Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether-programmet kr-3886/2-1 og SFB-1074 til J.K.; FOR2372 til M.G.)

1. klargøring af PROTAC molekyler
Forsigtig: Se alle relevante sikkerhedsdatablade (MSD'ER) før brug. Flere af de kemikalier, der anvendes i disse synteser er giftige og kræftfremkaldende. Brug venligst alle relevante sikkerhedspraksisser og personlige værnemidler.
<ol><li>Klargøring af tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamat (forbindelse 1)
	<ol>
<li>Tilsæt 1, 1 '-carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) og en katalytisk mængde af 4-(dimethylamin...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li><li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation+by+PROTACs.">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li><li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation.">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li><li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs:+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation.">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).</li><li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

Udformningen af sådanne homo-PROTACs som beskrevet her for CRBN afhænger af pomalidomids specifikke affinitet til CRBN, som er blevet udnyttet med succes i talrige heterobifunktionelle PROTACs og resulterede i udviklingen af PROTAC 8 som en meget selektive CRBN Degrader. Specificiteten af vores molekyle er allerede blevet bekræftet af proteomiske analyser24. For genetisk medieret knockout, udelukkelse og validering af bivirkninger er udfordrende og tidskrævende. Desuden er en ...

De immunomodulatoriske lægemidler (Imid'er) thalidomid og dets analoker, lenalidomid og pomalidomid, som alle er godkendt til behandling af multipelt myelom, binder sig til E3 ubiquitin ubiquitinligase cereblon (CRBN), en substrat adapter til cullin4A-RING E3 ubiquitin ubiquitinligase (CRL4crbn)1,2,3. Binding af imid'er øger affiniteten af CRL4crbn til de lymfoide transkriptionsfaktorer Ikaros (IKZF1) og Aiolos (IKZF3), hvilket fører til deres allestedsnærværende og nedbrydelighed (figur 1)4,5, 6 , 7 , 8. da IKZF1 og IKZF3 er afgørende for multipelt myelomatose celler, deres inaktivering resulterer i væksthæmning. SALL4 blev for nylig fundet som et ekstra imid-induceret neo-substrat af crbn, der sandsynligvis er ansvarlig for den teratogenicitet og den såkaldte contergan-katastrofe i 1950 ' erne forårsaget af thalidomid9,10. I modsætning hertil er Casein kinase 1α (CK1α) et lenalidomid-specifikt substrat af CRBN, som er impliceret i den terapeutiske virkning af myelodysplastisk syndrom med kromosom 5q sletninger11.
Muligheden for små molekyler til at målrette et bestemt protein til nedbrydning er en spændende konsekvens for moderne narkotika udvikling. Mens mekanismen for thalidomid og dets analoter blev opdaget efter deres første anvendelse i mennesker, er såkaldte proteolyse targeting Chimeras (protacs) blevet designet til specifikt at MÅLRETTE et protein af interesse (POI) (figur 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs er heterobifunktionelle molekyler, der består af en specifik ligand for POI forbundet via en linker til en ligand af en E3 ubiquitin ubiquitinligase som crbn eller Von-Hippel-Lindau (vhl)18,19,20, 21,22. PROTACs inducerer dannelsen af et forbigående ternære kompleks, der dirigerer POI til E3 ubiquitin Ligase, hvilket resulterer i dets allestedsnærværende og proteasomale nedbrydning. De største fordele ved PROTACs over konventionelle hæmmere er, at binding til en POI er tilstrækkelig i stedet for dets hæmning, og derfor kan PROTACs potentielt målrette et langt bredere spektrum af proteiner, herunder dem, der blev anset for at være uforruggable som transkriptionsfaktorer15. Derudover virker chimeriske molekyler katalytisk og har derfor en høj potens. Efter ubiquitin overførsel til POI, det ternære kompleks dissocierer og er til rådighed for dannelsen af nye komplekser. Derfor er meget lave PROTAC-koncentrationer tilstrækkelige til nedbrydning af målproteinet23.
Her beskriver vi syntesen af en pomalidomid-pomalidomid konjugeret homo-PROTAC (sammensatte 8), der REKRUTTEREDE crbn til nedbrydning af sig selv24. E3 ubiquitin ubiquitinligase CRBN fungerer både som rekrutteringsmedarbejder og mål på samme tid (figur 3). For at validere vores data syntetiserede vi også en negativ bindings kontrol (sammensatte 9). Vores data bekræfter, at den nyligt syntetiserede homo-PROTAC er specifik for CRBN nedbrydning og har kun minimal effekt på andre proteiner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

