Name: preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Yazarlar, Longwood Üniversitesi 'nde BıOL 324 (genetik) ve CHEM 403 (gelişmiş kimyasal laboratuar problemi çözme) öğrencileri, antimon ve kurşun biyosensörlerin ilk hazırlığı ve testinde yer alan öğrencileri kabul etmek ister. MicRoboCop için fikir GCAT SynBIO atölye (Yaz 2014), hangi NSF ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü tarafından finanse edilir ve Maryland Üniversitesi Baltimore County tarafından barındırılan tasarlandı. Yazarlar ayrıca Longwood Üniversitesi Cook-Cole College of Arts and Sciences ve GCAT SynBio mezunlar hibe alınan fon kabul.

Not: RFP 'yi ifade eden E. coli sentezi sunulmuştur.
1. E. coli 'den PLASMID DNA 'sı hazırlanması
<ol><li>Bir RFP geni ve ampisilin direnç geni ile bir Plasmid içeren ve e. coli 'yi, 37 °c ' de 24 saat boyunca 100 μg/ml ampisilin Içeren Luria broth (lb) agar tabakaları ile çözülür. Örneğin, sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden J10060 Plasmid kullanın (bkz. malzeme tablosu...

<ol>
	<li>Eschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;The+Story+of+the+Real+Canary+in+the+Coal+Mine.&#34;.">&#34;The Story of the Real Canary in the Coal Mine.&#34;.</a> The Smithsonian Magazine. , (2016).</li><li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors:+A+critical+review.">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors &#38; Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li><li>He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+genetically+engineered+microbial+whole-cell+biosensors+for+combined+chemosensing.">Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).</li><li>Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gunshot+Residue+and+Associated+Materials-A+Review.">Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).</li><li>Bell, S., Seitzinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+binary+presumptive+assays+to+probabilistic+assessments:+Differentiation+of+shooters+from+non-shooters+using+IMS,+OGSR,+neural+networks,+and+likelihood+ratios.">From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios.</a> Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).</li><li>O&#39;Mahony, A. M., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Detection+of+Gunshot+Residue+for+Forensic+Analysis:+A+Review.">Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review.</a> Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).</li><li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+Biosensor+Technology+for+Potential+Applications+-+An+Overview.">Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).</li><li>Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralogous+Regulators+ArsR1+and+ArsR2+of+Pseudomonas+putida+KT2440+as+a+Basis+for+Arsenic+Biosensor+Development.">Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).</li><li>Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Biological+Organisms+as+Chemical+Sensors:+The+MicRoboCop+Project.">Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project.</a> Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).</li><li>Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+analysis+of+the+pbr+lead+resistance+determinant+of+Ralstonia+metallidurans+CH34.">Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34.</a> Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).</li><li>Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+coordination+of+Pb(II)+is+involved+in+the+PbrR-dependent+activation+of+the+lead-resistance+promoter,+PpbrA,+from+Cupriavidus+metallidurans+CH34.">Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34.</a> Bmc Microbiology. 12, (2012).</li><li>Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene+by+an+Escherichia+coli+bioreporter:+performance+enhancement+by+directed+evolution.">Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).</li><li>Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Guns+in+America:+The+Debate+Over+Lead+Based+Bullets.&#34;.">&#34;Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.&#34;.</a> Newsweek. , (2017).</li><li>Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAAS+Determination+of+Antimony,+Barium,+and+Lead+Levels+in+Gunshot+Residue+Swabs:+An+Application+in+Forensic+Chemistry.">GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry.</a> Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).</li><li>Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+and+Behavior+of+Gunshot+Residue-A+Review.">Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).</li><li>Yagur-Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+bioreporters+for+the+detection+of+2,4-dinitrotoluene+and+2,4,6-trinitrotoluene.">Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).</li></ol>

Değişiklikler ve sorun giderme
Tablo 4 ' te açıklanan deney, tasarlanmış sensörlere uygun şekilde değiştirilebilir. Bir kimyasal sensörün en önemli yönü, duyarlılık ve özgüllüğü değerlendirmektir. Sensörün kullanışlı analitik aralığını belirlemek için çok çeşitli analitik konsantrasyonlarının analiz edildiğinden emin olmak yararlıdır. Aynı zamanda hücreler için en yüksek düzeyde analit belirlemekte değer. Bu çal?...

