IMS), que é um equipamento especializado que pode não estar disponível em muitos laboratórios6. Há também alguns testes de cor "Spot" que podem ser usados, embora eles normalmente são usados para determinação de distância ou para identificação de GSR em buracos de bala e feridas5. Adicionalmente, tem havido alguma atenção limitada na literatura para testes eletroquímicos para GSR que empregam a análise voltamétrica, que tem a vantagem de ser potencialmente portátil de campo, ou voltametria de decapagem anódica, que é extremamente método sensível para elementos metálicos7. Há muito pouca menção na literatura de biossensores projetados especificamente para a finalidade de detectar GSR, embora alguns biossensores para outras aplicações forenses foram publicados8.
Os elementos biológicos para cada dispositivo no sistema MicRoboCop e a construção do plasmídeo são ilustrados na Figura 1. A seta curvada na Figura 1b representa a região promotora que é ativada na presença do analyte, o oval é o local de ligação ribossomal que permite a tradução da proteína do repórter, a caixa cinzenta rotulada RFP é o gene que expressa vermelho proteína fluorescente, e o octagon vermelho é o local da terminação da transcrição. Todos os três dispositivos serão usados juntos como um sistema para detectar GSR. Cada dispositivo com um promotor específico (SbRFP, PbRFP e TNT-RFP) será incubado com a amostra que está sendo testada e a fluorescência da RFP será medida. RFP só será expressado se o analisador químico apropriado está presente e ativa a região promotora. Três dispositivos que respondem a algumas das substâncias químicas presentes no GSR foram projetados e são apresentados neste trabalho.
Os promotores utilizados nos três dispositivos microbocop são um promotor sensível ao arsênico e antimônio, sbrfp9,10, um promotor sensível à chumbo, pbrfp11,12 e um promotor sensível TNT, TNT-RFP 13. porque uma busca na literatura não revelou nenhum promotor projetado responder ao bário, o promotor de TNT foi selecionado preferivelmente desde que este promotor é sensível a um número de compostos estruturalmente relacionados (em particular, 2,4-dinitrotoluene e dinitrobenzeno) que são conhecidos por ser uma parte dos compostos orgânicos deixados para trás em GSR. Este promotor foi usado com sucesso para detectar especificamente quantidades minuciosa de TNT e 2,4-dinitrotolueno (2,4-DNT) em minas terrestres enterradas13. Usando os três dispositivos juntos como um sistema, um teste positivo para GSR produzirá fluorescência em todos os três dispositivos. Um sinal de fluorescência em apenas um ou dois dispositivos indicará outra fonte ambiental da (s) analito ou no caso do promotor TNT, ativação por um composto que não é um composto orgânico deixado para trás em GSR. Ao utilizar todos os três dispositivos em conjunto, a possibilidade de resultados falsos positivos devido a fontes ambientais é minimizada. Munição sem chumbo, que está ganhando popularidade, ainda representa apenas cerca de 5% das vendas de munição nos Estados Unidos; daqui, os resultados falsos negativos devido à ausência de chumbo podem ser uma possibilidade mas há ainda uma utilidade em um sensor que use a ligação como um marcador para o GSR14. Além desta aplicação forense específica, cada dispositivo pode ser usado separadamente para fins de detecção de contaminantes ambientais.
Os protocolos apresentados incluem as técnicas de biologia sintética utilizadas para criar os dispositivos (bactérias do sensor) e as técnicas analíticas para verificar a função dos dispositivos e analisar os sinais de fluorescência obtidos. O protocolo também inclui a coleta de evidências forenses na forma de mão limpando para coletar GSR das mãos de um suspeito ou limpando para coletar GSR de uma superfície. Os resultados do dispositivo do sensor da ligação são apresentados como resultados do exemplo, junto com uma demonstração de um teste positivo para o GSR usando uma carcaça gasta do cartucho.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3-dinitrobenzene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D194255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-dinitrotoluene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>101397-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA450-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duplex Buffer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-03-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, HPLC grade, denatured</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC611050040</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GTAAAACGACGGCCAGTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SL21-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes</td>
			<td>Hygenall</td>
			<td>45NRCN</td>
			<td>Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology</td>
			<td>Registry of Standard Biological Parts</td>
			<td></td>
			<td>http://parts.igem.org/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promoter Sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Sb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCAGTCAT 
			ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG 
			AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT 
			GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC 
			GTTGTTAGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			Pb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCGTCTTG 
			ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA 
			ACGCGAGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG 
			ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			TNT promoter: 5&#8217;GCATTCTAGATCAATT 
			TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT 
			TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA 
			CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT 
			CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3&#8217; 3&#8217;CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG 
			CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT 
			TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT 
			GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA 
			ATTAACTTAAGCGTA5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GGAAACAGCTATGACCATG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue

MicRoboCop é um biosensor que foi projetado para uma aplicação única em química forense. O MicRoboCop é um sistema constituído por três dispositivos que, quando utilizados em conjunto, podem indicar a presença de resíduo de pólvora (GSR) produzindo um sinal de fluorescência na presença de três analitos-chave (antimônio, chumbo e componentes orgânicos da GSR). O protocolo descreve a síntese dos biossensores utilizando Escherichia coli (e. coli), e os métodos de química analítica utilizados para avaliar a seletividade e a sensibilidade dos sensores. O funcionamento do sistema é demonstrado usando GSR coletado do interior de uma carcaça gasta do cartucho. Uma vez preparados, os biossensores podem ser armazenados até que seja necessário e podem ser usados como um teste para esses principais analitos. Uma resposta positiva de todos os três analitos fornece um teste positivo presuntivo para o GSR, quando cada dispositivo individual tiver aplicações para detectar os analitos em outras amostras (por exemplo, um detetor para a contaminação da ligação na água bebendo). A principal limitação do sistema é o tempo necessário para um sinal positivo; trabalho futuro pode envolver o estudo de diferentes organismos para otimizar o tempo de resposta.

Os espectros de fluorescência para a variante RFP utilizados neste trabalho são mostrados na Figura 2. Estes dados são do dispositivo de PbRFP enquanto responde à ligação e ao dispositivo de TNT-RFP enquanto responde a dois analytes, 2,4-DNT e 1,3-DNB. Esta figura mostra o espectro de um controle negativo (nenhum analito adicionado), e os espectros em dois níveis diferentes de analito adicionado. O sinal de fluorescência máximo para a variante RFP utilizado foi o...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

Um protocolo é apresentado usando técnicas de biologia sintética para sintetizar um conjunto de biossensores bacterianos para a análise de resíduo de pólvora, e para testar o funcionamento dos dispositivos para seu uso pretendido usando espectroscopia de fluorescência.

Preparação e aplicação de um novo biosensor bacteriano para a detecção presuntiva de resíduo de bala

