Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل برنامج "برنامج إيمي- نوثير Kr-3886/2-1" وSFB-1074 إلى J.K.؛ FOR2372 إلى M.G.)

1. إعداد جزيئات بروتك
تنبيه: يرجى الرجوع إلى جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذه المرادفات سامة ومسرطنة. يرجى استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية.
<ol><li>إعداد tert-butyl N...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li><li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation+by+PROTACs.">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li><li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation.">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li><li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs:+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation.">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).</li><li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

تصميم مثل هذه proTACs الإنسان كما هو موضح هنا لCRBN يعتمد على تقارب محددة من pomalidomide إلى CRBN، والتي تم استخدامها بنجاح في العديد من PROTACs heterobifunctional وأدى إلى تطوير PROTAC 8 باعتبارها عالية انتقائية CRBN المهينة. وقد تم بالفعل تأكيد خصوصية جزيء لدينا من قبل التحليلات البروتيومية24. با...

الأدوية المناعية (IMiDs) الثاليدوميد ونظائرها، lenalidomide وpomalidomide، وكلها معتمدة لعلاج الورم النقوي المتعدد، وربط E3 يوبيكويتين ligase cereblon (CRBN)، محول الركيزة لcullin4A-RING E3 في يوبيكويتين ligase (CRL4CRBN)1،2،3. ربط IMiDs يعزز تقارب CRL4CRBN لعوامل النسخ اللمفاوي ة Ikaros (IKZF1) وAiolos (IKZF3)، مما يؤدي إلى كل مكان والتدهور (الشكل1)4،5، 6 , 7 , 8.منذ IKZF1 و IKZF3 ضرورية لخلايا الورم النقوي متعددة, نتائج تعطيلها في تثبيط النمو. تم العثور على SALL4 مؤخرا كالركيزة الجديدة التي يسببها IMiD من CRBN التي من المرجح أن تكون مسؤولة عن المسخ وما يسمى كارثة Contergan في 1950s الناجمة عن الثاليدوميد9،10. وعلى النقيض من ذلك، فإن الكازين كيناز 1α (CK1α) هو الركيزة الخاصة بالليناليدوميد من CRBN التي تورطت في التأثير العلاجي في متلازمة خلل التنسج النخاعي مع حذف كروموسوم 5q11.
إن قدرة الجزيئات الصغيرة على استهداف بروتين معين للتحلل هي دلالة مثيرة على تطوير الأدوية الحديثة. في حين تم اكتشاف آلية الثاليدوميد ونظائرها بعد استخدامها لأول مرة في البشر، ما يسمى Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) وقد تم تصميمها لاستهداف على وجه التحديد بروتين من الفائدة (POI) (الشكل 2)12،13،14،15،16،17،18. PROTACs هي جزيئات heterobifunctional التي تتكون من ligand محددة لPOI متصلة عن طريق رابط إلى الرباط من الليغا سمعة E3 ubiquitin مثل CRBN أو فون هيبل لينداو (VHL)18,19,20, 21،22. PROTACs الحث على تشكيل مجمع ثلاثي عابر، وتوجيه POI إلى الليغا في كل مكان E3، مما أدى إلى وجود في كل مكان والتدهور البروتياسومال. المزايا الرئيسية لPROTACs على مثبطات التقليدية هو أن ملزمة لPOI كافية بدلا من تثبيط لها، وبالتالي PROTACs يمكن أن تستهدف مجموعة أوسع بكثير من البروتينات بما في ذلك تلك التي كانت تعتبر غير قابلة للمخدرات مثل [ ترجمفب 15] وبالإضافة إلى ذلك، تعمل جزيئات الشميرية بشكل حفاز، وبالتالي يكون لها قوة عالية. بعد نقل ubiquitin إلى POI، ينفصل المجمع الثلاثي وهو متاح لتشكيل مجمعات جديدة. وهكذا، تركيزات PROTAC منخفضة جدا كافية لتدهور البروتين المستهدف23.
هنا نقوم بوصف التوليف من pomalidomide-pomalidomide مترافق homo-PROTAC (مجمع 8) أن يجند CRBN لتدهور نفسها24. وE3 ubiquitin ligase CRBN بمثابة كل من المجند والهدف في نفس الوقت (الشكل3). للتحقق من صحة بياناتنا، قمنا أيضًا بتوليف عنصر تحكم سلبي ملزم (مركب 9). وتؤكد بياناتنا أن هومو-بروتك التوليف حديثا ً محدد لتدهور CRBN ولا له سوى آثار طفيفة على البروتينات الأخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

