Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether program kr-3886/2-1 og SFB-1074 til JK; FOR2372 til M.G.)

1. utarbeidelse av PROTAC molekyler
FORSIKTIG: ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablad (muskel-og skjelettlidelser) før bruk. Flere av kjemikaliene som brukes i disse synteser er giftige og kreftfremkallende. Bruk all hensiktsmessig sikkerhetspraksis og personlig verneutstyr.
<ol><li>Utarbeidelse av tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamate (sammensatt 1)
	<ol>
<li>Tilsett 1, 1 '-carbonyldiimidazole (1,95 g, 12 mmol) og en katalysator av 4-(...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li><li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation+by+PROTACs.">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li><li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation.">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li><li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs:+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation.">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).</li><li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

Utformingen av slike homo-PROTACs som beskrevet her for CRBN er avhengig av spesifikke affinitet av pomalidomide til CRBN, som har blitt utnyttet i mange heterobifunctional PROTACs og resulterte i utviklingen av PROTAC 8 som en svært selektiv CRBN Degrader. Det spesielle ved vårt molekyl er allerede bekreftet av Proteomikk analyser24. For genetisk mediert knockout, eksklusjon og validering av bivirkninger er utfordrende og tidkrevende. I tillegg er en kjemisk indusert knockdown ...

De immunmodulerende stoffene (IMiDs) Thalidomid og dets analogs, lenalidomid og pomalidomide, alle godkjent for behandling av flere myelom, binder seg til E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), et substrat adapter for cullin4A-RING E3 ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. Binding av IMiDs forbedrer affinitet av CRL4CRBN til lymfoide transkripsjon faktorer Ikaros (IKZF1) og Aiolos (IKZF3), fører til deres ubiqitinering og degradering (figur 1)4,5, 6 andre priser , 7 andre er , 8. siden IKZF1 og IKZF3 er avgjørende for flere myelom celler, deres inaktive resultater i veksthemming. SALL4 ble nylig funnet som en ekstra IMiD-indusert neo-substrat av CRBN som er sannsynlig ansvarlig for teratogenisitet og den såkalte Contergan katastrofe i 1950 forårsaket av Thalidomid9,10. I kontrast, kasein kinase 1 α (CK1α) er et lenalidomid-spesifikt substrat for CRBN som er innblandet i den terapeutiske effekten i myelodysplastisk syndrom med kromosom 5q slettinger11.
Evne til små molekyler til å målrette et bestemt protein for degradering er en spennende konsekvens for moderne narkotika utvikling. Mens mekanismen for Thalidomid og dens analogs ble oppdaget etter deres første bruk i mennesker, såkalt proteolysis taRgeting Chimeras (PROTACs) har blitt designet for å spesifikt MÅLRETTE et protein av interesse (POI) (figur 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs er heterobifunctional molekyler som består av en bestemt ligand for POI koblet via en linker til en ligand av en E3 ubiquitin ligase som CRBN eller von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. PROTACs induserer dannelsen av et forbigående trefoldig kompleks, dirigere POI til E3 ubiquitin ligase, noe som resulterer i sin ubiqitinering og proteasomal degradering. De store fordelene med PROTACs over konvensjonelle hemmere er at binding til et POI er tilstrekkelig snarere enn dens hemming og derfor PROTACs kan potensielt målrette et langt bredere spekter av proteiner, inkludert de som ble ansett for å være undruggable som transkripsjon faktorer15. I tillegg chimeric molekyler handle katalytisk og derfor har en høy potens. Etter ubiquitin overføring til POI, den trefoldig komplekse dissociates og er tilgjengelig for dannelsen av nye komplekser. Dermed svært lave PROTAC konsentrasjoner er tilstrekkelig for nedbrytning av målet protein23.
Her beskriver vi syntesen av en pomalidomide-pomalidomide bøyd homo-PROTAC (sammensatt 8) som rekrutterer CRBN for nedbrytning av seg selv24. E3 ubiquitin ligase CRBN fungerer både som rekrutterer og mål samtidig (Figur 3). For å validere våre data, har vi også syntetisert en negativ bindende kontroll (sammensatt 9). Våre data bekrefter at den nylig syntetisert homo-PROTAC er spesifikk for CRBN degradering og har bare minimale effekter på andre proteiner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