Bir biyosensör, bir kimyasal maddenin veya analitin tespiti için kullanılabilecek bir yanıt üreten biyolojik bileşenleri (proteinler, nüklemik asitler veya bütün organizmalar gibi) kullanan herhangi bir analitik cihazdır. Örnek olarak, kömür madencilik endüstrisi, zehirli maden gazlarının varlığını algılamak için 20. yüzyılın çoğunu bir biyosensör kullandı: kömür madeninde kanarya1. Biyoloji organizmanın (Kanarya 's) bir kimyasal analizine (karbon monoksit) yanıt (ölüm veya sıkıntı) işçiler korumak için madenciler tarafından gözlendi. Daha modern ve sofistike bir örnekte, bakterilerin bir floresan proteinin ifadesi gibi belirli bir yanıtı sergileme yoluyla belirli bir kimyasal analitin varlığına yanıt vermek için sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak değiştirilebilir.
Sentetik biyoloji, doğal olarak mevcut olmayan biyolojik cihazların ve sistemlerin inşası veya belirli bir amaç için mevcut biyolojik sistemlerin yeniden tasarımı anlamına gelen geniş bir terimdir2. Sentetik biyoloji, standart bir metodoloji ve cihazlar ve sistemlersentezlemek için kullanılabilecek standartlaştırılmış parçaların (Standart Sentetik Biyoloji Genetik elemanları) varlığı ile genetik mühendisliğinden ayrılır. Bir cihazıngenomuna, bir bakteri gibi bir organizmaya, fonksiyonun bir göstergesi olarak hizmet edecek belirli bir özelliği ifade etmek için bir parça tanıtılmaktadır. Örneğin, birçok sentetik cihazlarda, bir floresan proteinin ifadesi bir muhabir protein olarak tek bir hücreli organizmaya tanıtıldı. Birden çok aygıt bir sistemebirleştirilebilir. Bakteriler gibi mikroorganizmaların genomlar bu şekilde manipüle etmek kolaydır. Literatürde son on yıl içinde çok çeşitli kimyasal analitlere özgü biyosensörlerin çok sayıda örneği bildirilmiştir3,4.
Bu çalışmayla microbocop sistemi, adli ve çevresel kimyanın yeni uygulamaları ile sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak tasarlanan bir biyosensör örneği olarak sunulmuştur. MicRoboCop üç ayrı cihazların bir sistemdir, kombine, Escherichia coli kırmızı floresan protein (RFP) bir kişinin elleriyle veya bir yüzey toplanan silah kalıntı (GSR) varlığında ifade izin verecektir. Üç cihazın her biri, GSR5' in bir bileşeni olarak bilinen belirli bir kimyasal analit yanıt verir. Sistemin yanıt verdiği üç analitik, I. 2, 4, 6-Trinitrotoluen (TNT) ve ilgili bileşikler, II. (kurşun iyonlarının şeklinde) ve III. antimon (Ayrıca iyonlarının şeklinde).
GSR birçok farklı kimyasal madde içerir, ancak üç genellikle GSR olarak bir kalıntı tanımlamak için kullanılan Baryum, kurşun, ve antimon5. GSR tanımlaması için standart kanıt testi, enerji Dispersif X-ışını floresans (EDX)5ile Tarama elektron MIKROSKOBU (SEM) kullanmaktır. SEM-EDX, analistlerin benzersiz morfolojisi ve GSR 'nin Elemental bileşenlerini tanımlamasına olanak tanır. Şu anda, mevcut birkaç yaygın kullanılan ikili varsayımsal testler vardır. Son zamanlarda yayımlanan bir varsayım testi birçok Labs6mevcut olmayabilir özel ekipman iyon-mobilite spektroskopisi (IMS) kullanır. Genellikle mesafe belirlenmesi için veya mermi delikleri ve yaralar5GSR kimlik için kullanılan olsa da, kullanılabilecek bir kaç renk "Spot" testler vardır. Ayrıca, bu potansiyel alan taşınabilir olma avantajı vardır voltammetrik analiz, istihdam GSR için elektrokimyasal testler için literatürde bazı sınırlı dikkat olmuştur, ya da anodik sıyırma voltammetry, hangi bir son derece Metalik elemanlar için hassas Yöntem7. Diğer adli uygulamalar için bazı biyosensörler8yayınlandı olsa da, GSR tespit amacıyla özel olarak tasarlanmış biyosensörler literatürde çok az söz vardır.
MicRoboCop sistemindeki her cihaz için biyolojik unsurlar ve Plasmid inşaatı Şekil 1' de gösterilmiştir. Şekil 1B 'deki kavisli ok, analitin varlığını etkinleştiren Organizatör bölgesini temsil eder, oval, muhabir proteininin çevirisine izin veren ribozomal bağlayıcı sitedir, RFP etiketli gri kutu kırmızı ifade eden geni Floresan protein ve kırmızı sekizgen transkripsiyon sonlandırma sitesidir. Her üç cihaz, GSR algılamak için bir sistem olarak birlikte kullanılacaktır. Belirli bir promotör (SbRFP, PbRFP ve TNT-RFP) olan her cihaz, test edilen örnek ile inkübe edilecektir ve RFP floresans ölçülecektir. RFP sadece uygun kimyasal analitik mevcutsa ve organizatör bölgeyi aktive ederse ifade edilecektir. GSR 'de bulunan bazı kimyasal maddelere yanıt veren üç cihaz tasarlanmıştır ve bu çalışmanın içinde sunulmaktadır.
