Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (Programma Emmy-Noether Kr-3886/2-1 e SFB-1074 a J.K.; DA FOR2372 a M.G.)

1. Preparazione di molecole PROTAC
AVVISO: consultare tutte le schede tecniche di sicurezza dei materiali pertinenti (MSDS) prima dell'uso. Molte delle sostanze chimiche utilizzate in queste sintetisi sono tossiche e cancerogene. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate e le attrezzature di protezione personale.
<ol><li>Preparazione del carbamate tert-butyl N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamate (composto 1)
	<ol>
<li>Aggiungere 1,1'-ca...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li><li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation+by+PROTACs.">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li><li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation.">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li><li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs:+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation.">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).</li><li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

La progettazione di tali omo-PROTAC come descritto qui per CRBN si basa sulla specifica affinità della pomalimofilia con CRBN, che è stata utilizzata con successo in numerosi PROTAC eterobifunzionali e ha portato allo sviluppo di PROTAC 8 come degrado CRBN selettivo. La specificità della nostra molecola è già stata confermata dalle analisi proteomiche24. Per knockout geneticamente mediato, l'esclusione e la convalida degli effetti collaterali è impegnativo e richiede tempo. ...

I farmaci immunomodulatori (IMid) e i suoi analoghi, lenalidomide e pomalidomide, tutti approvati per il trattamento del mieloma multiplo, si legano alla sigillante ligase dell'ubiquitina E3 (CRBN), un adattatore substrato per l'ubiereanzi a 2la-RING E3 (CRL4CRBN)1,2,3. L'associazione degli IMiD aumenta l'affinità di CRL4CRBN ai fattori di trascrizione linfoidi Ikaros (IK-F1) e Aiolos (IK-F3), portando alla loro ubiquitazione e degradazione (Figura 1)4,5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8. Dal momento che iK-F1 e IK-F3 sono essenziali per le cellule multiple del mieloma, la loro inattivazione provoca inibizione della crescita. SALL4 è stato recentemente trovato come un ulteriore neo-substrato indotta da IMiD di CRBN che è probabilmente responsabile della teratogenicità e della cosiddetta catastrofe Contergan negli anni '50 causata dalla talidomide9,10. Al contrario, la cassicina 1 è un substrato di CRBN specifico di lenalidomide che è implicato nell'effetto terapeutico nella sindrome della mielodiplastico con cromosoma 5q eliminazioni11.
La capacità delle piccole molecole di indirizzare una proteina specifica per la degradazione è un'implicazione interessante per lo sviluppo di farmaci moderni. Mentre il meccanismo della talidomide e dei suoi analoghi è stato scoperto dopo il loro primo utilizzo negli esseri umani, la cosiddetta Proteolisi Targeting Chimeras (PROTAC) sono stati progettati per indirizzare specificamente una proteina di interesse (POI) (Figura 2)12,13,14,15,16,17,18. I PROTAC sono molecole eterobifunzionali costituite da un ligando specifico per il POI collegato tramite un linker a un ligando di una ligase ubiquitina E3 come CRBN o von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. I PROCAC inducono la formazione di un complesso ternario transitorio, dirigendo il POI alla ligase dell'ubiquitina E3, con conseguente ubiquitinazione e degradazione proteasomica. I principali vantaggi dei PROTAC rispetto agli inibitori convenzionali sono che il legame a un POI è sufficiente piuttosto che la sua inibizione e quindi i PROTAC possono potenzialmente indirizzare uno spettro molto più ampio di proteine, comprese quelle considerate infarmacibili come fattori di trascrizione15. Inoltre, le molecole chimetriche agiscono cataliticamente e quindi hanno un'alta potenza. Dopo il trasferimento dell'ubiquitina al POI, il complesso ternario si dissocia ed è disponibile per la formazione di nuovi complessi. Pertanto, concentrazioni molto basse di PROTAC sono sufficienti per la degradazione della proteina bersaglio23.
Qui descriviamo la sintesi di una pomalimide-pomalidomide coniugata homo-PROTAC (composto 8) che recluta CRBN per la degradazione di se stesso24. L'E3 ubiquitin ligase CRBN è sia il reclutatore che l'obiettivo contemporaneamente (Figura 3). Per convalidare i dati, abbiamo anche sintetizzato un controllo di rilegatura negativo (composto 9). I nostri dati confermano che l'omo-PROTAC appena sintetizzato è specifico per la degradazione CRBN e ha solo effetti minimi su altre proteine.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