De immunmodulerende lægemidler (Imid'er) thalidomid og dets analoter, lenalidomid og pomalidomid, alle FDA-godkendte lægemidler til behandling af multipelt myelom, inducerer allestedsnærværende og nedbrydning af de lymfoide transkriptionsfaktorer Ikaros (IKZF1) og Aiolos (IKZF3) via cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ubiquitinligase for proteasomal nedbrydning. Imid'er er for nylig blevet udnyttet til generering af bifunktionel proteolyse rettet mod kimærer (protacs) til at målrette mod andre proteiner til allestedsnærværende og proteasomal nedbrydning ved crbn E3-Ligase. Vi designede og syntetiserede pomalidomid-baserede homobifunktionelle PROTACs og analyserede deres evne til at inducere selvstyret allestedsnærværende og nedbrydning af CRBN. Her fungerer CRBN både som E3 ubiquitin ubiquitinligase og målet på samme tid. Homo-PROTAC sammensatte 8 nedbryder crbn med en høj potens med kun minimal resterende effekt på IKZF1 og IKZF3. CRBN inaktivering af sammensatte 8 havde ingen effekt på cellelevedygtighed og spredning af forskellige multipelt myelomatose cellelinjer. Denne homo-PROTAC ophæver virkningerne af Imid'er i multipelt myelomatose celler. Derfor kan vores homodikemeje pomalidomid-baserede forbindelser hjælpe med at identificere CRBN ' endogene substrater og fysiologiske funktioner og undersøge den molekylære mekanisme af Imid'er.

Her beskrev vi design, syntese og biologisk evaluering af en homodimert pomalidomid-baseret PROTAC til nedbrydning af CRBN. Vores PROTAC interagerer samtidig med to CRBN-molekyler og danner ternære komplekser, der inducerer selv allestedsnærværende og proteasomal nedbrydning af CRBN med kun minimale resterende virkninger på pomalidomid-inducerede neo-substrater IKZF1 eller IKZF3.
Ud af en serie af tidligere udgivne pomalidom...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Dette arbejde beskriver syntesen og karakteriseringen af en pomalidomid-baseret, bifunktionel homo-PROTAC som en ny metode til at fremkalde allestedsnærværende og nedbrydning af E3 ubiquitin ubiquitinligase cereblon (CRBN), målet for thalidomid analogerne.

Kemisk inaktivering af E3 Ubiquitin Ligase Cereblon ved Pomalidomid-baserede homo-PROTACs

