Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 e SFB-1074 para J.K.; FOR2372 para a)

1. preparação de moléculas PROTAC
Atenção: por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança (MSDS) relevantes antes de usar. Diversos dos produtos químicos usados nestas sínteses são tóxicos e carcinogénicos. Por favor, use todas as práticas de segurança apropriadas e equipamentos de proteção pessoal.
<ol><li>Preparação de carbamato de tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) (composto 1)
	<ol>
<li>Adicionar 1, 1 '-carbonildiimidazol ...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation.">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li><li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs:+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation.">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).</li><li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

O projeto de tais Homo-protacs como descrito aqui para crbn confia na afinidade específica do pomalidomida ao crbn, que foi utilizado com sucesso em protacs heterobifunctional numerosos e conduziu ao desenvolvimento de ProTac 8 como altamente degradador seletivo de CRBN. A especificidade de nossa molécula já foi confirmada por análises proteômicas24. Para nocaute geneticamente negociado, exclusão e validação de efeitos colaterais é desafiador e demorado. Além disso, um k...

Os fármacos imunomoduladores (IMiDs) talidomida e seus análogos, lenalidomida e pomalidomida, todos aprovados para o tratamento do mieloma múltiplo, ligam-se ao E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN), um adaptador de substrato para cullin4A-RING E3 ligase de ubiquitina (CRL4crbn)1,2,3. A vinculação de imids aumenta a afinidade deCRL4 crbn aos fatores de transcrição linfoide Ikaros (IKZF1) e Aiolos (IKZF3), levando à sua ubiquitinação e degradação (Figura 1)4,5, 6 anos de , 7 anos de , 8. Since IKZF1 e IKZF3 são essenciais para pilhas múltiplas do mieloma, seus resultados da inactivação na inibição do crescimento. SALL4 foi encontrado recentemente como um neosubstrato Imid-induzido adicional do crbn que é provável responsável para o teratogenicidade e a catástrofe assim chamada de Contergan nos 1950s causados por talidomida9,10. Em contraste, a caseína quinase 1 α (CK1α) é um substrato específico da lenalidomida de CRBN que está implicado no efeito terapêutico na síndrome mielodisplásica com deleções do cromossomo 5q11.
A capacidade de pequenas moléculas para atingir uma proteína específica para a degradação é uma implicação emocionante para o desenvolvimento de drogas modernas. Embora o mecanismo de talidomida e seus análogos foi descoberto após seu primeiro uso em seres humanos, assim chamado PROteólise targeting Chimeras (protacs) foram projetados para direcionar especificamente uma proteína de interesse (POI) (Figura 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs são as moléculas heterobifuncionais que consistem em um ligante específico para o POI conectado através de um linker a um ligante de uma ligase da ubiquitina E3 como crbn ou von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Protacs induzem a formação de um complexo ternário transitório, direcionando o POI para a ligase da ubiquitina E3, resultando em sua ubiquitinação e degradação degradação. As principais vantagens do PROTACs sobre os inibidores convencionais é que a ligação a um POI é suficiente, em vez de sua inibição e, portanto, PROTACs pode potencialmente alvo de um espectro muito maior de proteínas, incluindo aqueles que foram considerados undruggable como fatores de transcrição15. Além disso, as moléculas quiméricas atuam catalisando e, portanto, têm uma alta potência. Após a transferência do ubiquitin ao POI, o complexo ternário dissocia e está disponível para a formação de complexos novos. Assim, as concentrações muito baixas de PROTAC são suficientes para a degradação da proteína-alvo23.
Aqui nós descrevemos a síntese de um pomalidomide-pomalidomide conjugado Homo-ProTac (composto 8) que recruta crbn para a degradação DSE24. A ligase da ubiquitina E3 CRBN atua como recrutador e alvo ao mesmo tempo (Figura 3). Para validar nossos dados, também sintetizamos um controle de ligação negativa (composto 9). Nossos dados confirmam que o recém-sintetizado Homo-PROTAC é específico para a degradação de CRBN e tem somente efeitos mínimos em outras proteínas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

Os fármacos imunomoduladores (IMiDs) talidomida e seus análogos, lenalidomida e pomalidomida, todos os fármacos aprovados pela FDA para o tratamento do mieloma múltiplo, induzem a ubiquitinação e degradação dos fatores de transcrição linfoide Ikaros (IKZF1) e Aiolos (IKZF3) através da ligase da ubiquitina do Cereblon (crbn) E3 para a degradação degradação. Imids têm sido utilizados recentemente para a geração de proteólise bifuncional visando quimeras (protacs) para direcionar outras proteínas para a ubiquitinação e degradação degradação pela ligase da crbn E3. Foram projetados e sintetizados os PROTACs homobifuncionais à base de pomalidomida e analisados sua capacidade de induzir a ubiquitinação e degradação autodirigida de CRBN. Aqui, o CRBN serve como ambos, a ligase da ubiquitina E3 e o alvo ao mesmo tempo. O composto de Homo-PROTAC 8 degrada o crbn com uma potência elevada com somente efeitos permanecendo mínimos em IKZF1 e em IKZF3. A inactivação de crbn pelo composto 8 não teve nenhum efeito na viabilidade da pilha e na proliferação de linhas de pilha múltiplas diferentes do mieloma. Este Homo-ProTac AB roga os efeitos de imids em pilhas múltiplas do mieloma. Portanto, nossos compostos à base de pomalidomida bacteriana podem ajudar a identificar os substratos endógenos e as funções fisiológicas da crbn e investigar o mecanismo molecular dos imids.