Üç mikrobocop cihazlarda kullanılan organizatör bir arsenik ve antimon duyarlı promotör, sbrfp9,10, bir kurşun duyarlı promotör, pbrfp11,12 ve bir TNT duyarlı promotör, TNT-RFP 13. çünkü literatürde bir arama Barium yanıt için tasarlanmış hiçbir Organizatör ortaya, TNT Organizatör bunun yerine seçildi bu Organizatör yapısal olarak ilgili bileşiklerin bir dizi duyarlı olduğundan (özellikle, 2, 4-dinitrotoluene ve dinitrobenzen), GSR 'de geride kalan organik bileşiklerin bir parçası olduğu bilinmektedir. Bu Organizatör, gömülü arazi madenlerinde13dakıka miktarları TNT ve 2, 4-Dinitrotoluen (2, 4-DNT) özellikle algılamak için başarıyla kullanılmıştır. Üç cihazı bir sistem olarak birlikte kullanarak, GSR için olumlu bir test, üç cihazda da floresan üretecek. Sadece bir veya iki cihazda floresans sinyali, analitin (s) başka bir çevresel kaynağını veya TNT promotör durumunda, GSR 'de kalan organik bir bileşik olmayan bir bileşik tarafından aktivasyonunu gösterecektir. Her üç cihazı birlikte kullanarak, çevresel kaynaklar nedeniyle yanlış olumlu sonuçlar olasılığı minimize edilir. Popülerlik kazanıyor kurşun-ücretsiz mühimmat, hala ABD 'de mühimmat satışları sadece yaklaşık% 5 temsil eder; Bu nedenle, kurşun yokluğunda nedeniyle yanlış olumsuz sonuçlar bir olasılık olabilir ama GSR14için bir marker olarak kurşun kullanan bir sensör hala yarar vardır. Bu özel adli uygulamaya ek olarak, her cihaz çevresel kontaminantların tespit edilmesi amacıyla ayrı olarak kullanılabilir.
Sunulan protokoller, cihazların fonksiyonunu kontrol etmek ve elde edilen floresan sinyalleri analiz etmek için cihazları (sensör bakterileri) ve analitik teknikleri oluşturmak için kullanılan sentetik biyoloji tekniklerini içerir. Protokol Ayrıca, bir şüphelinin elinden GSR toplamak veya bir yüzeyden GSR toplamak için sürüntü el silme şeklinde adli kanıtlar koleksiyonunu içerir. Kurşun sensör cihazının sonuçları, harcanan kartuş muhafazasını kullanarak GSR için olumlu bir testin gösterilmesi ile birlikte örnek sonuçlar olarak sunulur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3-dinitrobenzene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D194255-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,4-dinitrotoluene, 97%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>101397-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA450-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duplex Buffer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-03-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, HPLC grade, denatured</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC611050040</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>SimpleSeq Kit Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GTAAAACGACGGCCAGTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead, Reference Standard Solution (1000ppm &#177;1%/Certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SL21-100</td>
			<td>Standard in dilute HNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes</td>
			<td>Hygenall</td>
			<td>45NRCN</td>
			<td>Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B1500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology</td>
			<td>Registry of Standard Biological Parts</td>
			<td></td>
			<td>http://parts.igem.org/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promoter Sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Sb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCAGTCAT 
			ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG 
			AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT 
			GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC 
			GTTGTTAGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			Pb promoter: 5&#8217;-GCATGAATTCGTCTTG 
			ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA 
			ACGCGAGCTAGCGCAT-3&#8217; 3&#8217;-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG 
			ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5&#8217; 
			TNT promoter: 5&#8217;GCATTCTAGATCAATT 
			TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT 
			TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA 
			CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT 
			CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3&#8217; 3&#8217;CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG 
			CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT 
			TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT 
			GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA 
			ATTAACTTAAGCGTA5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for colony PCR</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer for DNA sequencing</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- GGAAACAGCTATGACCATG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and application of a new bacterial biosensor for the presumptive detection of gunshot residue

