Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 und SFB-1074 to J.K.; FOR2372 zu M.G.)

1. Herstellung von PROTAC-Molekülen
VORSICHT: Bitte beachten Sie vor der Verwendung alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Mehrere der in diesen Synthesen verwendeten Chemikalien sind giftig und krebserregend. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken und persönliche Schutzausrüstung.
<ol><li>Zubereitung von tert-butyl N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)carbam (Verbindung 1)
	<ol>
<li>1,1'-Carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) und eine kata...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

Das Design solcher homo-PROTACs, wie hier für CRBN beschrieben, beruht auf der spezifischen Affinität von Pomalidomid zu CRBN, die in zahlreichen heterobifunktionellen PROTACs erfolgreich eingesetzt wurde und zur Entwicklung von PROTAC 8 als hochgradig selektiven CRBN-Degrader. Die Spezifität unseres Moleküls wurde bereits durch proteomische Analysen bestätigt24. Für genetisch vermittelten Knockout ist der Ausschluss und die Validierung von Nebenwirkungen eine Herausforderun...

Die immunmodulatorischen Medikamente (IMiDs) Thalidomid und seine Analoga, Lenalidomid und Pomalidomid, alle für die Behandlung von multiplem Myelom zugelassen, binden an die E3 Ubiquitin Ligase Cereblon (CRBN), ein Substratadapter für cullin4A-RING E3 Ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. Die Bindung von IMiDs erhöht die Affinität von CRL4CRBN zu den lymphoiden Transkriptionsfaktoren Ikaros (IKZF1) und Aiolos (IKZF3), was zu ihrer Ubiquitination und Degradation führt (Abbildung 1)4,5, 6 , 7 , 8. Da IKZF1 und IKZF3 für mehrere Myelomzellen unerlässlich sind, führt ihre Inaktivierung zu einer Wachstumshemmung. SALL4 wurde vor kurzem als zusätzliches IMiD-induziertes Neosubstrat von CRBN gefunden, das wahrscheinlich für die Teratogenität und die sogenannte Contergan-Katastrophe in den 1950er Jahren verantwortlich ist, die durch Thalidomid9,10verursacht wurde. Im Gegensatz dazu ist Caseinkinase 1 (CK1) ein Lenalidomid-spezifisches Substrat von CRBN, das in die therapeutische Wirkung beim myelodysplastischen Syndrom mit Chromosom 5q Deletionen11verwickelt ist.
Die Fähigkeit von Kleinmolekülen, ein bestimmtes Protein für den Abbau zu zielen, ist eine spannende Implikation für die moderne Arzneimittelentwicklung. Während der Mechanismus von Thalidomid und seinen Analoga nach ihrer ersten Anwendung beim Menschen entdeckt wurde, wurden so genannte Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) speziell für ein Protein von Interesse (POI) entwickelt (Abbildung 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs sind heterobifunktionelle Moleküle, die aus einem spezifischen Liganden für den POI bestehen, der über einen Linker mit einem Liganden einer E3-Ubiquitinligase wie CRBN oder von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20verbunden ist. 21,22. PROTACs induzieren die Bildung eines transienten ternären Komplexes, der das POI auf die E3-Ubiquitinligase lenkt, was zu seiner Ubiquitination und proteasomalen Degradierung führt. Der Hauptvorteil von PROTACs gegenüber herkömmlichen Inhibitoren besteht darin, dass die Bindung an ein POI ausreichend ist und nicht seine Hemmung, und daher können PROTACs potenziell auf ein weit breiteres Spektrum von Proteinen abzielen, einschließlich derer, die als undruggable wie Transkriptionsfaktoren15. Darüber hinaus wirken chimäre Moleküle katalytisch und haben daher eine hohe Potenz. Nach der Ubiquitin-Übertragung in die POI löst sich der ternäre Komplex und steht für die Bildung neuer Komplexe zur Verfügung. Somit reichen sehr niedrige PROTAC-Konzentrationen für den Abbau des Zielproteins23aus.
Hier beschreiben wir die Synthese eines Pomalidomid-Pomalidomid konjugierten homo-PROTAC (Verbindung 8), das CRBN für die Degradierung von sich selbst rekrutiert24. Die E3 ubiquitin ligase CRBN dient sowohl als Recruiter als auch als Ziel zugleich (Abbildung 3). Um unsere Daten zu validieren, synthetisierten wir auch eine negative Bindungskontrolle (Verbindung 9). Unsere Daten bestätigen, dass der neu synthetisierte Homo-PROTAC spezifisch für den CRBN-Abbau ist und nur minimale Auswirkungen auf andere Proteine hat.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