Aqui nós descrevemos o projeto, a síntese e a avaliação biológica de um ProTac bacteriana do pomalidomide-baseado para a degradação de CRBN. Nosso ProTac interage simultaneamente com duas moléculas de crbn e forma complexos ternários que induz a degradação de autoubiquitinação e degradação de crbn com apenas efeitos remanescentes mínimos sobre os neosubstratos induzidos por pomalidomida IKZF1 ou IKZF3.
De uma sé...

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Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Este trabalho descreve a síntese e caracterização de um Homo-PROTAC bifuncional, com base em pomalidomida, como uma nova abordagem para induzir a ubiquitinação e a degradação do E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN), alvo de análogos da talidomida.

Inativação química da E3 ubiquitina ligase Cereblon por Homo-PROTACs à base de Pomalidomida

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Nossos PROTACs homodimeric são os primeiros inibidores químicos do Cereblon e podem ajudar a elucidar ainda mais o mecanismo molecular dos análogos da talidomida, bem como para investigar a função fisiológica de Cereblon. Esta nova tecnologia de plataforma PROTAC pode ser altamente útil para direcionar especificamente proteínas de interesse que de outra forma são consideradas inalcláveis. Só a inibição do CRBN não tem atividade anti-tumor.No entanto, os degradadores do CRBN podem ter implicações clínicas na obesidade, doenças infecciosas e outros transtornos. A síntese é desafiadora e é difícil encontrar conectores e apego ideal para gerar degradadores de proteína eficazes ao projetar um composto PROTAC. Para começar, coloque 2,46 gramas de L-glutamina protegida por Boc e 50 mililitros de tetrahidrofuran em um frasco de fundo redondo de 100 mililitros, e mexa a 800 rpm por um minuto.Em seguida, adicione 1,95 gramas de 1, 1'carbonyldiimidazol e uma quantidade catalítica de 4 piridinas. Continue mexendo por 10 horas no refluxo para obter uma solução incolor clara do composto glutarimídeo. Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente e remova o solvente com um evaporador rotativo.Redissolve o resíduo em 200 mililitros de acetato de etila e despeje-o em um funil separador. Lave a camada orgânica com 50 mililitros cada de água deionizada e salmoura, e seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio. A gravidade filtra a solução através do gel de sílica para remover o dessecante e, em seguida, enxágue o gel de sílica com 200 mililitros de acetato de etila.Remova o solvente do filtrado sob vácuo para obter o composto 1 como um sólido incolor. Seque o produto sob vácuo durante a noite antes de usá-lo. Em seguida, dissolva 0,50 gramas de acetato de sódio em 20 mililitros de ácido acético glacial em um frasco de fundo redondo de 100 mililitros equipado com uma barra de agitação.Adicione 1,25 gramas de anidrido fluorofálico e 1,14 gramas de glutarimida e mexa no refluxo por seis horas para obter uma solução roxa do Composto 3. Deixe a mistura esfriar até a temperatura ambiente, e depois despeje-a em 100 mililitros de água desionizada e mexa por 10 minutos para precipitar o Composto 3. Recolher o sólido por filtragem, lavá-lo com água e éter de petróleo, e secá-lo sob vácuo por dois dias.Em seguida, coloque 0,83 gramas de Composto Três e 20 mililitros de sulfóxido de dimetil seco em um frasco schlenk de 50 mililitros e mexa por dois minutos. Adicione 0,22 gramas de alfa ômega diamine linker Composto 6, e 1,05 mililitros de N, N-diisopropylethylamina e mexa a mistura sob argônio a 90 graus celsius por 18 horas para obter Homodimer 8 em uma mistura verde escura. Deixe a mistura esfriar à temperatura ambiente e despeje-a em 100 mililitros de água deionizada.Extraia o produto em três porções de 50 mililitros de acetato etílico, combine as camadas orgânicas e lave-as com 50 mililitros cada de água e salmoura. Seque a camada orgânica lavada sobre sulfato de sódio, filtre o dessecante e remova o solvente sob vácuo. Redissolve o resíduo em uma quantidade mínima de solvente de cromatografia e aplique em uma coluna de gel de sílica para purificação.Colete as frações fluorescentes do produto, combine-as e remova o solvente para obter o Homodimer 8 como um sólido amarelo. Para começar, dissolva 2,28 gramas de Glutarimide 1 em 25 mililitros de dimetilformamida em um frasco de fundo redondo de 100 mililitros. Suspenda 2,76 gramas de carbonato de potássio moído nesta solução.Em seguida, desenhe 0,62 mililitros de iodometano em uma seringa equipada com uma agulha de calibre 20. Adicione o iodometano em termos de queda ao longo de 10 segundos. Roe o