Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether programma KR-3886/2-1 en SFB-1074 tot J.K.; FOR2372 naar M.G.)

1. bereiding van PROTAC moleculen
Let op: Raadpleeg voor gebruik alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSD'S). Een aantal van de chemicaliën die in deze syntheses worden gebruikt, zijn giftig en kankerverwekkend. Gebruik alstublieft alle geschikte veiligheidspraktijken en persoonlijke beschermingsmiddelen.
<ol><li>Bereiding van tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamaat (samenstelling 1)
	<ol>
<li>Voeg 1, 1 '-carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol)...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li><li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation+by+PROTACs.">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li><li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation.">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li><li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs:+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation.">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).</li><li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

Het ontwerp van dergelijke homo-Protac's zoals hier beschreven voor CRBN is gebaseerd op de specifieke affiniteit van pomalidomide aan CRBN, die met succes is gebruikt in talrijke heterobifunctionele Protac's en resulteerde in de ontwikkeling van PROTAC 8 als een zeer selectieve CRBN-Degrader. De specificiteit van ons molecuul is al bevestigd door Proteomic analysen24. Voor genetisch gemedieerde knock-out, uitsluiting en validatie van bijwerkingen is uitdagend en tijdrovend. Boven...

De immunomodulerende geneesmiddelen (IMiDs) thalidomide en zijn analogen, lenalidomide en pomalidomide, allemaal goedgekeurd voor de behandeling van multipel myeloom, binden aan de E3 ubiquitine ligase cereblon (CRBN), een substraat adapter voor cullin4A-RING E3 ubiquitine ligase (CRL4crbn)1,2,3. Binding van imids verbetert de affiniteit van CRL4crbn voor de lymfoïde transcriptiefactoren Ikaros (IKZF1) en Aiolos (IKZF3), leidend tot hun alomtegenwoordige en afbraak (Figuur 1)4,5, 6 , 7 , 8. Aangezien IKZF1 en IKZF3 essentieel zijn voor multipel myeloomcellen, resulteert hun inactivatie in groeiremming. SALL4 werd onlangs gevonden als een extra imid-geïnduceerde Neo-substraat van crbn die waarschijnlijk verantwoordelijk is voor de teratogeniciteit en de zogenaamde contergan catastrofe in de jaren 1950 veroorzaakt door thalidomide9,10. Caseïne kinase 1α (CK1α) is daarentegen een lenalidomide-specifiek substraat van CRBN dat betrokken is bij het therapeutische effect in myelodysplastisch syndroom met chromosoom 5q deleties11.
Het vermogen van kleine moleculen om een specifiek eiwit voor afbraak te targeten, is een spannende implicatie voor de moderne Geneesmiddelenontwikkeling. Hoewel het mechanisme van thalidomide en zijn analogen werd ontdekt na hun eerste gebruik bij de mens, werden zogenaamde PRoteolyse targeting Chimeras (protac's) ontworpen om specifiek te richten op een eiwit van belang (POI) (figuur 2)12,13,14,15,16,17,18. Protac's zijn heterobifunctionele moleculen die bestaan uit een specifieke ligand voor de POI verbonden via een linker aan een ligand van een E3 ubiquitine ligase zoals crbn of von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Protacs induceren de vorming van een voorbijgaande ternaire complex, dat de POI naar de E3 ubiquitine ligase leidt, resulterend in de alomtegenwoordige en proteasomale afbraak. De belangrijkste voordelen van Protac's ten opzichte van conventionele remmers is dat de binding aan een POI voldoende is in plaats van de remming ervan en daarom kunnen Protac's zich mogelijk richten op een veel breder spectrum van eiwitten, waaronder die welke als niet-Versleep baar werden beschouwd, zoals transcriptiefactoren15. Bovendien, chimerische moleculen handelen katalytisch en hebben daarom een hoge potentie. Na ubiquitine Transfer naar de POI, de ternaire complex dissocieert en is beschikbaar voor de vorming van nieuwe complexen. Zo zijn zeer lage PROTAC concentraties voldoende voor de afbraak van het doelwit eiwit23.
Hier beschrijven we de synthese van een geconjugeerde homo-PROTAC (compound 8) van pomalidomide-pomalidomide, die crbn aanwervent voor de afbraak van zichzelf24. De E3 ubiquitine ligase CRBN fungeert als zowel de recruiter en het doelwit op hetzelfde moment (Figuur 3). Om onze gegevens te valideren, hebben we ook een negatieve binding Control gesynthetiseerd (compound 9). Onze gegevens bevestigen dat de nieuw gesynthetiseerde homo-PROTAC specifiek is voor CRBN-degradatie en slechts minimale effecten heeft op andere eiwitten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

