Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (Программа Эмми-Ноэтер Kr-3886/2-1 и SFB-1074 в J.K.; FOR2372 до M.G.)

1. Подготовка молекул PROTAC
ПРЕДУправление: Пожалуйста, проконсультируйтесь со всеми соответствующими листами данных о безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Некоторые из химических веществ, используемых в этих синтезах, являются токсичными и канцерогенными. П...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li><li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation+by+PROTACs.">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li><li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation.">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li><li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs:+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation.">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).</li><li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

Конструкция таких гомо-ПРОТАК, описанных здесь для CRBN, опирается на специфическую близость помалидомда к CRBN, которая успешно используется в многочисленных гетеробифункциональных ПРОТАКи и привела к развитию PROTAC 8 как высоко селективный деградер CRBN. Специфика нашей молекулы у...

Иммуномодулирующие препараты (IMiDs) талидомид и его аналоги, леналидомид и помалидомид, все одобренные для лечения множественной миеломы, связываются с E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), субстратным адаптером для cullin4A-RING E3 ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. Связывание ИМиД повышает сродство CRL4CRBN к лимфоидным транскрипционным факторам Ikaros (IK-F1) и Айолосу (Ik-F3), что приводит к их увсеквитизации и деградации(рисунок 1)4,5, 6 , 7 (г. , 8. В виду того что IK-F1 и IK-F3 необходимы для множественных клеток миеломы, их инактивация приводит к ингибированию роста. SALL4 был недавно найден в качестве дополнительного IMiD-индуцированного нео-субстрата CRBN, который, вероятно, несет ответственность за тератогенность и так называемую катастрофу Контерган в 1950-х годов, вызванных талидомид9,10. В отличие от этого, казеин киназы 1 "(CK1" является леналидомид-специфический субстрат CRBN, который вовлечен в терапевтический эффект в миелодиспластический синдром с хромосомой 5q делети11.
Способность малых молекул ориентироваться на конкретный белок для деградации является захватывающим следствием для современного развития лекарств. В то время как механизм талидомида и его аналогов был обнаружен после их первого использования в организме человека, так называемый Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) были разработаны специально для целевой белок, представляющий интерес (POI) (Рисунок 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs являются гетеробифункциональные молекулы, которые состоят из конкретного лиганд для POI подключен через ссылку на лиганд E3 убиквитин лигаза, как CRBN или фон-Гиппель-Линдау (VHL)18,19,20, 21,22. PROTACs индуцировать формирование переходного тернари комплекса, направляя POI к E3 убиквитин лигаза, в результате его повсеместности и протеасомальной деградации. Основные преимущества PROTACs по сравнению с обычными ингибиторами заключается в том, что связывание с POI является достаточным, а не его ингибирование и, следовательно, PROTACs потенциально может целевой гораздо более широкий спектр белков, включая те, которые считались неприсменяемыми, как транскрипции факторы15. Кроме того, химерные молекулы действуют каталитически и поэтому обладают высокой потенцией. После переноса убиквитина в POI, тернарийкомплекс отделяется и доступен для формирования новых комплексов. Таким образом, очень низких концентраций PROTAC достаточно для деградации целевого белка23.
Здесь мы описываем синтез pomalidomide-pomalidomide конъюгированный гомо-PROTAC (соединение 8), который набирает CRBN для деградации себя24. E3 ubiquitin ligase CRBN служит как вербовщики и цели в то же время (Рисунок 3). Для проверки наших данных мы также синтезировали отрицательный связывающий контроль (соединение 9). Наши данные подтверждают, что недавно синтезированный homo-PROTAC специфичен для деградации CRBN и оказывает лишь минимальное воздействие на другие белки.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

Иммуномодулирующие препараты (IMiDs) талидомид и его аналоги, леналидомид и помалидомид, все одобренные FDA препараты для лечения множественной миеломы, вызывают униквитивание и деградацию лимфоидных транскрипционных факторов Ikaros (IK-F1) и Aiolos (IK-F3) через цереблон (CRBN) E3 убиквитин лигаза для протеасомальной деградации. IMIDs недавно были использованы для генерации бифункционального протеолиза ориентации химер (PROTACs) для целевой других белков для убликвитина и протеасомальной деградации CRBN E3 лигазы. Мы разработали и синтезировали помалидомидна основе гомобифункциональных PROTACs и проанализировали их способность вызывать самостоятельной повсеместности и деградации CRBN. Здесь, CRBN служит как, E3 убиквитин лигаза и цель в то же время. Соединение гомо-ПРОТАК 8 ухудшает CRBN с высокой потенцией с минимальным оставшимся воздействием на Ik-F1 и IK-F3. Инактивация CRBN соединением 8 не оказала влияния на жизнеспособность клеток и пролиферацию различных линий клеток миеломы. Это гомо-PROTAC отменяет эффекты ИМИД в нескольких клетках миеломы. Таким образом, наши гомодимерные соединения на основе помалидомида могут помочь определить эндогенные субстраты и физиологические функции CRBN и исследовать молекулярный механизм ИМИД.

