Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

이 작품은 도이치 포르충스게마인샤프트(에미-노에테르 프로그램 Kr-3886/2-1 및 SFB-1074-J.K.)에 의해 지원되었다. FOR2372 - M.G.)

1. PROTAC 분자의 준비
주의: 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트(MSDS)를 참조하십시오. 이러한 합성에 사용 되는 화학 물질의 몇 가지 독성 및 발암성. 모든 적절한 안전 관행과 개인 보호 장비를 사용하십시오.
<ol><li>테르트-부틸 N-(2,6-디옥소-3-피프리딜)카르바메이트(화합물 1)
	<ol>
<li>THF(50 mL)에서 1,1-카르보닐디미다졸(1.95 g, 12 mmol)과 촉?...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li><li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation+by+PROTACs.">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li><li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation.">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li><li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs:+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation.">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).</li><li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

CRBN에 대해 여기에 설명된 바와 같이 이러한 호모-PROTAC의 설계는 CRBN에 대한 포말리도마이드의 특정 친화성에 의존하며, 이는 수많은 heterobifunctional PROTAC에서 성공적으로 활용되었으며 PROTAC 8의 개발을 매우 높게 초래했습니다. 선택적 CRBN 저하기. 우리의 분자의 특이성은 이미 proteomic 분석24에의해 확인되었습니다. 유전적으로 중재된 녹아웃의 경우, 부작용의 배제?...

면역 조절 약물 (IMiDs) 탈리도마이드와 그 유사체, 레날리도마이드와 포말리도마이드, 모두 다발성 골수종의 치료를 위해 승인, E3 유비퀴틴 리가세 세레블론에 결합(CRBN), 컬린4A-RING E3 유비퀴틴 리가에 대한 기질 어댑터 (CRL4CRBN)1,2,3. IMiDs의 결합은 림프성 전사 인자 이카로스 (IKZF1) 및 아이올로스 (IKZF3)에 CRL4CRBN의 친화성을 향상시켜, 그들의 유비퀴틴화 및 저하로 이어지는 (그림1)4,5 ,5, 6개 , 7명 , 8. IKZF1 및 IKZF3는 다발성 골수종 세포에 필수적이므로 불활성화는 성장 억제를 초래합니다. SALL4는 최근 탈리도마이드9,10에의한 1950년대의 기형및 소위 Contergan 재앙에 대한 책임이 있는 CRBN의 추가적인 IMiD 유도 신기판으로서 발견되었다. 대조적으로, 카제인 키나아제 1α(CK1α)는 염색체 5q 델레이션을 가진 골수이형성 증후군에서 치료 효과에 연루되는 CRBN의 레날리도마이드특이적 기질(11)이다.
분해를 위해 특정 단백질을 표적으로 하는 작은 분자의 능력은 현대 약물 발달을 위한 흥미진진한 의미입니다. 탈리도마이드와 그 유사체의 메커니즘은 인간에서 처음 사용한 후에 발견되었지만, 소위 Proteolysis Targeting C히메라스 (PROTACs)는 특히 관심단백질(POI)을 표적으로 하도록 설계되었습니다(그림) 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs는 CRBN 또는 폰-히펠-린다우(VHL)18,19,20,E3 유비퀴틴 리가제의 리간드에 링커를 통해 연결된 POI에 대한 특정 리간드로 구성된 헤테로비기능 분자이다. 21,22. PROTACs는 일시적인 삼차 복합체의 형성을 유도하여 POI를 E3 유비퀴틴 리가제에 지시하여 유비퀴틴화 및 프로테아소말 분해를 초래합니다. 기존의 억제제에 비해 PROTACs의 주요 장점은 POI에 결합하는 것이 그것의 억제 보다는 오히려 충분하다는 것입니다 및 그러므로 PROTACs는 잠재적으로 약용으로 여겨지는 단백질을 포함하여 단백질의 훨씬 더 넓은 스펙트럼을 표적으로 할 수 있습니다 전사 인자15. 또한 키메라 분자는 촉매작용을 하므로 효능이 높습니다. POI로 유비퀴틴이 전달된 후, 삼차 복합체는 해리되고 새로운 복합체의 형성에 사용할 수 있다. 따라서, 매우 낮은 PROTAC 농도는 표적단백질(23)의분해에 충분하다.
여기서 우리는 자체(24)의 분해를 위해 CRBN을 모집하는 포말리도마이드-포말리도마이드 공액호-PROTAC(화합물 8)의합성을 설명한다. E3 유비퀴틴 리가제 CRBN은 모집자 및 대상을 동시에 제공합니다(그림 3). 데이터의 유효성을 검사하기 위해 음의 결합 제어(화합물 9)도 합성했습니다. 우리의 데이터는 새로 합성된 호모-PROTAC가 CRBN 분해에 특이적이고 다른 단백질에 최소한의 효과만 가지고 있음을 확인합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

