Name: preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить студентов в университете Лонгвуд в BIOL 324 (генетика) и студентов в хим 403 (Расширенный решение проблемы химической лаборатории), которые были вовлечены в первоначальную подготовку и тестирование биосенсоров сурьмы и свинца. Идея MicRoboCop была задумана на GCAT SynBIO семинар (лето 2014), который финансируется ННФ и Говард Хьюз медицинский институт и организовано в университете штата Мэриленд Балтимор County. Авторы также признают финансирование, полученное от университета Лонгвуд Кук-Коул колледжа искусств и наук и GCAT SynBio выпускников Грант.

Примечание: синтез кишечной палочки , ВЫРАЖАЮЩЕЕ ППП, представлено.
1. Приготовление плазмид ДНК из кишечной палочки
<ol><li>Оттепель E. coli , содержащая плазмид с геном ППП и гена устойчивости ампициллина и расти E. coli на Лурия бульон (lb) агар пластин, содержа...

<ol>
	<li>Eschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;The+Story+of+the+Real+Canary+in+the+Coal+Mine.&#34;.">&#34;The Story of the Real Canary in the Coal Mine.&#34;.</a> The Smithsonian Magazine. , (2016).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors &#38; Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+genetically+engineered+microbial+whole-cell+biosensors+for+combined+chemosensing.">Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).</li><li>Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gunshot+Residue+and+Associated+Materials-A+Review.">Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).</li><li>Bell, S., Seitzinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+binary+presumptive+assays+to+probabilistic+assessments:+Differentiation+of+shooters+from+non-shooters+using+IMS,+OGSR,+neural+networks,+and+likelihood+ratios.">From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios.</a> Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).</li><li>O&#39;Mahony, A. M., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Detection+of+Gunshot+Residue+for+Forensic+Analysis:+A+Review.">Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review.</a> Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).</li><li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Biosensor+Technology+for+Potential+Applications+-+An+Overview.">Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).</li><li>Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralogous+Regulators+ArsR1+and+ArsR2+of+Pseudomonas+putida+KT2440+as+a+Basis+for+Arsenic+Biosensor+Development.">Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).</li><li>Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Biological+Organisms+as+Chemical+Sensors:+The+MicRoboCop+Project.">Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project.</a> Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).</li><li>Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+the+pbr+lead+resistance+determinant+of+Ralstonia+metallidurans+CH34.">Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34.</a> Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).</li><li>Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+coordination+of+Pb(II)+is+involved+in+the+PbrR-dependent+activation+of+the+lead-resistance+promoter,+PpbrA,+from+Cupriavidus+metallidurans+CH34.">Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34.</a> Bmc Microbiology. 12, (2012).</li><li>Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene+by+an+Escherichia+coli+bioreporter:+performance+enhancement+by+directed+evolution.">Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).</li><li>Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Guns+in+America:+The+Debate+Over+Lead+Based+Bullets.&#34;.">&#34;Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.&#34;.</a> Newsweek. , (2017).</li><li>Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAAS+Determination+of+Antimony,+Barium,+and+Lead+Levels+in+Gunshot+Residue+Swabs:+An+Application+in+Forensic+Chemistry.">GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry.</a> Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).</li><li>Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+and+Behavior+of+Gunshot+Residue-A+Review.">Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).</li><li>Yagur-Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+bioreporters+for+the+detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene.">Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).</li></ol>

Модификации и устранение неполадок
Эксперимент, описанный в таблице 4 , может быть изменен любым способом, подходящим для разработанных датчиков. Наиболее важным аспектом химического датчика является оценка его чувствительности и специфичности. Это в?...