Die immunmodulatorischen Medikamente (IMiDs) Thalidomid und seine Analoga, Lenalidomid und Pomalidomid, alle von der FDA zugelassenen Medikamente zur Behandlung von multiplem Myelom, induzieren Die Ubiquitination und den Abbau der lymphoiden Transkriptionsfaktoren Ikaros (IKZF1) und Aiolos (IKZF3) über den Cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ligase für den proteasomalen Abbau. IMiDs wurden vor kurzem für die Erzeugung von bifunktionaler Proteolyse verwendet, die auf Chimären (PROTACs) abzielt, um andere Proteine zur Ubiquitination und proteasomalen Degradation durch die CRBN E3 Ligase zu zielen. Wir haben pomalidomidbasierte homobifunktionelle PROTACs entwickelt und synthetisiert und ihre Fähigkeit analysiert, eine selbstgesteuerte Ubiquitination und Abbau von CRBN zu induzieren. Hier dient CRBN als beides, die E3-Ubiquitinligase und das Ziel zugleich. Die homo-PROTAC Verbindung 8 degradiert CRBN mit einer hohen Potenz mit nur minimalen verbleibenden Effekten auf IKZF1 und IKZF3. Die CRBN-Inaktivierung durch Verbindung 8 hatte keinen Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit und proliferation verschiedener multipler Myelom-Zelllinien. Dieser Homo-PROTAC hebt die Wirkung von IMiDs in mehreren Myelomzellen auf. Daher können unsere homodimeren Pomalidomid-basierten Verbindungen helfen, die endogene Substrate und physiologischen Funktionen von CRBN zu identifizieren und den molekularen Mechanismus von IMiDs zu untersuchen.

Hier beschrieben wir das Design, die Synthese und die biologische Bewertung eines homodimer pomalidomidbasierten PROTAC zur Degradation von CRBN. Unser PROTAC interagiert gleichzeitig mit zwei CRBN-Molekülen und bildet ternäre Komplexe, die selbstallgegenwärtige und proteasomale Abbau von CRBN mit nur minimalen verbleibenden Effekten auf pomalidomid-induzierte Neosubstrate IKZF1 oder IKZF3 induzieren.
Aus einer Reihe von zuvo...

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Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Diese Arbeit beschreibt die Synthese und Charakterisierung eines pomalidomidbasierten, bifunktionellen Homo-PROTAC als einen neuartigen Ansatz zur Induzieren von Ubiquitination und Abbau des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon (CRBN), dem Ziel von Thalidomid-Analogen.

Chemische Inaktivierung des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon durch Pomalidomid-basierte Homo-PROTACs

