Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת על ידי הגרמני של הפרויקט (אמי-נתר התוכנית Kr-3886/2-1 ו-SFB-1074 לג; FOR2372 to מ)

1. הכנת מולקולות PROTAC
התראה: נא להתייעץ עם כל גליונות הנתונים הרלוונטיים של בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש. כמה מהכימיקלים המשמשים בתחביתזות אלה רעילים ומסרטנים. נא להשתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים וציוד הגנה אישי.
<ol><li>הכנת טרט-בוטיל N-(2, 6-דיאוקסו-3-piperidyl) carbamate (...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li><li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation+by+PROTACs.">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li><li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation.">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li><li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs:+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation.">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).</li><li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

העיצוב של כזה הומו-PROTACs כפי שתואר כאן עבור CRBN מסתמך על הזיקה הספציפית של pomalidomide כדי CRBN, אשר כבר נוצל בהצלחה ברבים הטרובידותיום PROTACs והביא לפיתוח PROTACS 8 כמו מאוד CRBN degrader סלקטיבית. הספציפיות של המולקולה שלנו כבר אושרה על-ידי ניתוחים פרוטאואריים24. עבור הסתרה מתווכת גנטית, ?...

התרופות האימונומודולטוריים (שפתוכים) תלידומיד ו האנלוגית שלה, lenalidomide ו pomalidomide, כל מאושר לטיפול מיאלומה נפוצה, לאגד את המידע e3 אוביקוויב ליגאז (crbn), מתאם מצע עבור cullin4A-RING e3 לליגאז (CRL4crbn)1,2,3. איגוד של הסרדים מגביר את האהדה של CRL4crbn כדי שעתוק הלימפה גורמים אינוס (IKZF1) ו aiolos (IKZF3), המוביל שלהם אוביגינציה והשפלה (איור 1)4,5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , 8. מאז IKZF1 ו IKZF3 חיוניים עבור תאים מיאלומה נפוצה, תוצאות חוסר ההפעלה שלהם מעכבות גדילה. SALL4 נמצאה לאחרונה כמו הגנום הניאו המושרה נוסף של crbn כי הוא כנראה אחראי על טראטוגניזה ואת האסון contergan בשנות החמישים שנגרמו על ידי תלידומיד9,10. לעומת זאת, שהקזאין (CK1α) הוא מצע מיוחד של CRBN, שהוא מעורב באפקט הטיפולי בתסמונת המיאלודיספלסטית עם מחיקות 5q של כרומוזום11.
היכולת של מולקולות קטנות למקד חלבון מסוים להשפלה היא רמז מרגש להתפתחות הסמים המודרנית. בעוד המנגנון של תלידומיד ואת האנלוגיות שלה התגלתה לאחר השימוש הראשון שלהם בבני אדם, כך קרא Proteolysis Targeting Chimeras (protacs) תוכננו במיוחד למקד חלבון של עניין (הדמות) (איור 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs הם מולקולות הטרובייוטיות המורכבות של ליגנד עבור פוי מחובר באמצעות מקשר ל ליגו של E3 אוביקוויב ליגאז כמו crbn or פון-היפרפל-ינדאו (vhl)18,19,20, 21,22. PROTACs לגרום להיווצרות של מתחם טרנארי חולף, הנחיית פוי ל-E3 אוביקוויב ligase, וכתוצאה מכך אוביקווינציה שלה והשפלה פרוטאספאואל. היתרונות העיקריים של PROTACs על פני מעכבי קונבנציונלי היא כי קשירה של פוי הוא מספיק ולא העכבות שלה ולכן PROTACs יכול למקד ספקטרום רחב הרבה יותר של חלבונים כולל אלה שנחשבו להיות undruggable כמו גורמים שעתוק15. בנוסף, מולקולות צ'יאריק לפעול באופן מזרז ולכן יש עוצמה גבוהה. לאחר העברת אוביקוויב לנקודת ההפוי, הקומפלקס הטרארי מנתק וזמין להיווצרות מתחמים חדשים. כך, ריכוזי PROTAC נמוך מאוד מספיקים עבור השפלה של חלבון היעד23.
כאן אנו מתארים את הסינתזה של pomalidomide-פוליאנide הומו-PROTAC (מתחם 8) כי המגוייסים עבור השפלה של עצמו24. The E3 אוביקוויט ליגאז crbn משמש הן המגייס ואת המטרה באותו זמן (איור 3). כדי לאמת את הנתונים שלנו, מסונתז גם בקרת מחייב שלילי (מתחם 9). הנתונים שלנו לוודא כי מסונתז הומו-PROTAC החדש הוא ספציפי עבור השפלה CRBN ויש לו רק השפעות מינימליות על חלבונים אחרים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

