Name: preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Författarna vill erkänna studenterna vid Longwood University i BIOL 324 (genetik) och studenterna i CHEM 403 (Advanced Chemical Laboratory problemlösning) som var inblandade i den inledande beredning och testning av antimon och bly bio sensorer. Idén till MicRoboCop var tänkt på GCAT SynBIO workshop (sommar 2014), som finansieras av NSF och Howard Hughes Medical Institute och värd University of Maryland Baltimore County. Författarna erkänner också finansiering som erhållits från Longwood University ' s Cook-Cole College of Arts and Sciences och GCAT SynBio Alumni Grant.

Anmärkning: syntes av E. coli som uttrycker RFP presenteras.
1. beredning av plasmid DNA från E. coli
<ol><li>Tina e. coli innehåll Ande en Plasmid med en RFP-gen och ampicillin-resistens gen och odla e. coli på LURIA buljong (lb) agar plattor som innehåller 100 μg/ml ampicillin vid 37 ° c för 24 h. Till exempel använda J10060 Plasmid från registret av standard biologiska delar som används för syntetisk biologi (se tabell över material...

<ol>
	<li>Eschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;The+Story+of+the+Real+Canary+in+the+Coal+Mine.&#34;.">&#34;The Story of the Real Canary in the Coal Mine.&#34;.</a> The Smithsonian Magazine. , (2016).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors &#38; Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+genetically+engineered+microbial+whole-cell+biosensors+for+combined+chemosensing.">Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).</li><li>Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gunshot+Residue+and+Associated+Materials-A+Review.">Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).</li><li>Bell, S., Seitzinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+binary+presumptive+assays+to+probabilistic+assessments:+Differentiation+of+shooters+from+non-shooters+using+IMS,+OGSR,+neural+networks,+and+likelihood+ratios.">From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios.</a> Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).</li><li>O&#39;Mahony, A. M., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Detection+of+Gunshot+Residue+for+Forensic+Analysis:+A+Review.">Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review.</a> Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).</li><li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Biosensor+Technology+for+Potential+Applications+-+An+Overview.">Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).</li><li>Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralogous+Regulators+ArsR1+and+ArsR2+of+Pseudomonas+putida+KT2440+as+a+Basis+for+Arsenic+Biosensor+Development.">Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).</li><li>Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Biological+Organisms+as+Chemical+Sensors:+The+MicRoboCop+Project.">Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project.</a> Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).</li><li>Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+the+pbr+lead+resistance+determinant+of+Ralstonia+metallidurans+CH34.">Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34.</a> Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).</li><li>Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+coordination+of+Pb(II)+is+involved+in+the+PbrR-dependent+activation+of+the+lead-resistance+promoter,+PpbrA,+from+Cupriavidus+metallidurans+CH34.">Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34.</a> Bmc Microbiology. 12, (2012).</li><li>Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene+by+an+Escherichia+coli+bioreporter:+performance+enhancement+by+directed+evolution.">Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).</li><li>Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Guns+in+America:+The+Debate+Over+Lead+Based+Bullets.&#34;.">&#34;Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.&#34;.</a> Newsweek. , (2017).</li><li>Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAAS+Determination+of+Antimony,+Barium,+and+Lead+Levels+in+Gunshot+Residue+Swabs:+An+Application+in+Forensic+Chemistry.">GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry.</a> Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).</li><li>Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+and+Behavior+of+Gunshot+Residue-A+Review.">Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).</li><li>Yagur-Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+bioreporters+for+the+detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene.">Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).</li></ol>

Ändringar och fel sökning
Experimentet som beskrivs i tabell 4 kan på något sätt anpassas till de sensorer som har konstruerats. Den viktigaste aspekten av en kemisk sensor är att utvärdera dess känslighet och specificitet. Det är fördelaktigt att se till att en mängd olika koncentrationer av analyten analyseras för att bestämma det användbara analytiska omfånget av sensorn. Det är också värt att fastställa en maximal nivå av analyt för ce...