Den immunmodulerende narkotika (IMiDs) Thalidomid og dets analogs, lenalidomid og pomalidomide, alle FDA godkjente legemidler for behandling av flere myelom, indusere ubiqitinering og degradering av lymfoide transkripsjon faktorene Ikaros (IKZF1) og Aiolos (IKZF3) via cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ligase for proteasomal degradering. IMiDs har nylig blitt benyttet for generering av bifunctional proteinolyse målretting chimeras (PROTACs) å målrette andre proteiner for ubiqitinering og proteasomal degradering av CRBN E3 ligase. Vi designet og syntetisert pomalidomide homobifunctional PROTACs og analyserte deres evne til å indusere selv-regissert ubiqitinering og degradering av CRBN. Her, CRBN fungerer som begge, den E3 ubiquitin ligase og målet på samme tid. Homo-PROTAC sammensatte 8 forringer CRBN med høy potens med bare minimale gjenværende effekter på IKZF1 og IKZF3. CRBN deaktivering av sammensatte 8 hadde ingen effekt på celle levedyktighet og spredning av ulike flere myelom cellelinjer. Denne homo-PROTAC opphever virkningene av IMiDs i flere myelom celler. Derfor, våre homodimeric pomalidomide-basert forbindelser kanskje hjelpe å identifisere CRBN ' endogene underlag og fysiologisk funksjonene og etterforske det molekylær mekanikk av IMiDs.

Her har vi beskrevet design, syntese og biologisk evaluering av en homodimeric pomalidomide-basert PROTAC for nedbrytning av CRBN. Våre PROTAC samhandler samtidig med to CRBN molekyler og former trefoldig komplekser som induserer selv-ubiqitinering og proteasomal degradering av CRBN med bare minimale gjenværende effekter på pomalidomide-indusert neo-underlag IKZF1 eller IKZF3.
Ut av en serie av tidligere utgitte pomalidomide-...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Dette arbeidet beskriver syntese og karakterisering av en pomalidomide-basert, bifunctional homo-PROTAC som en ny tilnærming for å indusere ubiqitinering og degradering av E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), målet for Thalidomid analogs.

Kjemisk deaktivering av E3 Ubiquitin Ligase Cereblon av Pomalidomide-baserte homo-PROTACs