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Unsere homodimerischen PROTACs sind die ersten chemischen Inhibitoren von Cereblon und können dazu beitragen, den molekularen Mechanismus von Thalidomid-Analogen weiter aufzuklären und die physiologische Funktion von Cereblon zu untersuchen. Diese neue PROTAC-Plattformtechnologie kann sehr hilfreich sein, um gezielt auf Proteine von Interesse zu zielen, die ansonsten als unnachtastbar angesehen werden. CRBN-Hemmung allein hat keine Anti-Tumor-Aktivität.CRBN-Degrader können jedoch klinische Auswirkungen auf Fettleibigkeit, Infektionskrankheiten und andere Erkrankungen haben. Die Synthese ist anspruchsvoll und es ist schwierig, optimale Linker und Anhaftung zu finden, um effektive Protein-Degrader zu erzeugen, wenn eine PROTAC-Verbindung entwirft. Zu Beginn 2,46 Gramm Boc-geschütztes L-Glutamin und 50 Milliliter Tetrahydrofuran in einen 100-Milliliter-Rundkolben geben und eine Minute lang bei 800 U/min rühren.Fügen Sie dann 1,95 Gramm 1,1'carbonyldiimidazol und eine katalytische Menge an 4-Pyridin hinzu. Weiter rühren für 10 Stunden bei Reflux, um eine klare farblose Lösung der Glutarimid-Verbindung zu erhalten. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer.Lösen Sie den Rückstand in 200 Milliliter Ethylacetat auf und gießen Sie ihn in einen Trenntrichter. Waschen Sie die organische Schicht mit je 50 Millilitern entionisiertem Wasser und Salzlake und trocknen Sie die organische Schicht über Natriumsulfat. Schwerkraft filteren die Lösung durch Kieselgel, um das Delikatessen zu entfernen, und spülen Dann das Kieselgel mit 200 Milliliter Ethylacetat ab.Entfernen Sie das Lösungsmittel aus dem Filtrat unter Vakuum, um Compound 1 als farblosen Festkörper zu erhalten. Trocknen Sie das Produkt über Nacht unter Vakuum, bevor Sie es verwenden. Als nächstes lösen Sie 0,50 Gramm Natriumacetat in 20 Milliliter Eisessigsäure in einem 100 Milliliter Rundkolben mit Rührstab.Fügen Sie 1,25 Gramm 3-Fluorophthalsäure-Anhydrid und 1,14 Gramm Glutarimid und rühren bei Reflux für sechs Stunden, um eine lila Lösung von Compound 3 zu erhalten. Lassen Sie die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen, und gießen Sie sie dann in 100 Milliliter entionisiertes Wasser und rühren Sie für 10 Minuten, um Compound 3 auszustoßen. Sammeln Sie den Feststoff durch Filtration, waschen Sie ihn mit Wasser und Erdölether und trocknen Sie ihn zwei Tage lang unter Vakuum.Als nächstes 0,83 Gramm Compound Drei und 20 Milliliter trockenes Dimethylsulfoxid in einen 50-Milliliter-Schlenkkolben geben und zwei Minuten rühren. Fügen Sie 0,22 Gramm Alpha-Omega-Diamin-Linker Compound 6 und 1,05 Milliliter N, N-Diisopropylethylamin und rühren Sie die Mischung unter Argon bei 90 Grad Celsius für 18 Stunden, um Homodimer 8 in einer dunkelgrünen Mischung zu erhalten. Lassen Sie die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen und in 100 Milliliter entionisiertes Wasser gießen.Extrahieren Sie das Produkt in drei 50-Milliliter-Portionen Ethylacetat, kombinieren Sie die organischen Schichten und waschen Sie sie mit 50 Millilitern Wasser und Sole. Trocknen Sie die gewaschene organische Schicht über Natriumsulfat, filtern Sie das Trockenmittel heraus und entfernen Sie das Lösungsmittel unter Vakuum. Lösen Sie den Rückstand in einer minimalen Menge chromatographischen Lösungsmittels auf und tragen Sie ihn zur Reinigung auf eine Kieselgelsäule auf.Sammeln Sie die fluoreszierenden Produktfraktionen, kombinieren Sie sie und entfernen Sie das Lösungsmittel, um Homodimer 8 als gelben Feststoff zu erhalten. Zu Beginn 2,28 Gramm Glutarimid 1 in 25 Milliliter Dimethylformamid in einem 100 Milliliter Rundkolben auflösen. 2,76 Gramm gemahlenes Kaliumcarbonat in dieser Lösung aussetzen.Ziehen Sie dann 0,62 Milliliter Jodomeme in eine Spritze, die mit einer 20-Spur-Nadel ausgestattet ist. Fügen Sie das Jodometropfen im Laufe von 10 Sekunden hinzu. Stoppen Sie den Kolben mit einem Gummiseptum, und fügen Sie eine Entlüftungsnadel hinzu.Beschallen Sie die Mischung für zwei Stunden bei Raumtemperatur, um Glutarimid-Compound 2 zu erhalten. Die Mischung mit 50 MilliliterEthylacetat verdünnen und in einen Trenntrichter gießen. Spülen Sie den Kolben mit weiteren 50 MilliliterEthylacetat in den Trichter.Arbeiten Sie das Produkt auf und reinigen Sie es mit Kieselgel-Säulenchromatographie, um Glutarimid 2 als farblosen Festkörper zu erhalten. Vergleichen Sie die Retentionszeiten der Glutarimidverbindungen 1 und 2, um zu bestätigen, dass die N-Methylierung erfolgreich war. Um mit der Validierung zu beginnen, behandeln Sie mehrere Myelomzellen mit den von Interesse.Isolieren Sie die relevanten Proteine und bereiten Sie Proben für eine Western Blot-Analyse des Proteinabbaus vor. Dann bereiten Sie ein Gel-Sandwich für SDS-PAGE vor und füllen Sie den Anodenpuffertank mit einer pH 8,9 Tris-HCl-Lösung. Die Proteinproben in das Gel laden und 20 Minuten lang bei 70 Volt laufen