I farmaci immunomodulatori (IMid) e i suoi analoghi, lenalidomide e pomalidomide, tutti i farmaci approvati dalla FDA per il trattamento del mieloma multiplo, inducono l'ubiquitazione e la degradazione dei fattori di trascrizione linfoide Ikaros (IK-F1) e Aiolos (IK-F3) tramite il cereblon (CRBN) E3 ubiquitina ligase per degradazione proteasomica. Gli IMID sono stati recentemente utilizzati per la generazione di chimere di proteolisi bifunzionale targeting (PROTAC) per indirizzare altre proteine per l'ubiquitinazione e la degradazione proteasomica da parte della ligase CRBN E3. Abbiamo progettato e sintetizzato proTAC omobifunzionali basati su pomalidomide e analizzato la loro capacità di indurre l'ubiquitinazione e la degradazione di CRBN. Qui, CRBN serve come entrambi, l'E3 ubiquitin ligase e l'obiettivo allo stesso tempo. Il composto omo-PROTAC 8 degrada il CRBN con un'alta potenza con solo effetti residui minimi su IK-F1 e IK-F3. L'inattivazione di CRBN da parte del composto 8 non ha avuto alcun effetto sulla vitalità cellulare e sulla proliferazione di diverse linee cellulari multiple del mieloma. Questo omo-PROTAC abroga gli effetti degli IMID in più cellule del mieloma. Pertanto, i nostri composti omodimeri a base di pomalidomide possono aiutare a identificare i substrati endogeni e le funzioni fisiologiche del CRBN e a studiare il meccanismo molecolare degli IMID.

Qui abbiamo descritto la progettazione, la sintesi e la valutazione biologica di un PROTAC omodimerico basato su pomalidomide per la degradazione del CRBN. Il nostro PROTAC interagisce contemporaneamente con due molecole CRBN e forma complessi ternari che inducono l'auto-ubiquitinazione e la degradazione proteasomica del CRBN con solo effetti rimanenti minimi su neo-substrati indotti dalla pomalimofe IK-F1 o IK-F3.
Da una serie ...

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Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Questo lavoro descrive la sintesi e la caratterizzazione di un omo-PROTAC bimalidomide a base di pomalimmide come un nuovo approccio per indurre l'ubiquitinazione e la degradazione della cereblon della ligase dell'ubiquitina E3 (CRBN), l'obiettivo degli analoghi di talidomide.

Inattivazione chimica dell'E3 Ubiquitin Ligase Cereblon da parte di Homo-PROTAC con sede a Pomeredomide