면역 조절 약물 (IMiDs) 탈리도마이드와 그 유사체, 레날리도마이드 및 포말리도마이드, 다발성 골수종의 치료를 위한 모든 FDA 승인 약물, 림프성 전사 인자 이카로스(IKZF1) 및 아이올로스의 유비퀴틴화 및 분해를 유도 (IKZF3) 세레블론 (CRBN) E3 유비퀴틴 리가아제를 경질 분해를 경유한다. IMiDs는 최근 CRBN E3 ligase에 의한 유비퀴틴화 및 프로테아소말 분해를 위한 다른 단백질을 표적으로 하는 이중 기능성 프로테오분해 표적화 키메라(PROTACs)의 생성을 위해 활용되고 있다. 우리는 포말리도마이드 기반의 호모비기능 PROTACs를 설계 및 합성하고 CRBN의 자기 주도적 유비퀴틴화 및 분해를 유도하는 능력을 분석했습니다. 여기서, CRBN은 E3 유비퀴틴 리가제와 동시에 표적을 모두 작용한다. 호모-PROTAC 화합물 8은 IKZF1 및 IKZF3에 최소한의 남은 효과만 으로 높은 효능으로 CRBN을 저하시고 있습니다. 화합물 8에 의한 CRBN 불활성화는 상이한 다발성 골수종 세포주들의 세포 생존 및 증식에 영향을 미치지 않았다. 이 호모-PROTAC는 다발성 골수종 세포에서 IMiDs의 효과를 제거합니다. 따라서, 우리의 동형 포말리도마이드 계 화합물은 CRBN의 내인성 기질 및 생리기능을 확인하고 IMiDs의 분자 메커니즘을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

여기서 우리는 CRBN의 분해를 위한 동형 포말리도마이드 계 PROTAC의 설계, 합성 및 생물학적 평가를 기술하였다. 우리의 PROTAC는 두 개의 CRBN 분자와 동시에 상호 작용하고 포말리도마이드 유도 네오 기질 IKZF1 또는 IKZF3에 최소한의 남은 효과로 CRBN의 자가 유비퀴틴화 및 프로테아소말 분해를 유도하는 삼차 복합체를 형성합니다.
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Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

이 작품은 탈리도마이드 유사체의 표적인 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론(CRBN)의 유비퀴틴화 및 분해를 유도하는 새로운 접근법으로서 포말리도마이드 계, 이중 기능적 호모-PROTAC의 합성 및 특성화를 설명한다.

포말리도마이드 기반 호모-PROTACs에 의한 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론의 화학적 불활성화