Здесь мы описали дизайн, синтез и биологическую оценку гомодимерного помалидомида на основе PROTAC для деградации CRBN. Наш PROTAC взаимодействует одновременно с двумя молекулами CRBN и формирует тернариальные комплексы, которые индуцируют самоубиквитинацию и протеасомальну...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Эта работа описывает синтез и характеристику помалидомида основе, бифункциональный гомо-PROTAC как новый подход, чтобы вызвать убиквитинирование и деградацию E3 убиквитин лигазе цереблон (CRBN), цель аналогов талидомида.

Химическая инактивация E3 Ubiquitin Ligase Cereblon по помалидомидной основе Homo-PROTACs

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Наши гомодимерные ПРОТАК являются первыми химическими ингибиторами Цереблона и могут способствовать дальнейшему выяснению молекулярного механизма аналогий талидомида, а также исследованию физиологической функции Цереблона. Эта новая технология платформы PROTAC может быть очень полезна для конкретного таргетинга белков, представляющих интерес, которые в противном случае считаются неопровержимыми. Ингибирование CRBN само по себе не имеет противоопухоевых действий.Тем не менее, CRBN деградаторы могут иметь клинические последствия в ожирении, инфекционных заболеваний и других расстройств. Синтез является сложной задачей, и трудно найти оптимальные связующие звенья и привязанности для создания эффективных деградаторов белка при проектировании соединения PROTAC. Для начала поместите 2,46 грамма защищенного Boc L-глутамина и 50 миллилитров тетрагидрофурана в 100-миллилитровую колбу с круглым дном и перемешайте при 800 об/мин в течение одной минуты.Затем добавьте 1,95 грамма 1, 1'carbonyldiimidazole и каталитическое количество 4-пиридина. Продолжить перемешивание в течение 10 часов в рефлюкс, чтобы получить четкий бесцветный раствор глутаримида соединения. Дайте раствору остыть до комнатной температуры и удалите растворитель с помощью роторного испарителя.Переделить остатки в 200 миллилитров этилового ацетата и вылить его в разделительную воронку. Вымойте органический слой с 50 миллилитров каждый из деионизированной воды и рассола, и высушить органический слой над сульфатом натрия. Гравитация фильтровать раствор через кремнезем гель для удаления desiccant, а затем промыть кремнезем гель с 200 миллилитров этилового ацетата.Удалите растворитель из фильтрата под вакуумом, чтобы получить соединение 1 в качестве бесцветного твердого тела. Высушите продукт под вакуумом на ночь перед его использованием. Затем растворите 0,50 грамма ацетата натрия в 20 миллилитров ледниковой уксусной кислоты в 100-миллилитровой колбе круглого дна, оснащенной батончиком для перемешивания.Добавьте 1,25 грамма 3-фторофталового ангидрида и 1,14 грамма глутаримида и перемешайте при рефлюксе в течение шести часов, чтобы получить фиолетовый раствор соединения 3. Пусть смесь остыть до комнатной температуры, а затем залить его в 100 миллилитров деионизированной воды и перемешать в течение 10 минут, чтобы осадки соединения 3. Соберите твердое тело путем фильтрации, промыть его водой и эфиром нефти, и высушить его в вакууме в течение двух дней.Затем поместите 0,83 грамма соединения 3 и 20 миллилитров сухого диметилфоксида в 50-миллилитровую колбу Шленка и перемешайте в течение двух минут. Добавить 0,22 грамма альфа-омега диамина linker соединение 6, и 1,05 миллилитров N, N-diisopropylethylamine и перемешать смесь под аргоном при 90 градусов по Цельсию в течение 18 часов, чтобы получить Homodimer 8 в темно-зеленой смеси. Дайте смеси остыть до комнатной температуры и вылейте ее в 100 миллилитров деионизированной воды.Извлеките продукт в три 50 миллилитров порций этилового ацетата, объедините органические слои и помойте их по 50 миллилитров воды и рассола. Высушите промытый органический слой над сульфатом натрия, отфильтруните десикант и удалите растворитель под вакуумом. Redissolve остатков в минимальном количестве хроматографии растворителя и применять к колонке кремнезема гель для очистки.