Биосенсор — это любое аналитическое устройство, которое использует биологические компоненты (такие как белки, нуклеиновые кислоты или целые организмы), которые производят реакцию, которая может быть использована для обнаружения химического вещества или анализата. Например, угольная промышленность использовала биосенсор в течение большей части 20-го века для выявления наличия токсичных шахтных газов: канарейка в угольной шахте1. Реакция биологического организма (канарейки) (смерть или бедствие) на химический анализатор (окись углерода) наблюдалась шахтерами в целях защиты рабочих. В более современном и утонченном примере бактерии могут быть изменены с помощью синтетических методов биологии для реагирования на наличие определенного химического анализата, показывая конкретный ответ, например, выражение флуоресцентного белка.
Синтетическая биология является широкий термин, который относится к строительству биологических устройств и систем, которые не существуют, естественно, или ре-дизайн существующих биологических систем для конкретной цели2. Синтетическая биология отличается от генной инженерии стандартной методологией и существованием стандартизированных частей (стандартных синтетических генетических элементов биологии), которые могут быть использованы для синтеза устройств и систем. Часть вводится в геном устройства, такой организм, как бактерия, чтобы выразить определенную черту, которая послужит признаком функции. Например, во многих синтетических устройствах экспрессия флуоресцентного белка вводится в единый клеточный организм в качестве корреспондента белка. Несколько устройств могут быть объединены в систему. Геномов микроорганизмов, таких как бактерии легко манипулировать таким образом. Многочисленные примеры биосенсоров, специфических для широкого спектра химических анализаторов, были зарегистрированы в литературе за последнее десятилетие3,4.
В этой работе, система MicRoboCop представлена в качестве примера биосенсор разработан с использованием синтетических методов биологии с новыми приложениями в судебно-медицинской и экологической химии. MicRoboCop представляет собой систему из трех отдельных устройств, которые, в сочетании, позволит кишечной палочки , чтобы выразить красный флуоресцентный белок (ППП) в присутствии огнестрельных остатков (ГСР), который был собран из рук человека или поверхности. Каждое из трех устройств реагирует на конкретный химический анализатор, который, как известно, является компонентом GSR5. Три анализата, к которым реагирует система,-это I. 2, 4, 6-тритротолуол (ТНТ) и родственные соединения, II. свинца (в виде свинцо-ионов) и III. сурьмы (также в виде ионов).
ГСР состоит из множества различных химических веществ, но три обычно используются для идентификации остатков, поскольку GSR являются барием, свинцом и сурьмой5. Стандартным тестом доказательности для идентификации ГСР является использование сканирующей электронной микроскопии (РЭМ) с энергией диспергирующей рентгеновской флуоресценции (EDX)5. МДж-ЭДХ позволяет аналитикам идентифицировать уникальную морфологию и элементарные компоненты ГСР. В настоящее время есть несколько широко используются бинарные предположительные тесты доступны. Один недавно опубликованный предположительный тест использует Ion-мобильность спектроскопии (МСМ), который является специализированным оборудованием, которые не могут быть доступны во многих лабораториях6. Есть также несколько цветовых "точечные" тесты, которые могут быть использованы, хотя они, как правило, используются для определения расстояния или для идентификации GSR на пулевые отверстия и раны5. Дополнительно, было некоторое ограниченное внимание в литературе к электрохимическим испытаниям для GSR, которые используют волтамметрический анализ, который имеет преимущество потенциально быть полем портативным, или анодической зачистки волтамметрии, который является чрезвычайно чувствительный метод для металлических элементов7. Существует очень мало упоминается в литературе биосенсоров разработан специально для целей обнаружения ГСР, хотя некоторые биосенсоров для других судебно-медицинских заявок были опубликованы8.
Биологические элементы для каждого устройства в системе MicRoboCop и плазмированной конструкции проиллюстрированы на рисунке 1. Изогнутая стрелка в рисунке 1B представляет собой промоутер области, которая активируется в присутствии анализатора, овальные является рибосомальных связывания сайт, который позволяет перевод репортер белка, серый ящик с меткой ППП является ген, который выражает красный флуоресцентный белок, а красный восьмиугольник является прекращение транскрипции сайте. Все три устройства будут использоваться совместно в качестве системы для обнаружения GSR. Каждое устройство с определенным промоутером (SbRFP, PbRFP и ТНТ-ППП) будет инкубировали с образцом, который проходит испытания и флуоресценции ППП будут оцениваться. ППП будет выражен только если соответствующий химический анализатор присутствует и активирует промоутер региона. Были разработаны и представлены в этой работе три устройства, которые отвечают на некоторые химические вещества, присутствующие в ГСР.