התרופות האימונומודולטוריים (שפוניים) תלידומיד ו האנלוגית שלה, lenalidomide ו pomalidomide, כל ה-FDA אישר תרופות לטיפול מיאלומה נפוצה, לגרום אוביקווינציה והשפלה של שעתוק הלימפה הגורמים אימוס (IKZF1) ו aiolos (IKZF3) באמצעות המוח (crbn) E3 אוביקוויב ליגאז עבור השפלה פרוטאספאואל. הסרדים לאחרונה כבר נוצל עבור הדור של bifunctional פרוטפוליזיס מיקוד הצ (PROTACs) כדי למקד חלבונים אחרים עבור אוביקווינציה ו השפלה פרוטאספאל על ידי CRBN E3 ligase. עיצבנו ו מסונתז pomalidomide מבוססי מבוסס PROTACs וניתח את היכולת שלהם כדי לגרום לעצמי אוביקווינציה והשפלה של CRBN. כאן, crbn משמש שניהם, the E3 אוביקוויב ליגאז ואת המטרה באותו זמן. מתחם הומו-פרוטואק 8 מאשר crbn עם עוצמה גבוהה עם השפעות שנותרו מינימליות בלבד על IKZF1 ו IKZF3. Crbn איון פעלה על ידי מתחם 8 לא היתה השפעה על הכדאיות התא והתפשטות של שונים תאים מיאלומה נפוצה. זה הומו-PROTAC abrogates ההשפעות של שפתוכים בתאי מיאלומה נפוצה. לכן, תרכובות מבוססות שלנו pomalidomide שלנו עשוי לסייע לזהות מצעים האנדוגניים של CRBN ופונקציות פיזיולוגיות ולחקור את המנגנון המולקולרי של הפתוכים.

כאן תיארנו את העיצוב, סינתזה והערכה ביולוגית של homodimeric pomalidomide מבוסס PROTAC עבור השפלה של CRBN. PROTAC שלנו אינטראקציה בו זמנית עם שני מולקולות CRBN וטפסים מתחמי מתחמים הגורמת עצמית אוביקווינציה והשפלה proteasomal של CRBN עם תופעות הנותרים מינימלי רק על pomalidomide המושרה ניאו מצעים IKZF1 או IKZF3.</p...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

עבודה זו מתארת את הסינתזה והאפיון של המבוסס על המוח, bifunctional הומו-protac כגישה הרומן כדי לגרום אובילינציה והשפלה של E3 אוביקוויב ליגאז המוח (crbn), המטרה של תלידומיד אנלוגיים gs.

הפעלה כימית של ה-E3 אוביקוויב Ligase הומו מבוסס על ידי Pomalidomide מבוססי ההומו-פרוטואקס