الأدوية المناعية (IMiDs) الثاليدوميد ونظائرها، lenalidomide وpomalidomide، وافقت جميع ادارة الاغذية والعقاقير لعلاج الورم النقوي المتعدد، والحث على كل مكان وتدهور عوامل النسخ اللمفاوي ة Ikaros (IKZF1) وAiolos (IKZF3) عن طريق سيريبلون (CRBN) E3 يوبيكويتين الرباطي للتدهور البروتياسومال. وقد استخدمت مؤخرا IMiDs لتوليد التحلل البروتيوليسي ثنائي وظيفية التي تستهدف chimeras (PROTACs) لاستهداف البروتينات الأخرى للتدهور في كل مكان وبروتياسومال من قبل الرباط يَكِنْ ر. بنُ3. قمنا بتصميم وتوليف PROTACs المتجانسة القائمة على pomalidomide وحللت قدرتها على الحث على توجيه ذاتي في كل مكان وتدهور CRBN. هنا, CRBN بمثابة على حد سواء, وE3 في كل مكان ligase والهدف في نفس الوقت. مركب هومو-بروتك 8 يتحلل CRBN مع فعالية عالية مع الحد الأدنى فقط من الآثار المتبقية على IKZF1 و IKZF3. لم يكن للتعطيل CRBN بواسطة مركب 8 أي تأثير على صلاحية الخلية وانتشار خطوط الخلايا النقوية المتعددة المختلفة. هذا homo-PROTAC يلغي آثار IMiDs في خلايا الورم النقوي متعددة. ولذلك، قد تساعد مركباتنا المستندة إلى بوماليدوميد المتجانسة على تحديد الركائز الذاتية والوظائف الفسيولوجية لـ CRBN والتحقيق في الآلية الجزيئية للـ IMiDs.

هنا وصفنا تصميم، والتوليف والتقييم البيولوجي لPROTAC المستندة إلى pomalidomide المتجانسة لتدهور CRBN. يتفاعل PROTAC لدينا في وقت واحد مع اثنين من جزيئات CRBN وتشكل المجمعات الثلاثية التي تحفز على التحلل الذاتي في كل مكان وتدهور البروتياسومال من CRBN مع الحد الأدنى فقط من الآثار المتبقية ...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

يصف هذا العمل التوليف والتوصيف لـ pomalidomide القائم على، ثنائي ة وظيفية هومو-بروتك كنهج جديد للحث على كل مكان وتدهور E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN)، وهو الهدف من النظائر الثاليدوميد.

التعطيل الكيميائي للE3 يوبيكويتين Ligase سيريبلون من قبل Pomalidomide القائم على Homo-PROTACs