En bio sensor är en analytisk enhet som använder biologiska komponenter (t. ex. proteiner, nukleinsyror eller hela organismer) som ger ett svar som kan användas för detektion av ett kemiskt ämne eller en analyt. Som ett exempel, använde kol gruv industrin en bio sensor för mycket av 20-talet för att upptäcka förekomsten av giftiga gruv gaser: Kanarie fågeln i kol gruvan1. Den biologiska organismens (Kanarie öarnas) reaktion (död eller ångest) på en kemisk analyt (kolmonoxid) observerades av gruv arbetarna för att skydda arbetarna. I ett mer modernt och sofistikerat exempel kan bakterier ändras med hjälp av syntetiska bio Logi tekniker för att svara på närvaron av en viss kemisk analyt genom att ställa ut ett specifikt svar, såsom uttryck av ett fluorescerande protein.
Syntetisk biologi är ett brett begrepp som hänvisar till byggandet av biologiska anordningar och system som inte existerar naturligt, eller omkonstruktion av befintliga biologiska system för ett specifikt ändamål2. Syntetisk biologi skiljer sig från gen teknik genom en standard metodik och förekomsten av standardiserade delar (standard syntetiska biologi genetiska element) som kan användas för att syntetisera enheter och system. En del förs in i genomet av en anordning, en organism som en bakterie, att uttrycka en viss egenskap som kommer att fungera som en indikation på funktion. I många syntetiska produkter introduceras till exempel ett fluorescerande protein i en enda celledorganism som ett reporter protein. Flera enheter kan kombineras till ett system. Genom mikroorganismer som bakterier är lätta att manipulera på detta sätt. Många exempel på bio sensorer som är specifika för ett brett spektrum av kemiska analyter har rapporter ATS i litteraturen under det senaste decenniet3,4.
I detta arbete är MicRoboCop systemet presenteras som ett exempel på en bio sensor utformad med hjälp av syntetiska biologi tekniker med nya tillämpningar i kriminal teknisk och miljö kemi. MicRoboCop är ett system med tre separata enheter som, när de kombineras, kommer att göra det möjligt Escherichia coli att uttrycka rött fluorescerande protein (RFP) i närvaro av skott rester (GSR) som har samlats in från en persons händer eller en yta. Var och en av de tre enheterna reagerar på en specifik kemisk analyt som är känd för att vara en del av GSR5. De tre analyter som systemet svarar på är I. 2, 4, 6-trinitrotoluen (TNT) och besläktade föreningar, II. bly (i form av bly joner) och III. Antimon (även i form av joner).
GSR består av många olika kemiska ämnen, men de tre som vanligt vis används för att identifiera en rest som GSR är barium, bly, och antimon5. Det standardiserade bevis provet för identifiering av GSR är att använda scanning elektronmikroskopi (SEM) med energidispersiv röntgen fluorescens (EDX)5. SEM-EDX gör det möjligt för analytiker att identifiera den unika morfologin och elementär komponenterna i GSR. För närvarande finns det få utbredda binära presumtiva tester tillgängliga. En nyligen publicerad presumtiva test använder Jon-rörlighet spektroskopi (IMS), som är specialiserad utrustning som kanske inte finns i många Labs6. Det finns också några färg "spot"-tester som kan användas, även om de vanligt vis används för avstånds bestämning eller för GSR identifiering på kula hål och sår5. Dessutom har det förekommit viss begränsad uppmärksamhet i litteraturen till elektrokemiska tester för GSR som sysselsätter voltammetrisk analys, som har fördelen av att potentiellt vara fältet portabel, eller Anodisk strippning voltametri, vilket är en extremt känslig metod för metalliska element7. Det finns mycket lite omnämnande i litteraturen av bio sensorer som utformats speciellt för att upptäcka GSR, även om vissa bio sensorer för andra kriminal tekniska tillämpningar har publicerats8.
De biologiska elementen för varje enhet i MicRoboCop-systemet, och plasmidkonstruktionen, illustreras i figur 1. Den böjda pilen i figur 1b representerar den promotor region som aktive ras i närvaro av analyten, ovalen är den ribosomala bindnings platsen som tillåter översättning av reporterproteinet, den grå rutan märkt RFP är den gen som uttrycker röd fluorescerande protein, och den röda Oktagonen är transkriptionsterminerings platsen. Alla tre enheter kommer att användas tillsammans som ett system för att upptäcka GSR. Varje enhet med en specifik promotor (SbRFP, PbRFP och TNT-RFP) kommer att inkuberas med provet som testas och fluorescens av RFP kommer att mätas. RFP kommer endast att uttryckas om lämplig kemisk analyt finns och aktiverar Promotorns region. Tre enheter som reagerar på några av de kemiska ämnen som finns i GSR har utformats och presenteras i detta arbete.