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Este protocolo descreve a preparação e análise de um biosensor único que foi projetado para detectar os componentes químicos do resíduo de pólvora. O uso de biosensores para aplicações forenses é único. Representa uma alternativa de baixo custo e simples de usar para a instrumentação altamente especializada normalmente usada em laboratórios forenses.Os métodos de biologia sintética descritos podem ser usados para qualquer sistema que use partes de biologia sintética padrão. A análise química descrita é aplicável a qualquer biosensor que expresse proteína fluorescente vermelha. Demonstrando o procedimento estarão Andrea Soles e Elle Richardson, estudantes de graduação da Universidade de Longwood.Para iniciar este procedimento, adicione dez microlitadores do DNA plasmídeo J10060 anteriormente isolado a um tubo de microcentrifuge. Adicione oito microliters de água, e um microliter de cada uma das enzimas EcoRI e NHEL pré-misturadas com um microliter de buffer. Para o DNA do promotor, adicione dez microliters de sequências de DNA do promotor a um tubo de microcentrifuge fresco.Adicione oito microliters de água, e um microliter de cada uma das enzimas EcoRI e NHEL pré-misturadas com um microliter de buffer. Usando uma pipeta definida para dez microliters, delicadamente pipeta as amostras para cima e para baixo para misturar. Incubar as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, aqueça e ativo as enzimas a 80 graus Celsius por cinco minutos. Guarde o DNA digerido em um congelador até que esteja pronto para prosseguir. Primeiro, use o DNA plasmídeo e promotor que foram previamente digeridos para configurar a reação em um tubo de microcetrifúgio no gelo, como descrito na tabela um do protocolo de texto.Certificando-se de adicionar o T4 DNA Ligase por último. Pipeta para cima e para baixo suavemente para misturar a reação, e centrífuga brevemente. Incubar em temperatura ambiente por dez minutos.Em seguida, aqueça e ative a 65 graus Celsius por dez minutos. Realize a transformação conforme descrito no protocolo de texto. Primeiro, configure as misturas de reação para PCR conforme descrito na tabela dois do protocolo de texto.Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar as reações. Usando uma ponta de pipeta amarela, raspe uma colônia do E.coli transformado. Transfira um deslize deste E.coli para uma nova placa de ágar LB-ampicillin que foi seccionada e, em seguida, insira a ponta da pipeta no tubo PCR.Agite a ponta da pipeta para misturar o E.Coli com a mistura PCR. Repita este processo mais três vezes para colônias adicionais. Em seguida, carregue os tubos PCR em uma máquina PCR e comece a termociclamento conforme descrito na tabela três do protocolo de texto.Para começar, rotule o número adequado de tubos de cultura estéreis conforme descrito na tabela quatro do protocolo de texto. Adicione dois mililitros do caldo de cultura preparado a cada tubo. Adicione a solução de estoque de anilite aos tubos conforme descrito na tabela quatro.Em seguida, coloque as tampas de encaixe nos tubos de cultura para que fiquem soltos para permitir o fluxo de ar no tubo. Vórtice cada tubo de cultura. Depois disso, coloque os tubos em uma incubadora de agitação a 37 graus Celsius e a 220 RPM por pelo menos 24 horas.Primeiro, use uma limpeza à base de etanol projetada para remover chumbo para limpar todas as superfícies das mãos, inclusive entre os dedos. Armazene os lenços em um saco vedado devidamente rotulado até a análise. Use uma limpeza à base de álcool para limpar quaisquer superfícies grandes a serem testadas.Use uma troca de algodão umedecido com etanol para limpar quaisquer superfícies pequenas a serem testadas. Usando luvas limpas e usando uma tesoura que foi limpa com álcool, corte uma seção que é aproximadamente um centímetro quadrado fora do centro do lenço. Em seguida, coloque o pedaço de limpeza cortado, ou cotonete, diretamente em um tubo de cultura contendo dois mililitros da bactéria do sensor, e certifique-se de que ele está completamente submerso no caldo.Prepare o espectrômetro para coletar a submissão fluorescente no comprimento de onda apropriado para a variante RFP, com um comprimento de onda de excitação de 500 nanômetros. Em seguida, use uma batedeira de vórtice para agitar os tubos. Transfira cuidadosamente cada supernante para um cuvette de baixo volume e colete a intensidade de emissão.Usando uma batedeira de vórtice, agite os tubos. Transfira 200 microliters do caldo para um poço na placa do poço. Registo que amostras foram em cada poço desta placa.Configure o farinhaômetro para coletar a intensidade de emissão no comprimento de onda apropriado para a variante RFP. O espectro de fluorescência para uma variante RFP representativa mostra tanto o controle negativo quanto o espectro em dois níveis diferentes de anilite adicionados. O sinal fluorescente máximo para a variante RFP utilizado neste trabalho é observado em 575 nanômetros.Os dados representativos são coletados para o mesmo conjunto de soluções, tanto do espectrômetro portátil quanto do fluorômetro. Há uma tendência geral de aumento da fluorescência à medida que a concentração de anilite aumenta. Vale ressaltar que em altas concentrações, superiores a cerca de 800 partes por bilhão para o sensor de chumbo, a resposta cai devido à toxicidade do chumbo em uma concentração tão alta.A análise das amostras de cotonete de etanol do interior de uma cápsula de cartucho de calibre 40 gasta fornece a prova dos resultados dos princípios. Os resultados positivos de cada uma das três bactérias do sensor indicam um teste positivo para resíduos de pólvora. Os biosensores preparados neste protocolo também podem ser usados individualmente para detectar contaminação em alimentos, água ou amostras ambientais.Esta técnica abre caminho para os pesquisadores desenvolverem biosensores usando técnicas padrão de biologia sintética para uma variedade de diferentes anilites químicos. Os equipamentos de proteção individual devem ser usados, e os analistas devem lavar as mãos e desinfetar superfícies após o manuseio de E.coli. Os resíduos devem ser autoclavados, e quaisquer resíduos contendo metais pesados devem ser tratados em conformidade.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

Preparação e Uso de Samário diiodeto (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) Em Organic Synthesis: The Role mecanístico de HMPA e (II) de Ni Sais na Reacção Barbier Samário

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Química

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Síntese de hipervalente iodónio Alquinilo triflatos de Aplicação de Geração Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Isolamento e Preparação de Paredes Celulares Bacterianas para Análise Composicional por Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Preparação de Mica e silício substratos para análise do DNA Origami e Experimentação

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocolo para a Síntese de Derivados de Anilina Orto-trifluorometoxilados

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Síntese de Bioconjugados de proteínas<em&gt; via</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Síntese Facile de micelas Worm-like por luz visível Mediated Dispersão Polimerização Usando Photoredox Catalisador

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparação e Avaliação de<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-rotulados tridentadas Quelatos de Pré-alvo Usando Bioorthogonal Química

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...