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

لدينا PROTACs هو المتجانس الكيميائية الأولى من Cereblon، ويمكن أن تساعد على مزيد من توضيح الآلية الجزيئية للتناظرية الثاليدوميد، وكذلك للتحقيق في وظيفة الفسيولوجية من Cereblon. يمكن أن تكون تقنية منصة PROTAC الجديدة هذه مفيدة للغاية لاستهداف البروتينات ذات الاهتمام التي تعتبر غير قابلة للتتبع. تثبيط CRBN وحده ليس لديه نشاط مضاد للورم.ومع ذلك، قد يكون للتحلل CRBN الآثار السريرية في السمنة, الأمراض المعدية, وغيرها من الاضطرابات. التوليف هو التحدي وأنه من الصعب العثور على الوصلات المثلى والتعلق لتوليد التحللات البروتين فعالة عند تصميم مركب PROTAC. للبدء، ضع 2.46 جرامًا من L-Glutamine المحمي من قبل بوكاك و50 ملليلترًا من رباعي هيدروفوران في قارورة مستديرة القاع 100 ملليلتر، وحركها عند 800 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة.ثم، إضافة 1.95 غرام من 1، 1'carbonyldiimidazole وكمية الحفاز من 4-البيبيدين. مواصلة اثارة لمدة 10 ساعة في الجزر للحصول على حل عديم اللون واضح من مركب الجلوتاريميد. السماح للمحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة، وإزالة المذيب مع المبخر الدوارة.اِرْفي البقايا في 200 ملليلتر من خلات الإيثيل وسكبها في قمع فاصل. اغسل الطبقة العضوية بـ 50 ملليلتر كل من الماء الميون والمل محلول ملحي، وجفف الطبقة العضوية فوق كبريتات الصوديوم. الجاذبية تصفية الحل من خلال هلام السيليكا لإزالة desiccant، ومن ثم شطف هلام السيليكا مع 200 ملليلتر من خلات الإيثيل.إزالة المذيبات من الترشيح تحت فراغ للحصول على مركب 1 كما الصلبة عديم اللون. جفف المنتج تحت فراغ بين عشية وضحاها قبل استخدامه. بعد ذلك، قم بحل 0.50 جرام من خلات الصوديوم في 20 ملليلتر من حمض الخليك الجليدي في قارورة مستديرة القاع 100 ملليلتر مجهزة ببار ضجة.إضافة 1.25 غراما من 3-fluorophthalic anhydride و 1.14 غرام من الغلوتاريميد ويحرك في الجزر لمدة ست ساعات للحصول على حل الأرجواني من مجمع 3. اترك الخليط يبرد لدرجة حرارة الغرفة، ثم صبه في 100 ملليلتر من الماء الأيوني ويحرك لمدة 10 دقائق ليترسب في المركب 3. جمع الصلبة عن طريق الترشيح، وغسلها بالماء واثير البترول، وتجفيفه تحت فراغ لمدة يومين.بعد ذلك، ضع 0.83 جرام من المركب الثالث و20 ملليلتر من سلفوكسيد ثنائي الميثيل الجاف في قارورة شلينك سعة 50 ملليلتر وحركها لمدة دقيقتين. إضافة 0.22 غراما من ألفا أوميغا ديامين رابط مركب 6, و 1.05 ملليلتر من N, N-diisopropylethylamine ويحرك الخليط تحت الأرجون في 90 درجة مئوية لمدة 18 ساعة للحصول على هومديمر 8 في خليط أخضر داكن. اترك الخليط يبرد لدرجة حرارة الغرفة ويسكبه في 100 ملليلتر من الماء الأيون.استخراج المنتج في ثلاثة أجزاء 50 ملليلتر من خلات الإيثيل، والجمع بين الطبقات العضوية، وغسلها مع 50 ملليلتر كل من الماء والملوحة. جفف الطبقة العضوية المغسولة فوق كبريتات الصوديوم، فلتري التجفيف وأزل المذيب تحت الفراغ. Redissolve بقايا في كمية ضئيلة من المذيبات الكروموغرافيا وتطبيق على عمود هلام السيليكا لتنقية.جمع الكسور المنتج الفلورسنت، والجمع بينها، وإزالة المذيبات للحصول على Homodimer 8 كما الصلبة الصفراء. للبدء، قم بحل 2.28 جرام من الجلوتاريميد 1 في 25 ملليلتر من ثنائيثيلفورماميد في قارورة مستديرة القاع 100 ملليلتر. تعليق 2.76 غرام من كربونات البوتاسيوم المطحونة في هذا الحل.ثم، رسم 0.62 ملليلتر من يودوميثان في حقنة مجهزة بإبرة قياس 20. إضافة iodomethane قطرة الحكمة على مدى 10 ثانية. سداد القارورة مع الحاجز المطاطي، وإضافة إبرة تنفيس.سونيكات الخليط لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة للحصول على مجمع الجلوتاريميد 2. تخفيف الخليط مع 50 ملليلتر من خلات الإيثيل وصبه في قمع فاصل. شطف القارورة في القمع مع 50 ملليلتر آخر من خلات الإيثيل.العمل حتى المنتج وتنقية مع الكروماتوغرافيا العمود هلام السيليكا للحصول على الجلوتاميد 2 كمادة صلبة عديم اللون. قارن أوقات الاحتفاظ بمركّبات الجلوتاريميد 1 و2 للتأكد من نجاح ميثيل N. لبدء التحقق من صحة, علاج خلايا المايلوما المتعددة مع المركبات ذات الفائدة.عزل البروتينات ذات الصلة، وإعداد عينات لتحليل لطخة الغربية لتدهور البروتين. ثم، إعداد شطيرة هلام لSDS-PAGE وملء خزان العازلة الأنود مع حل 8.9 33-HCl. قم بتحميل عينات البروتين في الجل وتشغيله بسرعة 70 فولت لمدة 20 دقيقة، يليه 115 فولت لمدة 150 دقيقة.المقبل، وإعداد 1x نقل العازلة للمناعة ونقل بعناية هلام من كاسيت لها إلى مخزن نقل إلى توازن. عليك أن تكون حذرا جدا عند إزالة هلام من كاسيت لتكييف، لأنه يمكن أن تنفجر وتكوم بسرعة كبيرة. غمر 0.45 ميكرومتر بولي فينيليدين ثنائيفلورايد غشاء في الميثانول النقي لمدة 20 ثانية على الأقل لتنشيطه، ثم غمره في مخزن نقل 1x.السماح للجل والغشاء توازن لمدة 10 دقائق. ثم، تجميع الكاسيت النبل الغربية وتطبيق 180 مللي امبير لمدة 90 دقيقة لنقل البروتينات إلى الغشاء. بعد ذلك، تصور البروتينات عن طريق الكبت المناعي.لتقييم الآثار على صلاحية الخلية ، أولا ، بذرة 50000 خلايا المايلوما متعددة في بئر من 96 لوحة في ثلاثية المعادن البيولوجية. أضف إلى كل بئر 100 ميكرولترات من الوسائط التي تحتوي على DMSO ، أو 0.1 ، واحد ، أو 10 ميكرومولار من المركب 8 ، المركب 9 ، أو pomalidomide. لتنفيذ تجربة إنقاذ الخلية، بدلا من ذلك علاج الخلايا مع حل نانومولر 100 من مركب 8 لمدة ثلاث ساعات، إما قبل أو بعد إضافة حل واحد من ميكرومولور من pomalidomide.احتضان الخلايا لمدة 24، 48، أو 96 ساعة في 37 درجة مئوية في الغلاف الجوي 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وقياس صلاحية الخلية مع مقايسة الإنارة. تم تأكيد هيكل PROTAC 8 المتجانس بالبروتون والكربون NMR. تم تصنيع Heterodimeric PROTAC 9 كتحكم سلبي ، حيث ينتج عن N-methylation داخل جزء الغلوتارميد فقدان نخاع ، أو CRBN ، قدرة ملزمة.ال HOMO PROTAC 8 المستحثة بالقرب من تحلل الكربن البروتيومي الكامل مع الحد الأدنى من الآثار على عوامل النسخ اللمفاوية IKZF1 و IKZF3. في المقابل، أظهرت هيتيرو PROTAC 9 سلوكًا مشابهًا لـ pomalidomides. ويمكن أن يُمنع تحلل CRBN المستحث المركب 8 بواسطة مثبط مباشر للبروتيات، أو مسدود بشكل غير مباشر بواسطة تثبيط النتيلية.الخلايا المعالجة مسبقاً بالمركب 8 قاومت بشكل كبير آثار بوماليدوميد على IKZF1 و IKZF3. وكان للتحلل المستحث للكربن المستحث 8 تأثير أقل بكثير على قابلية الخلية المايلوما المتعددة البقاء بعد 96 ساعة من IKZF1 و IKZF3 من المركب 9 وmomadomide فعل. وكان العديد من خلايا المايلوما المعالجة مسبقا مع مركب 8 قابلية أكبر بكثير عند التعرض لmomaalidomide من الخلايا غير المعالجة, مما يشير إلى أن المركب 8 يمكن استخدامها لمحاكاة المناعة IMiD المخدرات المقاومة.وجدنا أن مركب 8 يدفع التحلل الكامل للبروتياسوم من Cereblon, ليس له آثار جانبية على IKZF1 و IKZF3 الخلية البقاء والانتشار. إن توسيع نطاق تكنولوجيا المشروع ليشمل أهدافاً أخرى ينطوي على إمكانية تعطيل وتتبع البروتينات المرتبطة بالسرطان وغيره من الأمراض. عند تكييف هذه التقنية للأدوية والبروتينات الأخرى ، ينبغي للمرء أن يحقق بعناية في الهياكل الجزيئية للدواء والهدف من البروتين لاختيار الروابط والمرفقات المثلى.لن تعمل IMiDs في الفئران بسبب طفرة نقطة في Cereblon ، ولكن يوجد نموذج فأر سريع في محور وراثيا يمكن استخدامه لمزيد من الدراسات الحيوانية. كما pomalidomide هو الثاليدوميد التناظرية، وهو مسخ للغاية، ونحن لا ننصح النساء الحوامل الذين يعملون مع هذه الأدوية.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