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

우리의 호모디머 PROTAC는 세레블론의 첫 번째 화학 억제제이며 탈리도마이드 유사체의 분자 메커니즘을 더욱 해명하고 Cereblon의 생리적 기능을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 새로운 PROTAC 플랫폼 기술은 추적할 수 없는 것으로 간주되는 관심 있는 단백질을 특별히 타겟팅하는 데 매우 유용할 수 있습니다. CRBN 억제만으로는 항종양 활성이 없습니다.그러나 CRBN 분해제는 비만, 전염병 및 기타 장애에 임상적 영향을 미칠 수 있습니다. 합성은 도전적이고 PROTAC 화합물을 설계 할 때 효과적인 단백질 저하기를 생성하기 위해 최적의 링커와 부착물을 찾기가 어렵습니다. 우선, 2.46 그램의 Boc 보호 L-글루타민과 50 밀리리터의 테트라 하이드로푸란을 100 밀리리터 둥근 바닥 플라스크에 넣고 1 분 동안 800 rpm에서 저어줍니다.그런 다음 1.95 그램의 1, 1'carbonyldiimidazole 및 4-pyridine의 촉매 양을 추가합니다. 글루타리미드 화합물의 명확한 무색 용액을 얻기 위해 역류에서 10 시간 동안 교반을 계속합니다. 용액을 실온으로 식히고 회전 증발기로 용매를 제거하십시오.에틸 아세테이트 200밀리리터에 잔류물을 재용하여 분리 깔때기에 붓습니다. 유기 층을 50 밀리리터로 세척하고 소금물 과 소금물 각각을 씻어, 나트륨 황산나트륨 위에 유기 층을 건조. 중력은 실리카 젤을 통해 용액을 걸러 건조제를 제거한 다음 실리카 젤을 에틸 아세테이트 200밀리리터로 헹구는다.진공 하에서 여과에서 용매를 제거하여 화합물 1을 무색 고체로 얻습니다. 제품을 사용하기 전에 밤새 진공 상태에서 제품을 건조시십시오. 다음으로, 동요 바가 장착된 100밀리리터 라운드 하단 플라스크에 빙하 아세산 20밀리리터에 아세테이트 나트륨 0.50그램을 녹입니다.1.25 그램의 3-플루오로프탈릭 무수드라이드와 글루타리미드 1.14 그램을 넣고 6시간 동안 역류에서 저어 화합물 3의 보라색 용액을 얻습니다. 혼합물을 실온으로 식힌 다음 100 밀리리터의 탈온화 물에 붓고 10분 동안 저어 화합물 3을 침전시합니다. 여과로 고체를 수집하고 물과 석유 에테르로 세척하고 진공 상태에서 2 일 동안 건조하십시오.다음으로, 화합물 3의 0.83 그램과 건조 디메틸 설프리산화물 20 밀리리터를 50 밀리리터 슐렌크 플라스크에 넣고 2 분 동안 저어줍니다. 알파 오메가 디아민 링커 화합물 6의 0.22 그램, 그리고 1.05 N의 밀리리터를 추가, N-diisopropylethylamine의 1.05 밀리리터와 어두운 녹색 혼합물에서 Homodimer 8을 얻기 위해 18 시간 동안 90 섭씨에서 아르곤 에서 혼합물을 저어. 혼합물을 실온으로 식히고 100 밀리리터의 탈온화 된 물에 붓습니다.에틸 아세테이트의 3개 50밀리리터 부분으로 제품을 추출하고, 유기 층을 결합하고, 물과 소금물 각각 50밀리리터로 세척합니다. 세척된 유기층을 황산나트륨 위에 건조시키고, 건조제를 걸기하고, 진공 상태에서 용매를 제거합니다. 잔류물을 최소한의 크로마토그래피 용매로 재해석하고 실리카 겔 컬럼에 적용하여 정제합니다.형광 제품 분획을 수집하고 결합한 다음 용매를 제거하여 호모이머 8을 노란색 고체로 가져옵니다. 시작하려면 100 밀리리터 라운드 하단 플라스크에 디메틸포르마미드 25 밀리리터에 2.28 그램의 글루타리미드 1을 녹입니다. 이 용액에서 2.76 그램의 분쇄 된 탄산 칼륨을 일시 중단하십시오.그런 다음, 20 게이지 바늘이 장착 된 주사기에 요오메탄의 0.62 밀리리터를 그립니다. 10초 동안 요오도메탄 드롭 와이즈를 추가합니다. 고무 중격으로 플라스크를 멈추고 통풍구 바늘을 추가합니다.글루타리미드 화합물 2를 얻기 위해 실온에서 2 시간 동안 혼합물을 초음파 처리합니다. 에틸 아세테이트 50 밀리리터로 혼합물을 희석하고 분리 깔때기에 붓습니다. 플라스크를 깔때기에 헹구고 또 다른 50밀리리터의 에틸 아세테이트를 넣습니다.제품을 작업하고 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피로 정화하여 글루타리미드 2를 무색 고체로 얻습니다. 글루타리마이드 화합물의 보존 시간을 비교1 과 2 N-메틸화가 성공했다는 것을 확인합니다. 유효성 검사를 시작하려면 다발성 골수종 세포를 관심 있는 화합물로 치료하십시오.관련 단백질을 분리하고 단백질 분해의 웨스턴 블롯 분석을 위한 샘플을 준비합니다. 그런 다음, SDS-PAGE용 젤 샌드위치를 준비하고 양극 버퍼 탱크를 pH 8.9 tris-HCl 용액으로 채웁니다. 단백질 샘플을 젤에 적재하고 70 볼트에서 20분 동안 실행한 다음 115볼트를 150분 동안 실행합니다.다음으로, 면역 형필로팅을 위해 1x 이송 버퍼를 준비하고 조심스럽게 젤을 카세트에서 전달 버퍼로 이동하여 평형화합니다. 매우 빠르게 파열되고 구겨질 수 있기 때문에 평형을 위해 카세트에서 젤을 제거 할 때 매우 조심해야합니다. 0.45 마이크로미터 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인을 순수 메탄올에 20초 이상 담그고 활성화한 다음 1x 이송 버퍼에 담급다.젤과 멤브레인이 10분 동안 평형화하게 하십시오. 