lassen, gefolgt von 115 Volt für 150 Minuten.Als nächstes bereiten Sie 1x Transferpuffer für immunoblotting vor und bewegen Sie das Gel vorsichtig von seiner Kassette in den Transferpuffer, um es auszugleichen. Sie müssen sehr vorsichtig sein, wenn Sie das Gel aus der Kassette für die Gleichgewichtszeit entfernen, weil es sehr schnell platzen und zerbröckeln kann. Tauchen Sie eine 0,45 Mikrometer Polyvinylidendifluoridmembran für mindestens 20 Sekunden in reines Methanol ein, um sie zu aktivieren, und tauchen Sie sie dann in einen 1x Transferpuffer ein.Lassen Sie das Gel und die Membran für 10 Minuten aussetzen. Dann montieren Sie die Western Blotting Kassette und wenden Sie 180 Milliampere für 90 Minuten an, um die Proteine auf die Membran zu übertragen. Anschließend visualisieren Sie die Proteine durch Immunfärbung.Um die Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit zu bewerten, zuerst, Samen 50 000 multiple Myelom-Zellen pro Brunnen einer 96-Well-Platte in biologischer Triplicate. Fügen Sie zu jedem Brunnen 100 Mikroliter Medien, die DMSO enthalten, oder ein 0,1, ein oder 10 Mikromolar von Compound 8, Compound 9, oder Pomalidomid. Um ein Zelllebensrettungsexperiment durchzuführen, behandeln Sie stattdessen die Zellen mit einer 100-nanomolaren Lösung von Compound 8 für drei Stunden, entweder vor oder nach dem Hinzufügen einer mikromolaren Lösung von Pomalidomid.Inkubieren Sie die Zellen für 24, 48 oder 96 Stunden bei 37 Grad Celsius in einer 5%kohlendioxid-Atmosphäre, und messen Sie die Zelllebensfähigkeit mit einem lumineszierenden Assay. Die Struktur des homodimerischen PROTAC 8 wurde mit Proton und Kohlenstoff NMR bestätigt. Heterodimeric PROTAC 9 wurde als Negativkontrolle synthetisiert, da die N-Methylierung innerhalb des Glutarimid-Anteils zu einem Verlust der Bindungsfähigkeit von Cereblon oder CRBN führt.Der Homo PROTAC 8 induzierte einen nahezu vollständigen proteosomalen CRBN-Abbau mit minimalen Auswirkungen auf die lymphoiden Transkriptionsfaktoren IKZF1 und IKZF3. Im Gegensatz dazu zeigte das Hetero PROTAC 9 ein ähnliches Verhalten wie Pomalidomide. Compound 8 induzierte CRBN Abbau könnte durch einen direkten Inhibitor des Proteasoms blockiert werden, oder indirekt durch NetylierungShemmung blockiert werden.Mit Compound 8 vorbehandelte Zellen hielten den Auswirkungen von Pomalidomid auf IKZF1 und IKZF3 signifikant stand. Der zusammengesetzte 8-induzierte CRBN-Abbau hatte nach 96 Stunden viel weniger Einfluss auf die Lebensfähigkeit mehrerer Myelom-Zellals als der IKZF1- und IKZF3-Abbau von Compound 9 und Pomalidomid. Mehrere Myelomzellen, die mit Compound 8 vorbehandelt wurden, hatten eine signifikant größere Lebensfähigkeit, wenn sie Pomalidomid ausgesetzt waren als unbehandelte Zellen, was darauf hindeutet, dass Compound 8 verwendet werden könnte, um immunmodulatorische IMiD-Medikamentenresistenz zu imitieren.Wir fanden heraus, dass Compound 8 den vollständigen proteasomalen Abbau von Cereblon induziert, keine Nebenwirkungen auf die Lebensfähigkeit und Proliferation von IKZF1- und IKZF3-Zellen hat. Die Ausweitung der Projekttechnologie auf andere Ziele hat das Potenzial zur Inaktivierung und Verfolgung von Proteinen im Zusammenhang mit Krebs und anderen Krankheiten. Bei der Anpassung dieser Technik für andere Medikamente und Proteine sollte man sorgfältig die molekularen Strukturen des Arzneimittels und das Proteinziel untersuchen, um die optimalen Linker und Anhänge zu wählen.Die IMiDs funktionieren bei Mäusen aufgrund einer Punktmutation in Cereblon nicht, aber es gibt ein transgenes Knock-in-Maus-Modell, das für weitere Tierstudien verwendet werden kann. Da Pomalidomid ein analoges Thalidomid ist, das hoch teratogen ist, empfehlen wir schwangeren Frauen, die mit diesen Medikamenten arbeiten, nicht.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami Inspired Selbstorganisation von Patterned und Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Forschung

Chemie

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Chemical Vapor Deposition eines Organic Magnet, Vanadium Tetracyanethylen

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Vorbereitung hoch poröser Koordinationspolymerbeschichtungen auf makroporösen Monoliths für verbesserte Anreicherung von Phosphopeptiden

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Preparation of Macroporous Epitaxial Quartz Films on Silicon by Chemical Solution Deposition

Herstellung von makroporösen Epitaxial-Quarz-Films auf Silizium durch Chemical Solution Deposition

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Epitaxie Perowskit Strontiumtitanat auf Germanium über Atomic Layer Deposition

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Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Einfache Synthese von wurmartigen Mizellen durch sichtbares Licht Mediated Dispersion Polymerisation mit Photoredox Katalysator

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...