Промоутеры, используемые в трех устройствах microbocop являются мышьяк и сурьмы чувствительных промоутер, sbrfp9,10, ведущий чувствительный промоутер, pbrfp11,12 и ТНТ чувствительный промоутер, ТНТ-ППП 13. потому что поиск в литературе выявлено не промоутер предназначен для реагирования на БАРИЙ, ТНТ промоутер был выбран вместо, так как этот промоутер чувствителен к ряду структурно связанных соединений (в частности, 2, 4-dinitrouene и динитобензола), которые, как известно, являются частью органических соединений, оставленных в ГСР. Этот промоутер успешно используется для специально обнаружить мельчайшие количества ТНТ и 2, 4-динитолуол (2, 4-DNT) в захороненных шахтах земли13. С помощью трех устройств вместе, как система, положительный тест на GSR будет производить флуоресценцию во всех трех устройствах. Флуоресцентное сигнала только в одном или двух устройствах будет указывать другой экологический источник анализатора (ы) или в случае промоутер ТНТ, активация соединения, которое не является органическим соединением, оставленному в GSR. С помощью всех трех устройств, возможность ложных положительных результатов из-за экологических источников сводится к минимуму. Свинец боеприпасов, который набирает популярность, по-прежнему составляет лишь около 5% от продажи боеприпасов в Соединенных Штатах; Следовательно, ложные отрицательные результаты из-за отсутствия свинца может быть возможность, но есть еще утилита в датчик, который использует свинец в качестве маркера для GSR14. В дополнение к этому конкретному судебно-медицинской заявке, каждое устройство может быть использовано отдельно для целей обнаружения загрязняющих веществ в окружающей среде.
Представленные протоколы включают в себя синтетические методы биологии, используемые для создания устройств (сенсорных бактерий) и аналитических методов, чтобы проверить функцию устройств и проанализировать флуоресцентных сигналов, полученных. Протокол также включает в себя сбор вещественных доказательств в виде ручного протирания для сбора ГСР из рук подозреваемого или Швабинга для сбора ГСР с поверхности. Результаты с устройства ведущего датчика приведены в качестве примера результатов, а также демонстрация положительного теста для GSR с использованием отработавшего гильзы.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3-dinitrobenzene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D194255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-dinitrotoluene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>101397-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA450-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duplex Buffer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-03-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, HPLC grade, denatured</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC611050040</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GTAAAACGACGGCCAGTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SL21-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes</td>
			<td>Hygenall</td>
			<td>45NRCN</td>
			<td>Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology</td>
			<td>Registry of Standard Biological Parts</td>
			<td></td>
			<td>http://parts.igem.org/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promoter Sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Sb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCAGTCAT 
			ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG 
			AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT 
			GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC 
			GTTGTTAGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			Pb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCGTCTTG 
			ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA 
			ACGCGAGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG 
			ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			TNT promoter: 5&#8217;GCATTCTAGATCAATT 
			TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT 
			TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA 
			CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT 
			CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3&#8217; 3&#8217;CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG 
			CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT 
			TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT 
			GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA 
			ATTAACTTAAGCGTA5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GGAAACAGCTATGACCATG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue

MicRoboCop является биосенсор, который был разработан для уникального применения в судебно-медицинской химии. MicRoboCop представляет собой систему из трех устройств, которые, при использовании вместе, может указывать на наличие огнестрельных остатков (ГСР), производя флуоресцентного сигнала в присутствии трех ключевых анализатов (сурьмы, свинца и органических компонентов ГСР). Протокол описывает синтез биосенсоров с использованием кишечной палочки (кишечная палочка) и аналитических методов химии, используемых для оценки селективности и чувствительности датчиков. Функционирование системы демонстрируется с помощью GSR, собранной из внутренней части отработавшего гильзы. После того как они подготовлены, биосенсоры могут храниться до тех пор, пока они не понадобятся, и могут быть использованы в качестве теста для этих ключевых анализаторов. Положительный отклик всех трех анализаторов обеспечивает предположительный положительный тест для ГСР, в то время как каждое отдельное устройство имеет приложения для обнаружения анализатора в других образцах (например, детектор для загрязнения свинцом в питьевой воде). Основным ограничением системы является время, необходимое для положительного сигнала; Будущая работа может включать изучение различных организмов для оптимизации времени отклика.

Флуоресцентное спектры для варианта ППП, используемого в этой работе, показаны на рисунке 2. Эти данные с устройства PbRFP, как он реагирует на свинец и ТНТ-ППП устройство, как он реагирует на два анализата, 2, 4-DNT и 1, 3-ДНБ. Эта цифра показывает спектр отрицательного...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

Протокол представлен с использованием методов синтетической биологии, чтобы синтезировать набор бактериальных биосенсоров для анализа остатков огнестрельных, и проверить функционирование устройств для их предполагаемого использования с помощью флуоресцентной спектроскопии.

Подготовка и применение нового бактериального биосенсора для предполагаемого обнаружения огнестрельных остатков