Microbocop adli Kimya benzersiz bir uygulama için tasarlanmış bir biyosensör olduğunu. MicRoboCop, birlikte kullanıldığında, üç anahtar analitinin (antimon, Lead ve organik bileşenleri) varlığında floresan sinyali üreterek silah kalıntılarının (GSR) varlığını belirtebilmekte olan üç cihazdan oluşan bir sistemdir. Protokol, Escherichia coli (E. coli) kullanarak biyosensörlerin sentezini ve sensörlerin seçicilik ve hassasiyetini değerlendirmek için kullanılan analitik kimya yöntemlerini açıklar. Sistemin işleyişi, harcanan bir kartuş muhafazanın içinden toplanan GSR kullanılarak gösterilmiştir. Hazırlanmış bir kez, biyosensörler gerekli kadar depolanabilir ve bu anahtar analitler için bir test olarak kullanılabilir. Üç analitlerden olumlu bir yanıt, GSR için bir tahmin pozitif test sağlar, her bir cihaz diğer örneklerde analitler (örneğin, içme suyunda kurşun kontaminasyonu için bir dedektör) tespit etmek için uygulamalar vardır. Sistemin ana sınırlaması pozitif bir sinyal için gereken zamandır; gelecekteki çalışmalar, yanıt süresini optimize etmek için farklı organizmaların incelenmesi gerektirebilir.