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

I nostri PROTAC omodimerici sono i primi inibitori chimici di Cereblon e possono aiutare a chiarire ulteriormente il meccanismo molecolare degli analoghi di talidomide, nonché a studiare la funzione fisiologica di Cereblon. Questa nuova tecnologia di piattaforma PROTAC può essere molto utile per indirizzare specificamente le proteine di interesse che sono altrimenti considerate non tracciabili. L'inibizione del CRBN da sola non ha attività antitumorata.Tuttavia, i degradanti CRBN possono avere implicazioni cliniche in obesità, malattie infettive e altri disturbi. La sintesi è impegnativa ed è difficile trovare linker e attaccamenti ottimali per generare efficaci degradatori proteici durante la progettazione di un composto PROTAC. Per iniziare, posizionare 2,46 grammi di L-glutammina protetta da Boc e 50 millilitri di tetraidrofurano in un pallone a fondo rotondo da 100 millilitri e mescolare a 800 giri/min per un minuto.Quindi, aggiungere 1,95 grammi di 1, 1'carbonildiimidazolo e una quantità catalitica di 4-piridina. Continuare a mescolare per 10 ore a reflusso per ottenere una soluzione limpida e incolore di composto glutarimide. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e rimuovere il solvente con un evaporatore rotante.Riassolvere il residuo in 200 millilitri di acetato di etile e versarlo in un imbuto separatore. Lavare lo strato organico con 50 millilitri ciascuno di acqua e salamoia deionizzata e asciugare lo strato organico sul solfato di sodio. Filtrare la soluzione per gravità attraverso il gel di silice per rimuovere l'essiccante, quindi sciacquare il gel di silice con 200 millilitri di acetato di etile.Rimuovere il solvente dal filtrato sotto vuoto per ottenere il composto 1 come solido incolore. Asciugare il prodotto sotto vuoto durante la notte prima di utilizzarlo. Successivamente, sciogliere 0,50 grammi di acetato di sodio in 20 millilitri di acido acetico glaciale in un pallone a fondo rotondo da 100 millilitri dotato di una barra di agitazione.Aggiungere 1,25 grammi di anidride 3-fluoroftalica e 1,14 grammi di glutarimide e mescolare a reflusso per sei ore per ottenere una soluzione viola del composto 3. Lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente, quindi versarla in 100 millilitri di acqua deionizzata e mescolare per 10 minuti per precipitare il composto 3. Raccogliere il solido per filtrazione, lavarlo con acqua ed etere di petrolio e asciugarlo sotto vuoto per due giorni.Quindi, mettere 0,83 grammi di composto tre e 20 millilitri di solfossido di dimetile secco in un pallone Schlenk da 50 millilitri e mescolare per due minuti. Aggiungere 0,22 grammi di legame alfa omega diammina Composto 6 e 1,05 millilitri di N, N-diisopropiletilammina e mescolare la miscela sotto argon a 90 gradi celsius per 18 ore per ottenere Homodimer 8 in una miscela verde scuro. Lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente e versarla in 100 millilitri di acqua deionizzata.Estrarre il prodotto in tre porzioni da 50 millilitri di acetato di etile, unire gli strati organici e lavarli con 50 millilitri ciascuno di acqua e salamoia. Asciugare lo strato organico lavato sul solfato di sodio, filtrare l'essiccante e rimuovere il solvente sotto vuoto. Riissolvere il residuo in una quantità minima di solvente cromatografico e applicare su una colonna di gel di silice per la purificazione.Raccogliere le frazioni di prodotto fluorescenti, combinarle e rimuovere il solvente per ottenere Homodimer 8 come solido giallo. Per iniziare, sciogliere 2,28 grammi di glutarimide 1 in 25 millilitri di dimetilformamide in un pallone a fondo rotondo da 100 millilitri. Sospendere 2,76 grammi di carbonato di potassio macinato in questa soluzione.Quindi, disegnare 0,62 millilitri di iodometano in una siringa dotata di un ago calibro 20. Aggiungi l'iodometano per quanto riguarda il drop nel corso di 10 secondi. Fermare il pallone con un setto di gomma e aggiungere un ago di sfiato.Sonicare la miscela per due ore a temperatura ambiente per ottenere glutarimide composto 2. Diluire la miscela con 50 millilitri di acetato di etile e versarla in un imbuto separatore. Risciacquare il pallone nell'imbuto con altri 50 millilitri di acetato di etile.Lavorare il prodotto e purificarlo con