De immunomodulerende geneesmiddelen (IMiDs) thalidomide en zijn analogen, lenalidomide en pomalidomide, alle door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen voor de behandeling van multipel myeloom, induceren alomtegenwoordig en afbraak van de lymfoïde transcriptiefactoren Ikaros (IKZF1) en Aiolos (IKZF3) via de cereblon (CRBN) E3 ubiquitine ligase voor proteasomale afbraak. IMiDs zijn recentelijk gebruikt voor het genereren van bifunctionele proteolyse gericht op chimeras (Protac's) om andere eiwitten op te richten voor alomtegenwoordige en proteasomale afbraak door de CRBN E3 ligase. We ontwierpen en synthetiseerden homobifunctionele Protac's op basis van pomalidomide en analyseerden hun vermogen om zelfgeleide alomtegenwoordige en afbraak van CRBN te induceren. Hier fungeert CRBN als beide, de E3 ubiquitine ligase en het doelwit op hetzelfde moment. De homo-PROTAC compound 8 DEGRADEERT crbn met een hoge potentie met slechts minimale resterende effecten op IKZF1 en IKZF3. CRBN inactivatie door compound 8 had geen effect op de levensvatbaarheid van de cel en de proliferatie van verschillende multipel myeloom cellijnen. Deze homo-PROTAC abrogates de effecten van IMiDs in multipel myeloomcellen. Daarom kunnen onze homodimere pomalidomide-gebaseerde verbindingen helpen om de endogene substraten en fysiologische functies van CRBN te identificeren en het moleculaire mechanisme van IMiDs te onderzoeken.

Hier beschrijven we het ontwerp, de synthese en de biologische evaluatie van een homodimere pomalidomide gebaseerde PROTAC voor de afbraak van CRBN. Onze protac communiceert gelijktijdig met twee crbn-moleculen en vormt ternaire-complexen die zelf-alomtegenwoordige en proteasomale afbraak van crbn induceren met slechts minimale resterende effecten op pomalidomide-geïnduceerde Neo-substraten IKZF1 of IKZF3.
Uit een reeks eerder ...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Dit werk beschrijft de synthese en karakterisering van een op pomalidomide gebaseerde, bifunctionele homo-PROTAC als een nieuwe benadering voor het induceren van alomtegenwoordige en afbraak van de E3 ubiquitine ligase cereblon (CRBN), het doelwit van thalidomide analogen.

Chemische inactivatie van de E3 Ubiquitin ligase Cereblon door Pomalidomide-based homo-PROTACs