Bu çalışta kullanılan RFP varyantı için floresan spektrumları Şekil 2' de gösterilir. Bu veriler, iki analitik, 2, 4-DNT ve 1, 3-DNB yanıt olarak kurşun ve TNT-RFP cihaza yanıt olarak PbRFP cihazdan. Bu rakam bir negatif kontrol spektrumunu gösterir (hiçbir analit eklendi), ve analitik iki farklı düzeylerde spektrum ekledi. Kullanılan RFP varyantı için maksimum floresan sinyali 575 Nm (uyarma dalga boyu 500 Nm) olarak gözlenmiştir. Şekil 3</s...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue at JoVE.com

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

Bir protokol, silah kalıntıları analizi için bir dizi bakteriyel biyosensör sentezlemek ve floresan spektroskopisi kullanılarak amaçlanan kullanım için cihazların çalışmasını sınamak için sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak sunulmuştur.

Silah kalıntılarının varsayımsal tespiti için yeni bir bakteriyel biyosensörün hazırlanması ve uygulanması

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Bu protokol, barut kalıntısının kimyasal bileşenlerini tespit etmek için tasarlanmış benzersiz bir biyosensör hazırlanması nı ve analizini açıklar. Adli uygulamalar için biyosensörlerin kullanımı benzersizdir. Genellikle adli laboratuvarlarda kullanılan son derece özel enstrümantasyon alternatif kullanımı basit, düşük maliyetli temsil eder.Açıklanan sentetik biyoloji yöntemleri standart sentetik biyoloji parçaları kullanan herhangi bir sistem için kullanılabilir. Açıklanan kimyasal analiz, kırmızı floresan proteini ifade eden tüm biyosensörler için geçerlidir. Prosedürü gösteren Andrea Soles ve Elle Richardson, Longwood Üniversitesi'nde lisans öğrencileri olacaktır.Bu prosedüre başlamak için, bir mikrosantrifüj tüpüne daha önce izole edilmiş J10060 plazmid DNA'sının on mikrolitresini ekleyin. Sekiz mikrolitre su ve EcoRI ve NHEL enzimlerinin her birinin bir mikrolitresini bir mikrolitre tampon mikrolitreile önceden karıştırın. Organizatör DNA için, taze bir mikrosantrifüj tüpüne on mikrolitre annealed organizatör DNA dizisi ekleyin.Sekiz mikrolitre su ve EcoRI ve NHEL enzimlerinin her birinin bir mikrolitresini bir mikrolitre tampon mikrolitreile önceden karıştırın. On mikrolitreye ayarlanmış bir pipet kullanarak, numuneleri karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı iniler. Örnekleri 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.Sonra, ısı ve 80 santigrat derecede beş dakika boyunca enzimleri aktif. Sindirilmiş DNA'yı devam edene kadar dondurucuda saklayın. İlk olarak, daha önce sindirilmiş plazmid ve organizatör DNA'sını kullanarak, metin protokolünün birinci tablosunda belirtildiği gibi, buz üzerindeki mikrositör tüpünde reaksiyonu ayarlayın.En son T4 DNA Ligase'yi eklediğinizden emin olun. Pipet yukarı ve aşağı yavaşça reaksiyonu karıştırmak için, ve kısa bir süre santrifüj. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yat.Sonra, ısı ve 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede etkinleştirin. Metin protokolünde özetlenen dönüştürmeyi gerçekleştirin. İlk olarak, metin protokolünün ikinci tablosunda belirtildiği gibi PCR için reaksiyon karışımlarını ayarlayın.Yavaşça pipet yukarı ve aşağı reaksiyonları karıştırmak için. Sarı pipet ucu kullanarak, dönüştürülmüş E.coli bir koloni kazıyın. Bu E.coli'nin bir kaydırmasını, kesitli yeni bir LB-ampicillin agar plakasına aktarın ve pipet ucunu PCR tüpüne takın.E.Coli'yi PCR karışımıyla karıştırmak için pipet ucunu sallayın. Ek koloniler için bu işlemi üç kez daha tekrarlayın. Daha sonra, PCR tüplerini bir PCR makinesine yükleyin ve metin protokolünün üçüncü tablolarında belirtildiği gibi termobisiklete başlayın.Metin protokolünün dördüncü tablosunda belirtildiği gibi uygun sayıda steril kültür tüpünü etiketlemeye başlamak için. Her tüp için hazırlanan kültür suyu iki mililitre ekleyin. Tablo dörtte belirtildiği gibi tüplere anilite stok çözeltisi ekleyin.Daha sonra, onlar tüp içine hava akışını sağlamak için gevşek böylece kültür tüpleri üzerinde snap kapaklar yerleştirin. Girdap her kültür tüpü. Bundan sonra, tüpleri 37 santigrat derecede ve 220 RPM'de en az 24 saat boyunca sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin.İlk olarak, parmaklar arasında da dahil olmak üzere ellerin tüm yüzeylerini silmek için kurşunu kaldırmak için tasarlanmış etanol bazlı bir mendil kullanın. Analiz edilene kadar mendilleri uygun şekilde etiketlenmiş bir mühürlenebilir torbada saklayın. Test edilecek geniş yüzeyleri silmek için alkol bazlı bir silme kullanın.Test edilecek küçük yüzeyleri silmek için etanol ile nemlendirilmiş bir pamuk takaskullanın. Temiz eldiven ler giyerek ve alkolle temizlenmiş makas lar kullanarak, mendilin ortasından yaklaşık bir santimetre karelik bir kesin. Daha sonra, kesme mendil parçasını veya pamuklu bezi doğrudan sensör bakterilerinin iki mililitresini içeren bir kültür tüpüne yerleştirin ve tamamen et suyuna batırdığından emin olun.RFP varyantı için uygun dalga boyunda floresan teslimtoplamak için spektrometre hazırlayın, 500 nanometre uyarma dalga boyu ile. Sonra, tüpleri sallamak için bir girdap karıştırıcı kullanın. Her supernatant'ı düşük hacimli bir cuvette'ye dikkatlice aktarın ve emisyon yoğunluğunu toplayın.Girdap mikseri kullanarak tüpleri sallayın. 200 mikrolitre suyu kuyudaki bir kuyuya aktarın. Bu plakanın her kuyuya hangi örneklerin girdiğini kaydedin.RFP varyantı için uygun dalga boyunda emisyon yoğunluğunu toplamak için flourometreyi ayarlayın. Temsili bir RFP varyantı için floresan spektrumları, eklenen iki farklı anit düzeyinde hem negatif kontrolü hem de spektrumları gösterir. Bu çalışmada kullanılan RFP varyantı için maksimum floresan sinyal 575 nanometre de gözlenmektedir.Temsili veriler, hem taşınabilir spektrometreden hem de florometreden aynı çözüm kümesi için toplanır. Anlit konsantrasyonu arttıkça floresan genel bir eğilim artmaktadır. Bu yüksek konsantrasyonlarda, kurşun sensörü için milyarda yaklaşık 800 parçadan daha fazla, tepki gibi yüksek bir konsantrasyonda kurşun toksisitesi nedeniyle düşer dikkati çekiyor.Harcanan 40 kalibrelik kartuş kasasının içinden alınan etanol bezi örneklerinin analizi, ilke sonuçlarının kanıtını sağlar. Üç sensör bakterisinin her birinden elde edilen pozitif sonuçlar, barut kalıntısı için pozitif bir test olduğunu gösteriyor. Bu protokolde hazırlanan biyosensörler, gıda, su veya çevresel numunelerde kontaminasyonu tespit etmek için ayrı ayrı da kullanılabilir.Bu teknik, araştırmacıların farklı kimyasal anilitler için standart sentetik biyoloji tekniklerini kullanarak biyosensörler geliştirmelerinin önünü açıyor. Kişisel koruyucu ekipmanlar giyilmeli ve analistler E.coli'yi kullandıktan sonra elleri yıkamalı ve yüzeyleri dezenfekte etmelidir. Atıklar otoklavved edilmeli ve ağır metal içeren atıklar buna göre tedavi edilmelidir.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

Hazırlanması ve Samaryum Diiodide Kullanımı (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) In Organic Synthesis: Samaryum Barbier Reaksiyonu HMPA ve Ni (II) tuzlarının Mekanistik Rolü

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Yaratma Cyanocarbenes Uygulanması için hipervalent iyodonyum Alkınıl triflatların Sentezi

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Bileşimsel Analiz için Bakteriyel Hücre Duvarlarının İzolasyonu ve Hazırlanması

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

DNA Origami Analiz ve Deney için Mika ve Silikon Yüzeyler Hazırlanması

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Sentezi İçin Protokol<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated Anilin türevleri

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Protein Bioconjugatlar sentezi<em&gt; yoluyla</em&gt; Sistein-maleimid Kimya

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Photoredox Katalizörü kullanarak görünür ışık aracılığı ile dispersiyon polimerleştirilmesi ile solucan gibi miseller Facile sentezi

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Hazırlama ve Değerlendirilmesi<sup&gt; 99m</sup&gt; Bioorthogonal Kimya Kullanarak Öncesi hedeflemek için üç dişli Şelatlar Tc-etiketli

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...