cromatografia a colonna di gel di silice per ottenere la glutarimide 2 come solido incolore. Confrontare i tempi di ritenzione dei composti glutarimide 1 e 2 per confermare che la metilazione N ha avuto successo. Per iniziare la convalida, trattare più cellule del mieloma con i composti di interesse.Isolare le proteine rilevanti e preparare campioni per un'analisi western Blot della degradazione proteica. Quindi, preparare un sandwich di gel per SDS-PAGE e riempire il serbatoio del buffer anodo con una soluzione di pH 8.9 tris-HCl. Caricare i campioni proteici nel gel ed eseguito a 70 Volt per 20 minuti, seguito da 115 volt per 150 minuti.Quindi, preparare un buffer di trasferimento 1x per l'immunoblotting e spostare attentamente il gel dalla sua cassetta al buffer di trasferimento per equilibrare. Devi stare molto attento quando rimuovi il gel dalla cassetta per l'equilibrazione, perché può scoppiare e accartocciarsi molto rapidamente. Immergere una membrana di difluoruro di polivinilidene da 0,45 micrometri in metanolo puro per almeno 20 secondi per attivarla, quindi immergerla in un buffer di trasferimento 1x.Lasciare equilibrare il gel e la membrana per 10 minuti. Quindi, assemblare la cassetta western blotting e applicare 180 milliampere per 90 minuti per trasferire le proteine alla membrana. Successivamente, visualizzare le proteine immunosottenendo.Per valutare gli effetti sulla vitalità cellulare, in primo luogo, seme 50.000 cellule multiple di mieloma per pozzo di una piastra di 96 po 'in tripliceto biologico. Aggiungere a ciascun pozzo 100 microlitri di supporti contenenti DMSO, o uno 0,1, uno o 10 micromolare di composto 8, composto 9 o pomalidomide. Per eseguire l'esperimento di salvataggio della vitalità cellulare, trattare invece le cellule con una soluzione nanomolare 100 di composto 8 per tre ore, prima o dopo aver aggiunto una soluzione micromolare di pomalidomide.Incubare le cellule per 24, 48 o 96 ore a 37 gradi celsius in un'atmosfera di anidride carbonica del 5% e misurare la vitalità cellulare con un saggio luminescente. La struttura del PROTAC 8 omodimerico è stata confermata con NMR protonico e carbonio. Heterodimeric PROTAC 9 è stato sintetizzato come un controllo negativo, poiché la metilazione N all'interno della porzione di glutarimide comporta una perdita di cereblon, o CRBN, capacità di legame.L'homo PROTAC 8 ha indotto una degradazione CRBN proteosomica quasi completa con effetti minimi sui fattori di trascrizione linfoide IKZF1 e IKZF3. Al contrario, l'etero PROTAC 9 ha mostrato un comportamento simile ai pomalidomidi. La degradazione crbn indotta dal composto 8 potrebbe essere bloccata da un inibitore diretto del proteasome, o indirettamente bloccata dall'inibizione della netilazione.Le cellule pretrattate con il composto 8 hanno resistito significativamente agli effetti del pomalidomide su IKZF1 e IKZF3. La degradazione CRBN indotta dal composto 8 ha avuto molto meno effetto sulla vitalità della cellula del mieloma multiplo dopo 96 ore rispetto alla degradazione IKZF1 e IKZF3 dal composto 9 e dal pomalidomide. Più cellule del mieloma pretrattate con il composto 8 avevano una vitalità significativamente maggiore se esposte al pomalidomide rispetto alle cellule non trattate, suggerendo che il composto 8 poteva essere usato per imitare la resistenza ai farmaci immunomodulatori IMiD.Abbiamo scoperto che il composto 8 induce la completa degradazione proteasomale di Cereblon, non ha effetti collaterali sulla vitalità e proliferazione cellulare IKZF1 e IKZF3. L'estensione della tecnologia del progetto ad altri obiettivi ha il potenziale per inattivare e rintracciare le proteine legate al cancro e ad altre malattie. Quando si adatta questa tecnica per altri farmaci e proteine, si dovrebbero indagare attentamente le strutture molecolari del farmaco e il bersaglio proteico per scegliere i linker e gli allegati ottimali.Gli IMID non funzioneranno nei topi a causa di una mutazione puntile nel Cereblon, ma esiste un modello transgenico di topo knock-in che può essere utilizzato per ulteriori studi sugli animali. Poiché la pomalidomide è una talidomide analogica, che è altamente teratogena, non consigliamo alle donne incinte di lavorare con questi farmaci.

Research

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