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Onze homodimeric PROTACs zijn de eerste chemische remmers van Cereblon en kunnen helpen om het moleculaire mechanisme van thalidomide analogen verder te verduidelijken, evenals om de fysiologische functie van Cereblon te onderzoeken. Deze nieuwe PROTAC-platformtechnologie kan zeer nuttig zijn voor het specifiek targeten van proteïnen die anders als ontraceerbaar worden beschouwd. CRBN remming alleen heeft geen anti-tumor activiteit.CRBN-degraders kunnen echter klinische implicaties hebben bij obesitas, infectieziekten en andere aandoeningen. De synthese is uitdagend en het is moeilijk om optimale linkers en gehechtheid te vinden om effectieve eiwitdegraders te genereren bij het ontwerpen van een PROTAC-verbinding. Om te beginnen, plaats 2,46 gram Boc-beschermde L-glutamine en 50 milliliter tetrahydrofuran in een 100 milliliter ronde bodem kolf, en roer op 800 rpm gedurende een minuut.Voeg vervolgens 1,95 gram 1, 1'carbonyldiimidazol en een katalytische hoeveelheid 4-pyridine toe. Blijf 10 uur roeren bij reflux om een duidelijke kleurloze oplossing van glutarimide compound te verkrijgen. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en verwijder het oplosmiddel met een roterende verdamper.Red het residu in 200 milliliter ethylacetaat en giet het in een separatory trechter. Was de organische laag met 50 milliliter elk van gedeïoniseerd water en pekel, en droog de organische laag over natriumsulfaat. Zwaartekracht filtert de oplossing door silicagel om de droogmiddel te verwijderen en spoel vervolgens de silicagel af met 200 milliliter ethylacetaat.Verwijder het oplosmiddel uit het filtraat onder vacuüm om Compound 1 als kleurloze vaste stof te verkrijgen. Droog het product 's nachts onder vacuüm voordat u het gebruikt. Los vervolgens 0,50 gram natriumacetaat op in 20 milliliter glaciale azijnzuur in een kolf met ronde bodem van 100 milliliter, uitgerust met een roerstaaf.Voeg 1,25 gram 3-fluoroftale anhydride en 1,14 gram glutarimide toe en roer zes uur lang bij reflux om een paarse oplossing van Compound 3 te verkrijgen. Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur, en giet het in 100 milliliter gedeïoniseerd water en roer gedurende 10 minuten om compound 3 neer te storten. Verzamel de vaste stof door filtratie, was het met water en petroleum ether, en droog het onder vacuüm voor twee dagen.Plaats vervolgens 0,83 gram compound drie en 20 milliliter droge dimethylsulfoxide in een 50 milliliter Schlenk-kolf en roer gedurende twee minuten. Voeg 0,22 gram alfa omega diamine linker Compound 6 en 1,05 milliliter N, N-diisopropylethylamine toe en roer het mengsel onder argon gedurende 18 uur onder argon op 90 graden Celsius om Homodimer 8 in een donkergroen mengsel te verkrijgen. Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur en giet het in 100 milliliter gedeïoniseerd water.Haal het product in drie porties ethylacetaat van 50 milliliter, combineer de organische lagen en was ze met 50 milliliter water en pekel. Droog de gewassen organische laag over natriumsulfaat, filter de drooggebak en verwijder het oplosmiddel onder vacuüm. Redissolve het residu in een minimale hoeveelheid chromatografie oplosmiddel en van toepassing op een silica gel kolom voor zuivering.Verzamel de fluorescerende productfracties, combineer ze en verwijder het oplosmiddel om Homodimer 8 als gele vaste stof te verkrijgen. Los om te beginnen 2,28 gram Glutarimide 1 op 25 milliliter dimethylformamide op in een kolf van 100 milliliter. Schorst 2,76 gram gemalen kaliumcarbonaat in deze oplossing.Trek vervolgens 0,62 milliliter iodomethaan in een spuit uitgerust met een naald van 20 meter. Voeg de iodomethaan drop-wise in de loop van 10 seconden. Stop de kolf met een rubberen septum, en voeg een vent naald.Soniceer het mengsel gedurende twee uur bij kamertemperatuur om Glutarimide Compound 2 te verkrijgen. Verdun het mengsel met 50 milliliter ethylacetaat en giet het in een separatoire trechter. Spoel de kolf in de trechter met nog eens 50 milliliter ethylacetaat.Werk het product en zuiver het met silica gel kolomchromatografie om Glutarimide 2 te verkrijgen als een kleurloze vaste stof. Vergelijk de bewaartijden van Glutarimide Compounds 1 en 2 om te bevestigen dat N-methylatie succesvol was. Behandel om te beginnen met de validatie, behandel meerdere myeloomcellen met de verbindingen van belang.Isoleer de relevante eiwitten en bereid monsters voor op een westerse Blot-analyse van eiwitdegradatie. Bereid vervolgens een gelsandwich voor SDS-PAGE en vul de anodebuffertank met een pH 8.9 tris-HCl-oplossing. Laad de eiwitmonsters in de gel en voer het op 70 Volt gedurende 20 minuten, gevolgd door 115 volt gedurende 150 minuten.Bereid vervolgens 1x transferbuffer voor immunoblotting en verplaats de gel voorzichtig van de cassette naar de overdrachtsbuffer om te equiliberen. Je moet heel voorzichtig zijn wanneer u de gel uit