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Våre homodimeriske PROTACer er de første kjemiske hemmere av Cereblon og kan bidra til å ytterligere belyse den molekylære mekanismen for thalidomidanaloger, samt å undersøke den fysiologiske funksjonen til Cereblon. Denne nye PROTAC-plattformteknologien kan være svært nyttig for spesielt målretting av proteiner av interesse som ellers anses å være usporbare. CRBN hemming alene har ingen anti-tumor aktivitet.CRBN-degradere kan imidlertid ha kliniske implikasjoner i fedme, smittsomme sykdommer og andre lidelser. Syntesen er utfordrende, og det er vanskelig å finne optimale linkers og vedlegg for å generere effektive proteinforringelser når du utformer en PROTAC-forbindelse. Til å begynne med, legg 2,46 gram Boc-beskyttet L-glutamin og 50 milliliter tetrahydrofuran i en 100 milliliter rundbunnet kolbe, og rør ved 800 o/min i ett minutt.Deretter legger du til 1,95 gram 1, 1'karbonyldiimidazol og en katalytisk mengde 4-pyridin. Fortsett omrøringen i 10 timer ved refluks for å oppnå en klar fargeløs løsning av glutarimidforbindelse. La løsningen avkjøles til romtemperatur, og fjern løsningsmidlet med en roterende fordamper.Redissolve rester i 200 milliliter etylacetat og hell den i en separatory trakt. Vask det organiske laget med 50 milliliter hver av deionisert vann og saltlake, og tørk det organiske laget over natriumsulfat. Tyngdekraften filtrerer løsningen gjennom silikagel for å fjerne tørkemidlet, og skyll deretter silikagelen med 200 milliliter etylacetat.Fjern oppløsningsvæsken fra filtratet under vakuum for å oppnå Compound 1 som et fargeløst fast stoff. Tørk produktet under vakuum over natten før du bruker det. Deretter oppløs 0,50 gram natriumacetat i 20 milliliter glacial eddiksyre i en 100 milliliter rund bunnkolbe utstyrt med en rørebar.Tilsett 1,25 gram 3-fluoroftalisk anhydrid og 1,14 gram glutarimid og rør ved refluks i seks timer for å få en lilla løsning av Compound 3. La blandingen avkjøles til romtemperatur, og hell den deretter i 100 milliliter av deionisert vann og rør i 10 minutter for å utløse Compound 3. Samle fast ved filtrering, vask den med vann og petroleumeter, og tørk det under vakuum i to dager.Deretter plasserer du 0,83 gram compound tre og 20 milliliter tørr dimetylsulfoksid i en 50 milliliter Schlenk kolbe og rør i to minutter. Tilsett 0,22 gram alfa omega diamin linker Compound 6, og 1,05 milliliter N, N-diisopropylethylamine og rør blandingen under argon på 90 grader celsius i 18 timer for å få Homodimer 8 i en mørk grønn blanding. La blandingen avkjøles til romtemperatur og hell den i 100 milliliter avionisert vann.Trekk ut produktet i tre 50 milliliter porsjoner etylacetat, kombiner de organiske lagene og vask dem med 50 milliliter hver av vann og saltlake. Tørk det vasket organiske laget over natriumsulfat, filtrer ut tørkemidlet og fjern oppløsningsvæsken under vakuum. Redissolve rester i en minimal mengde kromatografi løsemiddel og gjelder for en silika gel kolonne for rensing.Samle fluorescerende produktfraksjoner, kombinere dem, og fjern løsningsmidlet for å oppnå Homodimer 8 som en gul fast. Til å begynne, oppløse 2,28 gram Glutarimid 1 i 25 milliliter dimetylformamid i en 100 milliliter rund bunn kolbe. Suspender 2,76 gram malt kaliumkarbonat i denne løsningen.Deretter trekker du 0,62 milliliter iodometan inn i en sprøyte utstyrt med en 20-gauge nål. Tilsett iodometan drop-wise i løpet av 10 sekunder. Stopper kolben med en gummisepum, og legg til en vent nål.Sonicate blandingen i to timer ved romtemperatur for å oppnå Glutarimid Compound 2. Fortynn blandingen med 50 milliliter etylacetat og hell den i en separattor trakt. Skyll kolben inn i trakten med ytterligere 50 milliliter etylacetat.Arbeid opp produktet og rense det med silika gel kolonne kromatografi for å oppnå Glutarimide 2 som en fargeløs solid. Sammenlign oppbevaringstider for Glutarimide Forbindelser 1 og 2 for å bekrefte at N-metylering var vellykket. For å begynne valideringen, behandle flere myelomceller med forbindelser av interesse.Isoler de relevante proteinene, og lag prøver for en Western Blot-analyse av proteinnedbrytning. Deretter tilbereder du en gelsandwich til SDS-PAGE og fyller anodebuffertanken med en pH 8.9 tris-HCl-løsning. Last proteinprøvene inn i gelen og kjør den på 70 Volt i 20 minutter, etterfulgt av 115 volt i 150 minutter.Deretter klargjør 1x overføringsbuffer for immunoblotting og forsiktig flytte gelen fra kassetten til overføringsbufferen for å likevekt. Du må være veldig forsiktig når du