그런 다음, 웨스턴 블로팅 카세트를 조립하고 90 분 동안 180 밀리암퍼를 적용하여 단백질을 막으로 옮킵니다. 그 후 면역 염색을 통해 단백질을 시각화합니다.세포 생존가능성에 미치는 영향을 평가하기 위해 먼저, 종자 50, 000다발성 골수종 세포는 생물학적 삼중판에서 96개의 웰 플레이트당 잘 한다. DMSO를 함유하는 100마이크로리터, 또는 화합물 8, 화합물 9 또는 포말리도마이드의 0.1, 1 또는 10 마이크로몰어를 각각 잘 첨가한다. 세포 생존성 구조 실험을 수행하기 위해 포말리도마이드의 1마이크로몰러 용액을 추가하기 전또는 후에 3시간 동안 화합물 8의 100 나노몰러 용액으로 세포를 치료하십시오.5%의 이산화탄소 대기에서 섭씨 37도에서 24, 48 또는 96시간 동안 세포를 배양하고 발광 분석으로 세포 생존가능성을 측정합니다. 상동성 PROTAC 8의 구조는 양성자 및 탄소 NMR로 확인되었다. 이종구형 PROTAC 9는 글루타리미드 부분 내의 N-메틸화로 인해 세레블론 또는 CRBN, 결합 기능의 손실을 초래하기 때문에 부정적인 대조군으로서 합성되었다.호모 PROTAC 8은 림프전사 인자 IKZF1 및 IKZF3에 최소한의 효과로 완전한 프로테오소말 CRBN 분해에 가까운 유도. 대조적으로, hetero PROTAC 9는 포말리도마이드와 유사한 행동을 보였다. 화합물 8 유도 CRBN 분해는 프로테좀의 직접 억제제에 의해 차단될 수 있거나, 또는 네틸화 억제에 의해 간접적으로 차단될 수 있다.화합물 8로 미리 처리된 세포는 IKZF1 및 IKZF3에 포말리도마이드의 효과에 크게 저항하였다. 화합물 8 유도 CRBN 분해는 화합물 9 및 포말리도마이드로부터 IKZF1 및 IKZF3 분해보다 96시간 후 다발성 골수종 세포 생존가능성에 훨씬 적은 영향을 미쳤다. 화합물 8로 미리 처리된 다발성 골수종 세포는 처리되지 않은 세포 보다는 pomalidomide에 드러릴 때 현저하게 더 중대한 생존성을 가졌습니다, 화합물 8면역변색IMiD 약물 저항을 모방하기 위하여 이용될 수 있었다는 것을 건의하.우리는 화합물 8 세레블론의 완전한 proteasomal 저하를 유도 발견, IKZF1 및 IKZF3 세포 생존및 증식에 부작용이 없습니다. 프로젝트 기술을 다른 대상으로 확장하는 것은 암 및 기타 질병과 관련된 단백질을 비활성화하고 추적할 가능성이 있습니다. 다른 약물과 단백질에 대 한이 기술을 적응 하는 경우, 하나는 신중 하 게 최적의 링커와 첨부 파일을 선택 하는 약물 및 단백질 대상의 분자 구조를 조사 해야.IMIDs는 세레블론의 포인트 돌연변이 때문에 마우스에서 작동하지 않습니다, 그러나 추가 동물 연구 결과를 위해 사용될 수 있는 형질 전환 노크 마우스 모형이 존재합니다. 포말리도마이드는 매우 테라토제닉인 아날로그 탈리도마이드이기 때문에, 우리는 이 약으로 일하는 임산부를 추천하지 않습니다.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

종이 접기 고취 패턴 및 재구성 입자의 자기 조립

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

연구

화학

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

화학 고정하여 X-ray 형광 이미징 부착 세포를 준비

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

자석의 유기 화학 기상 증착, 바나듐 테트라시

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

포스 포의 향상된 농축을위한 거대 다공성 고분자 모노리스에 다공성 조정 폴리머 코팅의 제조

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Preparation of Macroporous Epitaxial Quartz Films on Silicon by Chemical Solution Deposition

화학 용액 증착에 의해 실리콘에 거대 다공성 에피 택셜 석영 필름의 제조

This work describes the detailed protocol for preparing piezoelectric macroporous epitaxial quartz films on silicon(100) substrates. This is a three-step ...

Epitaxial Growth of Perovskite Strontium Titanate on Germanium via Atomic Layer Deposition

원자 층 증착을 통해 게르마늄에 페 로브 스카이 스트론튬 티탄의 에피 택셜 성장

Atomic layer deposition (ALD) is a commercially utilized deposition method for electronic materials. ALD growth of thin films offers thickness control and ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Photoredox 촉매를 사용하여 가시 광선 중재 분산 중합에 의해 웜 형상 미셀 손쉬운 합성

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...