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Vores homodimeriske PROTA'er er de første kemiske hæmmere af Cereblon og kan bidrage til yderligere at belyse thalidomidanalogikernes molekylære mekanisme samt undersøge Cereblons fysiologiske funktion. Denne nye PROTAC platform teknologi kan være meget nyttigt for specifikt at målrette proteiner af interesse, der ellers anses for at være untrackable. CRBN hæmning alene har ingen anti-tumor aktivitet.Men, CRBN degradere kan have kliniske konsekvenser i fedme, smitsomme sygdomme, og andre lidelser. Syntesen er udfordrende, og det er svært at finde optimale linkers og vedhæftet fil til at generere effektive proteinnedseringsstoffer, når man designer en PROTAC-forbindelse. Til at begynde, sted 2,46 gram Boc-beskyttet L-glutamin og 50 milliliter tetrahydrofuran i en 100 milliliter rundbundet kolbe, og rør ved 800 rpm i et minut.Derefter tilsættes 1,95 gram 1, 1'carbonyldiimidazol og en katalytisk mængde 4-pyridin. Fortsæt omrøring i 10 timer ved refluks for at opnå en klar farveløs opløsning af glutarimide sammensatte. Lad opløsningen afkøle til stuetemperatur, og fjern opløsningsmidlet med en roterende fordamper.Reissolve restproduktet i 200 milliliter ethylacetat og hæld det i en separattragt. Vask det organiske lag med 50 milliliter hver af deioniseret vand og saltlage, og tør det organiske lag over natriumsulfat. Tyngdekraften filtrerer opløsningen gennem silicagel for at fjerne tørremidlet, og skyl derefter silicagelen med 200 milliliter ethylacetat.Fjern opløsningsmidlet fra filtratet under vakuum for at opnå Forbindelse 1 som et farveløst fast stof. Tør produktet under vakuum natten over, før det anvendes. Dernæst opløses 0,50 gram natriumacetat i 20 milliliter iseddike i en 100 milliliter rundbundet kolbe udstyret med en røre bar.Tilsæt 1,25 gram 3-fluorophthalic anhydrid og 1,14 gram glutarimide og rør ved refluks i seks timer for at opnå en lilla opløsning af forbindelse 3. Lad blandingen afkøle til stuetemperatur, og hæld den derefter i 100 milliliter deioniseret vand og omrøres i 10 minutter for at udfælde forbindelse 3. Opsaml det faste stof ved filtrering, vask det med vand og olieet ether, og tør det under vakuum i to dage.Dernæst skal der anbringes 0,83 gram sammensatte tre og 20 milliliter tør dimethylsulfoxid i en 50 milliliter Schlenk-kolbe og omrøres i to minutter. Tilsæt 0,22 gram alfa omega diamin linker Sammensatte 6, og 1,05 milliliter N, N-diisopropylethylamin og rør blandingen under argon ved 90 grader celsius i 18 timer for at opnå Homodimer 8 i en mørkegrøn blanding. Lad blandingen afkøle til stuetemperatur og hæld den i 100 milliliter deioniseret vand.Produktet udvindes i tre 50 milliliter portioner ethylacetat, kombiner de organiske lag og vask dem med 50 milliliter hver af vand og saltlage. Tør det vaskede organiske lag over natriumsulfat, bortfiltrer tørremidlet og fjern opløsningsmidlet under vakuum. Gensolive restproduktet i en minimal mængde kromatografi opløsningsmiddel og gælder for en silica gel kolonne til rensning.Opsaml fluorescerende produktfraktioner, kombiner dem, og fjern opløsningsmidlet for at opnå Homodimer 8 som et gult fast stof. Til at begynde, opløses 2,28 gram glutarimid 1 i 25 milliliter dimethylformamid i en 100 milliliter rundbundet kolbe. Suspendere 2,76 gram sleben kaliumcarbonat i denne opløsning.Derefter trækkes 0,62 milliliter iodomethan ind i en sprøjte udstyret med en 20-gauge nål. Tilsæt iodomethan drop-wise i løbet af 10 sekunder. Kolben afpropper med en gummiskvæg, og der tilsættes en udluftningsnål.Sonikere blandingen i to timer ved stuetemperatur for at opnå glutarimide forbindelse 2. Blandingen fortyndes med 50 milliliter ethylacetat og hæld den i en separattragt. Kolben skylles ind i tragten med yderligere 50 milliliter ethylacetat.Arbejd op produktet og rense det med silica gel kolonne kromatografi for at opnå glutarimide 2 som en farveløs fast stof. Sammenlign retentionstider for glutarimidforbindelser 1 og 2 for at bekræfte, at N-methylering var vellykket. For at begynde valideringen, behandle myelomatose celler med forbindelser af interesse.Isoler de relevante proteiner, og forbered prøver til en Western Blot analyse af protein nedbrydning. Derefter forberede en gel sandwich til SDS-PAGE og fylde anode buffer tank med en pH 8,9 tris-HCl løsning. Læg proteinprøverne i gelen og kør den ved 70 Volt i 20 minutter efterfulgt af 115 volt i 150 minutter.Dernæst forberede 1x overførsel buffer til immunoblotting og forsigtigt flytte gelen fra sin kassette til overførslen buffer til ligevægt. Du skal være meget forsigtig, når du fjerner gelen fra kassetten for