fjerner gelen fra kassetten for likevekt, fordi den kan sprekke og krølle veldig raskt. Senk en 0,45 mikrometerpolyvinyliden difluoridemembran i ren metanol i minst 20 sekunder for å aktivere den, og senk den deretter ned i 1x overføringsbuffer.La gelen og membranen likevekt i 10 minutter. Deretter monterer du Western Blotting-kassetten og påfør 180 milliampere i 90 minutter for å overføre proteinene til membranen. Etterpå visualiserer proteinene ved å immunstaining.For å evaluere effektene på celle levedyktighet, først, frø 50, 000 multippelt myelom celler per brønn av en 96 brønnplate i biologisk triplicate. Legg til hver brønn 100 mikroliter medier som inneholder DMSO, eller en 0.1, en eller 10 mikromolar av Compound 8, Compound 9, eller pomalidomide. For å utføre celle levedyktighet redningseksperiment, i stedet behandle cellene med en 100 nanomolar løsning av Compound 8 i tre timer, enten før eller etter å legge til en en mikromolar løsning av pomalidomid.Inkuber cellene i 24, 48 eller 96 timer ved 37 grader celsius i en 5% karbondioksidatmosfære, og mål celle levedyktighet med en selvlysende analyse. Strukturen av homodimeric PROTAC 8 ble bekreftet med proton og karbon NMR. Heterodimerisk PROTAC 9 ble syntetisert som en negativ kontroll, da N-metylering i glutarimiddelen resulterer i tap av Cereblon, eller CRBN, bindingsevne.Homo PROTAC 8 indusert nær fullstendig proteosomal CRBN nedbrytning med minimal effekt på lymfoide transkripsjonsfaktorene IKZF1 og IKZF3. I motsetning viste hetero PROTAC 9 atferd som ligner pomalidomider. Sammensatt 8 indusert CRBN nedbrytning kan blokkeres av en direkte hemmer av proteasom, eller indirekte blokkert av netylation hemming.Celler som var forhåndsbehandlet med sammensatt 8, motsto signifikant effekten av pomalidomid på IKZF1 og IKZF3. Sammensatt 8 indusert CRBN nedbrytning hadde mye mindre effekt på multippelt myelomcelle levedyktighet etter 96 timer enn IKZF1 og IKZF3 nedbrytning fra sammensatt 9 og pomalidomid gjorde. Multippelt myelomceller som var forbehandlet med sammensatt 8 hadde signifikant større levedyktighet når de ble utsatt for pomalidomid enn ubehandlede celler, noe som tyder på at Sammensatt 8 kunne brukes til å etterligne immunmodulerende IMiD-legemiddelresistens.Vi fant at Compound 8 induserer fullstendig proteasomal nedbrytning av Cereblon, har ingen bivirkninger på IKZF1 og IKZF3 celle levedyktighet og spredning. Å utvide prosjektteknologien til andre mål har potensial for inaktivering og sporing av proteiner relatert til kreft og andre sykdommer. Når man tilpasser denne teknikken for andre legemidler og proteiner, bør man nøye undersøke stoffets molekylære strukturer og proteinmålet for å velge de optimale linkers og vedlegg.IMiDene vil ikke fungere hos mus på grunn av en punktmutasjon i Cereblon, men det finnes en transgen knock-in musemodell som kan brukes til videre dyrestudier. Siden pomalidomid er et analogt thalidomid, som er svært teratogene, anbefaler vi ikke gravide kvinner som arbeider med disse stoffene.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami Inspirert Self-montering av mønstret og rekonfigurerbar Partikler

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A fra Gram-negative bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forbereder Adherent Cells for X-ray fluorescens Imaging ved Kjemisk Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Chemical Vapor Nedfall av en organisk Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Utarbeidelse av svært porøs Coordination Polymer Belegg på macroporous Polymer Monoliths for økt berikelse av fosforpeptidene

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Preparation of Macroporous Epitaxial Quartz Films on Silicon by Chemical Solution Deposition

Utarbeidelse av macroporous epitaxial Quartz Spillefilmer på Silicon ved kjemisk løsning Nedfall

This work describes the detailed protocol for preparing piezoelectric macroporous epitaxial quartz films on silicon(100) substrates. This is a three-step ...

Epitaxial Growth of Perovskite Strontium Titanate on Germanium via Atomic Layer Deposition

Epitaxial Vekst av Perovskite strontium titanate på Germanium via Atomic Layer Nedfall

Atomic layer deposition (ALD) is a commercially utilized deposition method for electronic materials. ALD growth of thin films offers thickness control and ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Synthesis of Worm-lignende Miceller av synlig lys mediert dispersjonspolymeriseringen Bruke Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...