de cassette verwijdert voor evenwicht, omdat deze zeer snel kan barsten en kreuken. Dompel een 0,45 micrometer polyvinylidene difluoride membraan in pure methanol voor ten minste 20 seconden om het te activeren, en vervolgens onder te dompelen in 1x overdracht buffer.Laat de gel en het membraan gedurende 10 minuten in evenwicht zijn. Monteer vervolgens de Western Blotting cassette en breng 180 milliamperes gedurende 90 minuten aan om de eiwitten op het membraan over te brengen. Visualiseer daarna de eiwitten door immunostaining.Om de effecten op de levensvatbaarheid van de cel te evalueren, eerste, zaad 50.000 multipel myeloom cellen per put van een 96 goed plaat in biologisch drievoud. Voeg aan elke bron 100 microliter media toe die DMSO bevatten, of een 0.1, een of 10 micromolar van Compound 8, Compound 9 of pomalidomide. Om cel levensvatbaarheid te redden experiment uit te voeren, in plaats daarvan behandelen de cellen met een 100 nanomolar oplossing van Compound 8 gedurende drie uur, hetzij voor of na het toevoegen van een een micromolar oplossing van pomalidomide.Incubeer de cellen voor 24, 48, of 96 uur bij 37 graden celsius in een 5%koolstofdioxideatmosfeer, en meet de levensvatbaarheid van de cel met een luminescente test. De structuur van homodimeric PROTAC 8 werd bevestigd met proton en koolstof NMR. Heterodimeric PROTAC 9 werd gesynthetiseerd als een negatieve controle, als N-methylatie binnen de glutarimide gedeelte resulteert in een verlies van Cereblon, of CRBN, bindende vermogen.De homo PROTAC 8 veroorzaakte bijna volledige proteosomale CRBN-afbraak met minimale effecten op de lymfoïde transcriptiefactoren IKZF1 en IKZF3. In tegenstelling, de hetero PROTAC 9 vertoonde gedrag vergelijkbaar met pomalidomides. Samengestelde 8 geïnduceerde CRBN-afbraak kan worden geblokkeerd door een directe remmer van het proteasoom, of indirect geblokkeerd door netylation-remming.Cellen die vooraf werden behandeld met Compound 8 verzetten zich aanzienlijk tegen de effecten van pomalidomide op IKZF1 en IKZF3. Compound 8 geïnduceerde CRBN afbraak had veel minder van een effect op multipel myeloom cel levensvatbaarheid na 96 uur dan de IKZF1 en IKZF3 afbraak van Compound 9 en pomalidomide deed. Meerdere myeloomcellen die vooraf werden behandeld met Compound 8 hadden een aanzienlijk grotere levensvatbaarheid wanneer ze werden blootgesteld aan pomalidomide dan onbehandelde cellen, wat suggereert dat Compound 8 kan worden gebruikt om immunomodulatorische IMiD-resistentie na te bootsen.We vonden dat Compound 8 volledige proteasomale afbraak van Cereblon induceert, geen bijwerkingen heeft op IKZF1 en IKZF3 cel levensvatbaarheid en proliferatie. De uitbreiding van de projecttechnologie naar andere doelen heeft het potentieel voor het inactiveren en volgen van eiwitten die verband houden met kanker en andere ziekten. Bij het aanpassen van deze techniek voor andere geneesmiddelen en eiwitten, moet men zorgvuldig onderzoeken van de moleculaire structuren van het geneesmiddel en het eiwit doel om de optimale linkers en bijlagen te kiezen.De IMiDs werken niet bij muizen vanwege een puntmutatie in Cereblon, maar er bestaat een transgene knock-in muismodel dat kan worden gebruikt voor verdere dierstudies. Aangezien pomalidomide een analoge thalidomide is, die zeer teratatogeen is, raden we zwangere vrouwen die met deze geneesmiddelen werken niet aan.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami Inspired Zelf-assemblage van Patterned en Herconfigureerbare Deeltjes

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolatie en chemische karakterisering van Lipid A van Gram-negatieve bacteriën

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Chemical Vapor Deposition van een organische Magnet, Vanadium tetracyanoethyleen

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Voorbereiding van de zeer poreuze Coordination Polymer Coatings op Macroporeuze Polymer Monoliths voor Enhanced Verrijking van fosfopeptiden

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Preparation of Macroporous Epitaxial Quartz Films on Silicon by Chemical Solution Deposition

Voorbereiding van Macroporeuze Epitaxiale Quartz Films on Silicon door chemische oplossing Deposition

This work describes the detailed protocol for preparing piezoelectric macroporous epitaxial quartz films on silicon(100) substrates. This is a three-step ...

Epitaxial Growth of Perovskite Strontium Titanate on Germanium via Atomic Layer Deposition

Epitaxiaal Groei van Perovskite Strontiumtitanaat op Germanium via Atomic Layer Deposition

Atomic layer deposition (ALD) is a commercially utilized deposition method for electronic materials. ALD growth of thin films offers thickness control and ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Synthese van Worm-micellen door het zichtbare licht Mediated Dispersion polymerisatie onder toepassing van Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...