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Этот протокол описывает подготовку и анализ уникального биосенсора, который был разработан для обнаружения химических компонентов остатков огнестрельного оружия. Использование биосенсоров для судебно-медицинской экспертизы является уникальным. Он представляет собой недорогой и простой в использовании альтернативу высокоспециализированным приборам, обычно используемым в судебно-медицинских лабораториях.Описанные методы синтетической биологии могут быть использованы для любой системы, которая использует стандартные синтетические части биологии. Описанный химический анализ применим к любому биосенсору, который выражает красный флуоресцентный белок. Демонстрация процедуры будет Андреа Соулесс и Элле Ричардсон, студенты Университета Лонгвуда.Чтобы начать эту процедуру, добавьте десять микролитров ранее изолированной плазмидной ДНК J10060 в микроцентрифугную трубку. Добавьте восемь микролитров воды и по одному микролитеру каждого из ферментов EcoRI и NHEL, предварительно смешанных с одним микролитером буфера. Для промоутер ДНК, добавить десять микролитров annealed промоутер последовательности ДНК в свежей трубке микроцентрифуг.Добавьте восемь микролитров воды и по одному микролитеру каждого из ферментов EcoRI и NHEL, предварительно смешанных с одним микролитером буфера. Используя пипетку, установленную до десяти микролитров, аккуратно пипетку образцы вверх и вниз, чтобы смешать. Инкубировать образцы при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.Затем нагревать и активить ферменты при температуре 80 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Храните переваренную ДНК в морозильной камере до готовности к работе. Во-первых, используйте плазмидную и пробирку ДНК, которые ранее переваривались, чтобы настроить реакцию в трубке микроцетифуги на льду, как указано в таблице одного из текстовых протоколов.Убедившись, чтобы добавить T4 ДНК Ligase последний. Pipette вверх и вниз осторожно, чтобы смешать реакцию, и центрифуга кратко. Инкубировать при комнатной температуре в течение десяти минут.Затем нагрейте и активируйте при температуре 65 градусов по Цельсию в течение десяти минут. Выполните преобразование, изложенное в текстовом протоколе. Во-первых, наведите реакционной смеси для ПЦР, как указано во второй таблице текстового протокола.Аккуратно пипетки вверх и вниз, чтобы смешать реакции. Используя кончик желтой пипетки, соскрепайте колонию преобразованного E.coli. Перенесите салфетки этого E.coli на новую пластину Агара LB-ампициллина, которая была отрубается, а затем вставьте наконечник пипетки в трубку ПЦР.Встряхните наконечник пипетки, чтобы смешать E.Coli с смесью ПЦР. Повторите этот процесс еще три раза для дополнительных колоний. Затем загрузите трубки ПЦР в машину ПЦР и начните термоциклинг, как указано в таблице 3 текстового протокола.Чтобы начать маркировать соответствующее количество стерильных трубок культуры, как указано в таблице 4 текстового протокола. Добавьте в каждую трубку два миллилитров приготовленного культурного бульона. Добавьте раствор анилитного бульона в трубки, изложенные в таблице 4.Затем поместите крышки оснастки на культурные трубки, чтобы они были свободны, чтобы поток воздуха в трубку. Vortex каждой культуры трубки. После этого поместите трубки в трясусь инкубатор при 37 градусах по Цельсию и при 220 об/мин в течение по крайней мере 24 часов.Во-первых, используйте этанол на основе салфетки, предназначенные для удаления привести к протрите все поверхности рук, в том числе между пальцами. Храните салфетки в надлежащим образом помечены герметимые мешочек до анализа. Используйте спиртовую салфетку, чтобы вытереть любые большие поверхности для тестирования.Используйте хлопчатобумажный своп, смоченный этанолом, чтобы вытереть любые мелкие поверхности для тестирования. Ношение чистых перчаток и с помощью ножниц, которые были очищены с алкоголем, вырезать раздел, который составляет примерно один квадратный сантиметр из центра салфетки. Затем поместите разрезанный кусок салфетки, или ватный тампон, прямо в культурную трубку, содержащую два миллилитров сенсорных бактерий, и убедитесь, что он полностью погружен в бульон.Подготовь спектрометр для сбора флуоресцентного представления на соответствующей длине волны для варианта RFP, с возбуждением длины волны 500 нанометров. Затем используйте вихревой миксер, чтобы встряхнуть трубки. Тщательно перенесите каждый супернатант на малотометную кюветту и соберите интенсивность выбросов.Используя вихревой миксер, встряхните трубки. Перенесите 200 микролитров бульона в колодец в хорошой тарелке. Запись, какие образцы пошли в каждый колодец этой пластины.Настройка flourometer для сбора интенсивности выбросов на соответствующей длине волны для варианта RFP. Спектры флуоресценции для репрезентативного варианта RFP показывают как отрицательный контроль, так и спектры на двух разных уровнях анилита. Максимальный флуоресцентный сигнал для варианта RFP, используемого в этой работе, наблюдается на уровне 575 нанометров.Репрезентативные данные собираются для одного и того же набора решений, как с портативного спектрометра, так и с флюорометра. Существует общая тенденция флуоресценции увеличивается по мере увеличения концентрации анилита. Стоит отметить, что при высоких концентрациях, больше, чем около 800 частей на миллиард для датчика свинца, ответ падает из-за токсичности свинца при такой высокой концентрации.Анализ образцов этанолового тампона с внутренней стороны корпуса картриджа 40 калибра является доказательством принципиальных результатов. Положительные результаты от каждой из трех сенсорных бактерий, указывает на положительный тест на остатки огнестрельного оружия. Биосенсоры, подготовленные в этом протоколе, также могут использоваться индивидуально для обнаружения загрязнения образцов пищевых продуктов, воды или окружающей среды.Этот метод прокладывает путь для исследователей для разработки биосенсоров с использованием стандартных методов синтетической биологии для различных химических анилитов. Индивидуальное защитное оборудование следует носить, а аналитикам следует мыть руки и дезинфицировать поверхности после обработки E.coli. Отходы должны быть автоматически использованы, и любые отходы, содержащие тяжелые металлы должны быть обработаны соответствующим образом.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

Подготовка и использование самария дииодида (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) В органическом синтезе: Механистические Роль HMPA и Ni (II) соли в реакции самария Барбье

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Синтез гипервалентных иодония Алкинил трифлаты по применению генерирующая Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Изоляция и подготовка бактериальных клеточных стенок для композиционного анализа с помощью ультра производительности жидкой хроматографии

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Подготовка слюды и кремниевых подложках для ДНК оригами анализа и экспериментированию

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Протокол синтеза<em&gt; Орто</em&gt; -trifluoromethoxylated анилина

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Синтез белка биоконъюгатов<em&gt; с помощью</em&gt; Цистеин-малеимид химии

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Синтез червеобразных мицелл с помощью видимого света опосредованного дисперсионной полимеризации с использованием Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Подготовка и оценка<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc меченных тридентатной хелатов для предварительной ориентации Использование биоортогональные реакции

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...