frasco com um septo de borracha, e adicione uma agulha de ventilação.Sonicar a mistura por duas horas à temperatura ambiente para obter o Composto glutarimídeo 2. Diluir a mistura com 50 mililitros de acetato etílico e despeje-a em um funil separador. Enxágüe o frasco no funil com outros 50 mililitros de acetato etílico.Trabalhe o produto e purifique-o com cromatografia de coluna de gel de sílica para obter Glutarimide 2 como um sólido incolor. Compare os tempos de retenção dos Compostos glutarimídeos 1 e 2 para confirmar que a n-metilação foi bem sucedida. Para iniciar a validação, trate múltiplas células de mieloma com os compostos de interesse.Isole as proteínas relevantes e prepare amostras para uma análise de Western Blot da degradação da proteína. Em seguida, prepare um sanduíche de gel para SDS-PAGE e encha o tanque tampão de ânodo com uma solução de pH 8.9 tris-HCl. Carregue as amostras de proteína no gel e execute-as a 70 Volts por 20 minutos, seguidas por 115 volts por 150 minutos.Em seguida, prepare o tampão de transferência 1x para imunoblotting e mova cuidadosamente o gel de seu para o buffer de transferência para equilibrar. Você tem que ter muito cuidado quando você remover o gel da fita para equilíbrio, porque ele pode estourar e amassar muito rapidamente. Mergulhe uma membrana de difluoreto de polivinida de 0,45 micrômetro em metanol puro por pelo menos 20 segundos para ativá-lo e, em seguida, imergi-lo em 1x tampão de transferência.Deixe o gel e a membrana equilibrarem por 10 minutos. Em seguida, monte o Western Blotting e aplique 180 miliamperes por 90 minutos para transferir as proteínas para a membrana. Depois, visualize as proteínas imunosteando.Para avaliar os efeitos sobre a viabilidade celular, primeiro, sementes 50.000 células de mieloma múltiplo por poço de uma placa de 96 poços em triplicado biológico. Adicione a cada poço 100 microliters de mídia contendo DMSO, ou um 0.1, um ou 10 micromolar de Composto 8, Composto 9 ou pomalidomida. Para realizar o experimento de resgate de viabilidade celular, em vez disso, trate as células com uma solução de 100 nanomolars do Composto 8 por três horas, antes ou depois de adicionar uma solução micromolar de pomalidomida.Incubar as células por 24, 48 ou 96 horas a 37 graus celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono de 5%, e medir a viabilidade celular com um ensaio luminescente. A estrutura do homodimeric PROTAC 8 foi confirmada com próton e carbono NMR. O HEterodimerico PROTAC 9 foi sintetizado como um controle negativo, pois a metilação N dentro da porção de glutarimida resulta em perda de Cereblon, ou CRBN, capacidade de ligação.O homo PROTAC 8 induziu a degradação proteosômica do CRBN quase completa com efeitos mínimos sobre os fatores de transcrição linfoide IKZF1 e IKZF3. Em contraste, o hetero PROTAC 9 apresentou comportamento semelhante aos pomalidomides. A degradação do CRBN induzido pelo composto 8 pode ser bloqueada por um inibidor direto do proteasome, ou indiretamente bloqueada pela inibição da rede.As células pré-tratadas com composto 8 resistiram significativamente aos efeitos da pomalidomida no IKZF1 e IKZF3. A degradação do CRBN induzido composto 8 teve muito menos efeito na viabilidade celular de mieloma múltiplo após 96 horas do que a degradação do IKZF1 e do IKZF3 do Composto 9 e pomalidomida. Múltiplas células de mieloma pré-tratadas com composto 8 apresentaram viabilidade significativamente maior quando expostas à pomalidomida do que células não tratadas, sugerindo que o Composto 8 poderia ser usado para imitar a resistência a medicamentos IMiD imunomodulatórios.Descobrimos que o Composto 8 induz a degradação proteassômica completa do Cereblon, não tem efeitos colaterais na viabilidade e proliferação celular IKZF1 e IKZF3. Estender a tecnologia do projeto para outros alvos tem potencial para inativar e rastrear proteínas relacionadas ao câncer e outras doenças. Ao adaptar esta técnica para outras drogas e proteínas, deve-se investigar cuidadosamente as estruturas moleculares da droga e o alvo proteico para escolher os conectores e acessórios ideais.Os IMiDs não funcionarão em camundongos por causa de uma mutação pontual no Cereblon, mas existe um modelo de rato transgênico que pode ser usado para estudos em animais. Como a pomalimida é uma talidomida analógica, que é altamente teratogênica, não recomendamos gestantes que trabalham com essas drogas.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Síntese Facile de micelas Worm-like por luz visível Mediated Dispersão Polimerização Usando Photoredox Catalisador

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...