De initiativtagare som används i de tre microbocop enheter är en arsenik och antimon känsliga Promotorn, sbrfp9,10, en ledande känslig promotor, pbrfp11,12 och en TNT känslig promotor, TNT-RFP 13. eftersom en sökning i litteraturen inte visade någon promotor som var avsedd att reagera på barium valdes TNT-Promotorn istället, eftersom denna promotor är känslig för ett antal strukturellt besläktade föreningar (i synnerhet 2, 4-dinitrotoluen och dinitrobensen) som är kända för att vara en del av de organiska föreningarna kvar i GSR. Denna promotor har framgångs rikt använts för att specifikt upptäcka minut mängder TNT och 2, 4-dinitrotoluen (2, 4-DNT) i begravda landminor13. Med hjälp av de tre enheterna tillsammans som ett system, ett positivt test för GSR kommer att producera fluorescens i alla tre enheter. En fluorescenssignal i endast en eller två enheter kommer att indikera en annan miljö källa av analyten (s) eller i fallet med TNT Promotorn, aktivering av en förening som inte är en organisk förening kvar i GSR. Genom att använda alla tre enheterna tillsammans minimeras möjligheten till ett falskt positivt resultat på grund av miljö källor. Blyfri ammunition, som ökar i popularitet, utgör fortfarande bara cirka 5% av ammunitions försäljningen i USA; Därför kan falskt negativa resultat på grund av avsaknad av bly vara en möjlighet, men det finns fortfarande nytta i en sensor som använder bly som en markör för GSR14. Utöver denna specifika kriminal tekniska applikation kan varje enhet användas separat för att upptäcka miljö föroreningar.
De protokoll som presenteras inkluderar syntetisk biologi tekniker som används för att skapa enheter (sensor bakterier) och analys metoder för att kontrol lera funktionen av enheterna och analysera fluorescens signaler som erhållits. Protokollet innehåller också insamling av kriminal tekniska bevis i form av hand torka för att samla GSR från händerna på en misstänkt eller badda att samla GSR från en yta. Resultat från bly sensor enheten presenteras som exempel resultat, tillsammans med en demonstration av ett positivt test för GSR med hjälp av ett använt patron hölje.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3-dinitrobenzene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D194255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-dinitrotoluene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>101397-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA450-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duplex Buffer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-03-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, HPLC grade, denatured</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC611050040</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GTAAAACGACGGCCAGTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SL21-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes</td>
			<td>Hygenall</td>
			<td>45NRCN</td>
			<td>Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology</td>
			<td>Registry of Standard Biological Parts</td>
			<td></td>
			<td>http://parts.igem.org/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promoter Sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Sb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCAGTCAT 
			ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG 
			AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT 
			GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC 
			GTTGTTAGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			Pb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCGTCTTG 
			ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA 
			ACGCGAGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG 
			ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			TNT promoter: 5&#8217;GCATTCTAGATCAATT 
			TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT 
			TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA 
			CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT 
			CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3&#8217; 3&#8217;CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG 
			CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT 
			TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT 
			GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA 
			ATTAACTTAAGCGTA5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GGAAACAGCTATGACCATG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue

MicRoboCop är en bio sensor som har utformats för en unik tillämpning inom kriminal teknisk kemi. MicRoboCop är ett system som består av tre enheter som, när de används tillsammans, kan indikera förekomsten av skott rester (GSR) genom att producera en fluorescenssignal i närvaro av tre nyckelanalyter (antimon, bly och organiska komponenter av GSR). Protokollet beskriver syntesen av bio sensorerna med Escherichia coli (E. coli), och de analytiska kemi metoder som används för att utvärdera sensorernas selektivitet och känslighet. Systemets funktion demonstreras med hjälp av GSR som samlats in från insidan av ett använt patron hölje. När de har förberetts kan bio sensorerna lagras tills de behövs och kan användas som ett test för dessa nyckelanalyter. Ett positivt svar från alla tre Analyterna ger ett presumtivt positivt test för GSR, medan varje enskild enhet har tillämpningar för detektering av Analyterna i andra prover (t. ex. en detektor för bly förorening i dricks vatten). Den huvudsakliga begränsningen av systemet är den tid som krävs för en positiv signal; framtida arbete kan innebära att studera olika organismer för att optimera responstiden.

Fluorescenspektra för RFP-varianten som används i detta arbete visas i figur 2. Dessa data kommer från PbRFP-enheten eftersom den svarar på bly och TNT-RFP-enheten eftersom den svarar på två analyter, 2, 4-DNT och 1, 3-DNB. Denna siffra visar ett spektrum av en negativ kontroll (ingen analyten tillsätts), och spektra vid två olika nivåer av analyt tillsätts. Den maximala fluorescenssignalen för den använda RFP-varianten observerades vid 575 nm (exciteringvågl...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

Ett protokoll presenteras med hjälp av syntetiska bio Logi tekniker för att syntetisera en uppsättning av bakteriella bio sensorer för analys av skott rester, och för att testa driften av enheterna för deras avsedda användning med fluorescensspektroskopi.

Beredning och tillämpning av en ny bakteriell bio sensor för presumtiva upptäckten av Gunshot rester