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

PROTACs homodimeric שלנו הם המעכבים הכימיים הראשונים של Cereblon ועשויים לעזור עוד יותר להחניק את המנגנון המולקולרי של אנלוגים תלידומיד, כמו גם לחקור את הפונקציה הפיזיולוגית של Cereblon. טכנולוגיית פלטפורמת PROTAC חדשה זו יכולה להיות מועילה מאוד עבור מיקוד ספציפי חלבונים של עניין כי הם נחשבים אחרת להיות בלתי ניתנים לניתוח. לעיכוב CRBN לבדו אין פעילות נגד גידולים.עם זאת, משפילים CRBN עשוי להיות השלכות קליניות השמנת יתר, מחלות זיהומיות, והפרעות אחרות. הסינתזה מאתגרת וקשה למצוא מקשרים אופטימליים וקובץ מצורף כדי ליצור משפילי חלבון יעילים בעת תכנון תרכובת PROTAC. כדי להתחיל, מניחים 2.46 גרם של L-גלוטמין מוגן Boc ו 50 מיליליטר של tetrahydrofuran בבקבוק 100 מיליליטר עגול התחתון, ומערבבים ב 800 סל"ד במשך דקה אחת.לאחר מכן, להוסיף 1.95 גרם של 1, 1'carbonyldiimidazole ואת כמות קטליטי של 4-פירידין. המשך ערבוב במשך 10 שעות ב reflux כדי להשיג פתרון ברור חסר צבע של תרכובת glutarimide. תן את הפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר, ולהסיר את הממס עם אידוי סיבובי.להתיז מחדש את השאריות ב 200 מיליליטר של אתיל אצטט ויוצקים אותו לתוך משפך הפרדה. לשטוף את השכבה האורגנית עם 50 מיליליטר כל אחד מים ומי מלח deionized, ולייבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי. כוח המשיכה לסנן את הפתרון באמצעות ג'ל סיליקה כדי להסיר את יוב, ולאחר מכן לשטוף את ג'ל סיליקה עם 200 מיליליטר של אתיל אצטט.הסר את הממס מן הסינון תחת ואקום כדי לקבל מורכבים 1 כמו מוצק חסר צבע. יבש את המוצר תחת ואקום לילה לפני השימוש בו. לאחר מכן, להמיס 0.50 גרם של נתרן אצטט ב 20 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית בבקבוק 100 מיליליטר עגול למטה מצויד בר ערבוב.מוסיפים 1.25 גרם של 3-פלואורופתאלית anhydride ו 1.14 גרם של glutarimide ומערבבים reflux במשך שש שעות כדי להשיג פתרון סגול של מתחם 3. תן את התערובת להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשפוך אותו לתוך 100 מיליליטר של מים deionized ומערבבים במשך 10 דקות כדי לזרז מתחם 3. לאסוף את המוצק על ידי סינון, לשטוף אותו עם מים ואתר נפט, ולייבש אותו תחת ואקום במשך יומיים.לאחר מכן, מניחים 0.83 גרם של תרכובת שלוש ו -20 מיליליטר של דימתיל סולפוקסיד יבש בבקבוק שלנק 50 מיליליטר ומערבבים במשך שתי דקות. הוסף 0.22 גרם של אלפא אומגה דיאמין מקשר תרכובת 6, ו 1.05 מיליליטר של N, N-diisopropylethylamine ומערבבים את התערובת תחת ארגון ב 90 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות כדי לקבל Homodimer 8 בתערובת ירוקה כהה. תן את התערובת להתקרר לטמפרטורת החדר ויוצקים אותו לתוך 100 מיליליטר של מים deionized.מוציאים את המוצר לשלוש מנות 50 מיליליטר של אתיל אצטט, מערבבים את השכבות האורגניות ושוטפים אותן עם 50 מיליליטר כל אחד מהמים והמים. יבש את השכבה האורגנית שטופה על נתרן גופרתי, לסנן את התייבשות ולהסיר את הממס תחת ואקום. לגלות מחדש את השאריות בכמות מינימלית של ממיס כרומטוגרפיה ולהחיל על עמודת ג'ל סיליקה לטיהור.לאסוף את שברי המוצר פלואורסצנטי, לשלב אותם, ולהסיר את הממס כדי להשיג Homodimer 8 כמו מוצק צהוב. כדי להתחיל, להמיס 2.28 גרם של Glutarimide 1 ב 25 מיליליטר של dimethylformamide בבקבוק 100 מיליליטר עגול למטה. להשעות 2.76 גרם של אשלגן פחמתי טחונים בתסומה זו.לאחר מכן, לצייר 0.62 מיליליטר של iodomethane לתוך מזרק מצויד מחט 20-מד. מוסיפים את טיפת iodomethane חכם במהלך 10 שניות. פקק את הבקבוק עם מחיצת גומי, ולהוסיף מחט אוורור.Sonicate את התערובת במשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי לקבל תרכובת גלוטרימיד 2. מדללים את התערובת עם 50 מיליליטר של אתיל אצטט ויוצקים אותו לתוך משפך הפרדה. שוטפים את הבקבוק לתוך המשפך עם עוד 50 מיליליטר של אתיל אצטט.לעבוד את המוצר ולטהר אותו עם כרומטוגרפיה עמודה ג'ל סיליקה כדי להשיג Glutarimide 2 כמו מוצק חסר צבע. השווה את זמני השמירה של תרכובות גלוטרימיד 1 ו- 2 כדי לאשר כי N-מתילציה הצליחה. כדי להתחיל את האימות, לטפל בתאי מיאלומה נפוצה עם תרכובות של עניין.לבודד את החלבונים הרלוונטיים, ולהכין דגימות לניתוח כתם מערבי של השפלת חלבון. לאחר מכן, להכין כריך ג'ל עבור SDS-PAGE ולמלא את מיכל חיץ אנודה עם פתרון pH 8.9 טריס-HCl. לטעון את דגימות החלבון לתוך הג'ל ולהפעיל אותו ב 70 וולט במשך 20 דקות, ואחריו 115 וולט במשך 150 דקות.