ækvilibrering, fordi det kan briste og krølle meget hurtigt. Nedsænk en 0,45 mikrometer polyvinylidene difluoridmembran i ren methanol i mindst 20 sekunder for at aktivere den, og derefter nedsænkes den i 1x overførselsbuffer.Lad gelen og membranen ligevægte i 10 minutter. Derefter samles den vestlige Blotting kassette og anvende 180 milliampere i 90 minutter for at overføre proteiner til membranen. Bagefter visualiseres proteinerne ved immunstaining.For at vurdere virkningerne på cellernes levedygtighed, først, frø 50, 000 myelomatose celler pr brønd af en 96 godt plade i biologisk tre eksemplarer. Tilføj til hver brønd 100 mikroliter af medier, der indeholder DMSO, eller en 0,1, en eller 10 mikromolar af Sammensatte 8, Compound 9, eller pomalidomid. For at udføre celle levedygtighed redning eksperiment, i stedet behandle cellerne med en 100 nanomolar opløsning af Sammensatte 8 i tre timer, enten før eller efter at tilføje en en mikromolar opløsning af pomalidomid.Inkuber cellerne i 24, 48 eller 96 timer ved 37 grader celsius i en 5% kuldioxidatmosfære, og mål celle levedygtighed med en selvlysende assay. Strukturen af homodimerisk PROTAC 8 blev bekræftet med proton og kulstof NMR. Heterodimeric PROTAC 9 blev syntetiseret som en negativ kontrol, da N-methylering i glutarimiddelen resulterer i tab af Cereblon eller CRBN, bindende evne.Homo PROTAC 8 induceret næsten komplet proteosom crbn nedbrydning med minimale virkninger på lymfoide transskription faktorer IKZF1 og IKZF3. I modsætning hertil viste hetero PROTAC 9 adfærd svarende til pomalidomides. Sammensatte 8 induceret CRBN nedbrydning kan blokeres af en direkte hæmmer af proteasomet eller indirekte blokeret ved netyleringshæmning.Celler forbehandlet med Compound 8 modstod i væsentlig grad virkningerne af pomalidomid på IKZF1 og IKZF3. Sammensatte 8 induceret CRBN nedbrydning havde langt mindre effekt på myelomatose celle levedygtighed efter 96 timer end IKZF1 og IKZF3 nedbrydning fra Compound 9 og pomalidomid gjorde. Myelomatoseceller, der blev forbehandlet med stof 8, havde signifikant større levedygtighed, når de blev eksponeret for pomalidomid end ubehandlede celler, hvilket tyder på, at stof 8 kunne anvendes til at efterligne immunmodulerende IMiD-lægemiddelresistens.Vi fandt, at Compound 8 inducerer fuldstændig proteasomal nedbrydning af Cereblon, har ingen bivirkninger på IKZF1 og IKZF3 celle levedygtighed og spredning. En udvidelse af projektteknologien til andre mål har potentiale til at inaktivere og spore proteiner relateret til kræft og andre sygdomme. Når man tilpasser denne teknik til andre lægemidler og proteiner, bør man omhyggeligt undersøge de molekylære strukturer af lægemidlet og protein målet for at vælge de optimale linkers og vedhæftede filer.IMiD'erne vil ikke fungere i mus på grund af en punktmutation i Cereblon, men der findes en transgen musemodel, som kan bruges til yderligere dyreforsøg. Da pomalidomid er en analog thalidomid, som er meget teratogene, anbefaler vi ikke gravide kvinder, der arbejder med disse lægemidler.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami Inspireret Selvsamling af mønstret og omkonfigurerbare Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolering og kemisk karakterisering af lipid A fra gramnegative bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forberedelse vedhæftende celler for X-ray fluorescens Imaging af Chemical Fiksering

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Kemisk Vapor Deposition af en organisk Magnet, Vanadium tetracyanoethylen

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Udarbejdelse af meget porøse Koordinering Polymer Belægninger på Makroporøse Polymer Monoliths for styrkede Berigelse af phosphopeptider

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Preparation of Macroporous Epitaxial Quartz Films on Silicon by Chemical Solution Deposition

Udarbejdelse af Makroporøse Epitaksial Quartz Film på silicium af kemisk opløsning Deposition

This work describes the detailed protocol for preparing piezoelectric macroporous epitaxial quartz films on silicon(100) substrates. This is a three-step ...

Epitaxial Growth of Perovskite Strontium Titanate on Germanium via Atomic Layer Deposition

Epitaksial dyrkning af Perovskite strontiumtitanat på Germanium via Atomic Layer Deposition

Atomic layer deposition (ALD) is a commercially utilized deposition method for electronic materials. ALD growth of thin films offers thickness control and ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Syntese af ormelignende Miceller af synligt lys Mediated Dispersion polymerisering Brug Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...