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Detta protokoll beskriver beredning och analys av en unik biosensor som har utformats för att upptäcka de kemiska komponenterna i skottrester. Användningen av biosensorer för kriminaltekniska tillämpningar är unik. Det representerar en låg kostnad, enkel att använda alternativ till den mycket specialiserade instrumentering som vanligtvis används i kriminaltekniska laboratorier.De syntetiska biologimetoder som beskrivs kan användas för alla system som använder syntetiska biologidelar av standard. Den beskrivna kemiska analysen är tillämplig på varje biosensor som uttrycker rött fluorescerande protein. Demonstrera förfarandet kommer att Andrea Soles och Elle Richardson, studenter vid Longwood University.För att börja detta förfarande, tillsätt tio mikroliter av den tidigare isolerade J10060 plasmid DNA till en microcentrifug röret. Tillsätt åtta mikroliter vatten, och en mikroliter av var och en av EcoRI och NHEL enzymer pre-blandas med en mikroliter av buffert. För promotorn DNA, tillsätt tio mikroliter av glödgad promotor DNA-sekvenser till en färsk microcentrifug röret.Tillsätt åtta mikroliter vatten, och en mikroliter av var och en av EcoRI och NHEL enzymer pre-blandas med en mikroliter av buffert. Med hjälp av en pipett inställd på tio mikroliter, försiktigt pipetter proverna upp och ner för att blanda. Inkubera proverna vid 37 grader Celsius i 30 minuter.Värm sedan och aktiv enzymerna vid 80 grader Celsius i fem minuter. Förvara det rötade DNA i en frys tills det är klart att fortsätta. Använd först plasmiden och promotorn DNA som tidigare smälts för att ställa in reaktionen i ett mikrocetrifugeringsrör på is, som beskrivs i tabell ett av textprotokollet.Se till att lägga till T4 DNA Ligase sist. Pipett upp och ner försiktigt för att blanda reaktionen, och centrifug kort. Inkubera i rumstemperatur i tio minuter.Värm sedan och aktivera vid 65 grader Celsius i tio minuter. Utför omvandlingen enligt skiss i textprotokollet. Först, ställa in reaktionsblandningar för PCR som beskrivs i tabell två i textprotokollet.Försiktigt pipettera upp och ner för att blanda reaktionerna. Med hjälp av en gul pipettspets skrapar du en koloni av den förvandlade E.coli. Överför en känga av denna E.coli på en ny LB-ampicillin agar platta som har sektionats av, och sedan sätta in pipettspetsen i PCR-röret.Skaka pipettspetsen för att blanda E.Coli med PCR-mixen. Upprepa denna process ytterligare tre gånger för ytterligare kolonier. Sedan, ladda PCR-rören i en PCR-maskin, och börja thermocycling som beskrivs i tabell tre av textprotokollet.Att börja märka lämpligt antal sterila kulturrör som beskrivs i tabell fyra i textprotokollet. Tillsätt två milliliter av den beredda odlingsbuljong till varje rör. Tillsätt anilitbeståndslösningen till rören enligt skiss i tabell fyra.Placera sedan snap caps på odlingsrören så att de är lösa för att tillåta luftflöde in i röret. Vortexa varje kulturrör. Efter detta placerar du rören i en skakskuvös vid 37 grader Celsius och vid 220 RPM i minst 24 timmar.Använd först en etanolbaserad torka avsedd för att ta bort bly för att torka av alla ytor på händerna, inklusive mellan fingrarna. Förvara våtservetterna i en lämpligt märkt förslutningsbar påse tills analysen. Använd en alkoholbaserad torka för att torka av alla stora ytor som ska testas.Använd en bomullsbyte fuktad med etanol för att torka av eventuella små ytor som ska testas. Bära rena handskar och använda sax som har rengjorts med alkohol, skär en sektion som är ungefär en kvadratcentimeter ut ur mitten av torka. Placera sedan den skurna biten av torka, eller bomullspinne, direkt i en kultur röret som innehåller två milliliter av sensorn bakterier, och se till att det är helt nedsänkt i buljongen.Förbered spektrometern för att samla in fluorescerande underkastelse vid lämplig våglängd för RFP-varianten, med en excitationsvåglängd på 500 nanometer. Använd sedan en vortexblandare för att skaka rören. Överför noggrant varje supernatant till en låg volym cuvette, och samla in utsläppsintensiteten.Med hjälp av en vortex mixer, skaka rören. Överför 200 mikroliter av buljongen till en brunn i brunnsplattan. Registrera vilka prover som gick in i varje brunn av denna platta.Ställ in mjölometern för att samla in emissionsintensiteten vid lämplig våglängd för RFP-varianten. Fluorescensspektra för en representativ RFP-variant visar både den negativa kontrollen och spektra på två olika nivåer av anilit till. Den maximala lysrörssignalen för RFP-varianten som används i detta arbete observeras vid 575 nanometer.Representativa data samlas in för samma uppsättning lösningar, från både den bärbara spektrometern och fluorometern. Det finns en allmän trend av fluorescensen ökar som koncentrationen av anilit ökar. Det är värt att notera att vid höga koncentrationer, större än cirka 800 delar per miljard för blysensorn, sjunker svaret på grund av toxiciteten av bly vid en så hög koncentration.Analys av etanol svabb prover från insidan av en förbrukad 40 kaliber patron hölje ger bevis på princip resultat. De positiva resultaten från var och en av de tre sensorbakterierna, indikerar ett positivt test för skottrester. De biosensorer som bereds i detta protokoll kan också användas individuellt för att upptäcka kontaminering i livsmedels-, vatten- eller miljöprover.Denna teknik banar väg för forskare att utveckla biosensorer med hjälp av standard syntetisk biologi tekniker för en mängd olika kemiska aniliter. Personlig skyddsutrustning bör bäras, och analytiker bör tvätta händer och desinficera ytor efter hantering av E.coli. Avfall bör autoklaveras, och eventuella avfall som innehåller tungmetall bör behandlas därefter.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

Beredning och användning av samariumdijodid (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) I Organic Synthesis: den mekanistiska roll HMPA och Ni (II) salter i Samarium Barbier Reaktion

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Syntes av hypervalent jodonium Alkynyl triflater för tillämpning av Generera Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Isolering och beredning av bakteriella cellväggar för kompositionsanalys av ultraprestanda flytande kromatografi

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Framställning av Mica och kiselsubstrat för DNA Origami analys och Experiment

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protokoll för syntes av<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated anilinderivat

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntesen av protein biokonjugat<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Syntes av maskliknande Miceller med synligt ljus medierad dispersionspolymerisation Använda Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Beredning och utvärdering av<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-märkt tridentat Chelates för Pre-inriktning Använda Bioorthogonal kemi

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...