לאחר מכן, הכינו חיץ העברה של פי 1 לאימונובלוט והזיזו בזהירות את הג'ל מהקלטת שלו למאגר ההעברה כדי לצייד. אתה צריך להיות זהיר מאוד כאשר אתה מסיר את הג'ל מן הקלטת עבור שיווי משקל, כי זה יכול להתפוצץ להתפורר מהר מאוד. לטבול קרום פוליווינילידין דיפלואוריד 0.45 מיקרומטר במתנול טהור למשך 20 שניות לפחות כדי להפעיל אותו, ולאחר מכן לטבול אותו במאגר העברה 1x.תן את הג'ל ואת קרום שיווי משקל במשך 10 דקות. לאחר מכן, להרכיב את הקלטת המערבית Blotting ולהחיל 180 מיליאמפר במשך 90 דקות כדי להעביר את החלבונים לממברנה. לאחר מכן, לדמיין את החלבונים על ידי immunostaining.כדי להעריך את ההשפעות על הכדאיות של התא, הראשון, זרע 50, 000 תאי מיאלומה נפוצה ל הבאר של צלחת 96 גם טריליקט ביולוגי. הוסף לכל באר 100 מיקרוליטרים של מדיה המכילים DMSO, או 0.1, אחד או 10 מיקרומולר של מתחם 8, מתחם 9 או פומלידומיד. כדי לבצע ניסוי הצלת כדאיות התא, במקום לטפל בתאים עם פתרון 100 nanomolar של מורכבים 8 במשך שלוש שעות, לפני או אחרי הוספת פתרון micromolar אחד של pomalidomide.הדגירה את התאים במשך 24, 48, או 96 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה 5%פחמן דו חמצני, ולמדוד את הכדאיות התא עם עלייה זוהרת. המבנה של פרוטק הומודימרי 8 אושר עם פרוטון ופחמן NMR. פרוטאק 9 הטרודימרי היה מסונתז כפקד שלילי, כמו N-מתילציה בתוך החלק glutarimide תוצאות אובדן של Cereblon, או CRBN, יכולת מחייבת.הומו PROTAC 8 המושרה כמעט השפלה CRBN פרוטאוזומלי מלא עם השפעות מינימליות על גורמי שעתוק הלימפה IKZF1 ו IKZF3. לעומת זאת, ההטרו PROTAC 9 הראה התנהגות דומה פומלידומידים. תרכובת 8 המושרה CRBN השפלה יכול להיחסם על ידי מעכב ישיר של proteasome, או בעקיפין נחסם על ידי עיכוב netylation.תאים שטופלו מראש עם תרכובת 8 התנגדו באופן משמעותי את ההשפעות של pomalidomide על IKZF1 ו IKZF3. תרכובת 8 המושרה CRBN השפלה היה הרבה פחות השפעה על הכדאיות התא מיאלומה נפוצה לאחר 96 שעות מאשר השפלה IKZF1 ו IKZF3 ממתחם 9 ו pomalidomide עשה. תאי מיאלומה נפוצה שטופלו מראש עם תרכובת 8 היו בעלי כדאיות גבוהה יותר באופן משמעותי כאשר נחשפו pomalidomide מאשר תאים מטופלים, מה שמרמז כי מורכבים 8 יכול לשמש כדי לחקות אימונומודולטורי IMiD עמידות לתרופות.מצאנו כי תרכובת 8 גורמת השפלה פרוטאסומאלית מלאה של Cereblon, אין תופעות לוואי על IKZF1 ו IKZF3 הכדאיות התא והתפשטות. הרחבת טכנולוגיית הפרויקט ליעדים אחרים יש פוטנציאל להשבית ומעקב אחר חלבונים הקשורים לסרטן ומחלות אחרות. בעת התאמת טכניקה זו עבור תרופות וחלבונים אחרים, יש לחקור בזהירות את המבנים המולקולריים של התרופה ואת יעד החלבון כדי לבחור את הקישורים וההחזקות האופטימליים.ה-IMIDs לא יפעלו בעכברים בגלל מוטציה נקודתית בסרבלון, אך קיים מודל עכבר מהונדס שניתן להשתמש בו למחקרים נוספים בבעלי חיים. כמו pomalidomide הוא תלידומיד אנלוגי, וזה מאוד טרטוגני, אנחנו לא ממליצים לנשים בהריון לעבוד עם תרופות אלה.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

אוריגמי השראה עצמית הרכבה של חלקיקים בדוגמת וReconfigurable

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

כימית החמקן הפקדת של מגנט אורגני, ונדיום Tetracyanoethylene

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

הכנת תיאום מאוד נקבובי פולימר ציפויים על מונוליתים פולימר Macroporous להעשרה משופרת של Phosphopeptides

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Preparation of Macroporous Epitaxial Quartz Films on Silicon by Chemical Solution Deposition

הכנת Macroporous Epitaxial קוורץ סרטים על הסיליקון על ידי פתרון כימי הפקדת

This work describes the detailed protocol for preparing piezoelectric macroporous epitaxial quartz films on silicon(100) substrates. This is a three-step ...

Epitaxial Growth of Perovskite Strontium Titanate on Germanium via Atomic Layer Deposition

הצמיחה epitaxial של perovskite סטרונציום Titanate על גרמניום באמצעות הפקדת אטומית Layer

Atomic layer deposition (ALD) is a commercially utilized deposition method for electronic materials. ALD growth of thin films offers thickness control and ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

סינתזה קלילה של Micelles תולעת דמוית ידי גלוי אור מתווכת פילמור נפיצה שימוש Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...