اوريغامي الملهمة التجميع الذاتي للجزيئات منقوشة واعادة التشكيل

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

عزل وتوصيف المواد الكيميائية من الدهن من البكتيريا سالبة الجرام

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

إعداد خلايا منتسب للتصوير الإسفار الأشعة السينية من قبل التثبيت الكيميائية

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

ترسيب الأبخرة الكيميائية لمغناطيس العضوي، والفاناديوم تيتراسيانويثيلين

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

إعداد التنسيق المسامية العالية البوليمر طلاء البوليمر على ماكروبوروس كتل لتعزيز إثراء Phosphopeptides

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Preparation of Macroporous Epitaxial Quartz Films on Silicon by Chemical Solution Deposition

إعداد ماكروبوروس الفوقي الكوارتز أفلام على السيليكون التي كتبها الكيميائية الحل ترسب

This work describes the detailed protocol for preparing piezoelectric macroporous epitaxial quartz films on silicon(100) substrates. This is a three-step ...

Epitaxial Growth of Perovskite Strontium Titanate on Germanium via Atomic Layer Deposition

الفوقي نمو Perovskite سترونتيوم تيتانات على الجرمانيوم عن طريق ترسب طبقة الذري

Atomic layer deposition (ALD) is a commercially utilized deposition method for electronic materials. ALD growth of thin films offers thickness control and ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

توليف سطحي من المذيلات تشبه دودة من الضوء المرئي وساطة التشتت البلمرة عن طريق Photoredox محفز

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...