Соберите флуоресцентные фракции продукта, объединить их, и удалить растворитель, чтобы получить Homodimer 8, как желтый твердый. Для начала растворите 2,28 грамма глутаримида 1 в 25 миллилитров диметилформамида в 100-миллилитровой колбе круглого дна. Приостановить 2,76 грамма измельченного карбоната калия в этом растворе.Затем нарисуйте 0,62 миллилитров идометанов в шприц, оснащенный иглой 20-го калибра. Добавьте iodomethane падение мудрый в течение 10 секунд. Остановите колбу с резиновой перегородкой и добавьте вентиляционную иглу.Sonicate смесь в течение двух часов при комнатной температуре, чтобы получить Glutarimide соединение 2. Разбавить смесь 50 миллилитров этилового ацетата и вылить его в сепаральную воронку. Промыть колбу в воронку еще 50 миллилитров этилового ацетата.Работа до продукта и очистить его с кремнезема гель колонки хроматографии для получения glutarimide 2 в качестве бесцветного твердого тела. Сравните время удержания глутаримидных соединений 1 и 2, чтобы подтвердить, что N-метилирование было успешным. Чтобы начать проверку, лечить несколько клеток миеломы с соединениями интереса.Изолировать соответствующие белки и подготовить образцы для западного анализа Blot деградации белка. Затем приготовьте сэндвич с гелем для SDS-PAGE и заполните анодный буферный бак раствором pH 8.9 tris-HCl. Загрузите образцы белка в гель и запустите его на 70 вольт в течение 20 минут, а затем 115 вольт в течение 150 минут.Затем подготовь 1x буфер передачи для иммуноблотинга и осторожно переместите гель из кассеты в буфер передачи для эквилибрата. Вы должны быть очень осторожны, когда вы удалите гель из кассеты для эквилибрации, потому что он может лопнуть и скомкать очень быстро. Погрузите 0,45 микрометровую поливинилидную дифторидовую мембрану в чистый метанол в течение не менее 20 секунд, чтобы активировать его, а затем погрузите его в 1x буфер передачи.Пусть гель и мембрана эквилибрировать в течение 10 минут. Затем соберите западную кассету Blotting и нанесите 180 миллиамперов в течение 90 минут, чтобы перенести белки на мембрану. После этого визуализируете белки с помощью иммуностимулятора.Чтобы оценить влияние на жизнеспособность клеток, во-первых, семена 50000 клеток множественной миеломы на колодец 96 пластины в биологической тройной. Добавьте к каждому колодец 100 микролитров средств массовой информации, содержащих DMSO, или 0,1, один или 10 микромоляров соединения 8, соединения 9 или помалидомида. Для выполнения эксперимента по спасению жизнеспособности клеток, вместо этого лечить клетки с 100 наномолярный раствор соединения 8 в течение трех часов, либо до или после добавления одного микромолярского раствора помалидомида.Инкубировать клетки в течение 24, 48, или 96 часов при 37 градусах по Цельсию в атмосфере 5%углекислого газа, и измерить жизнеспособность клеток с люминесцентным анализом. Структура гомодимерного PROTAC 8 была подтверждена протонной и углеродной ЯМР. Гетеродимерный PROTAC 9 был синтезирован как отрицательный контроль, так как N-метилирование в части глутаримида приводит к потере Цереблона, или CRBN, связывающей способности.Гомо PROTAC 8 индуцированных вблизи полной протеосомной деградации CRBN с минимальным воздействием на лимфоидные транскрипционные факторы ИКЗФ1 и ИКЗФ3. В отличие от этого, гетеро PROTAC 9 показал поведение, похожее на помалидомиды. Соединение 8 индуцированной деградации CRBN может быть заблокировано прямым ингибитором протеасомы, или косвенно заблокировано ингибированием нетилирования.Клетки, предварительно обработанные соединением 8, значительно сопротивлялись воздействию помалидомида на ИКЗФ1 и ИКЗФ3. Соединение 8 индуцированной деградации CRBN было гораздо меньше влияния на жизнеспособность клеток множественной миеломы после 96 часов, чем деградация ИКЗФ1 и ИКЗФ3 от соединения 9 и помалидомида сделал. Несколько клеток миеломы, предварительно обработанных соединением 8, имели значительно большую жизнеспособность при воздействии помалидомида, чем необработанные клетки, что позволяет предположить, что соединение 8 может быть использовано для имитации иммуномодулирующих IMiD лекарственной устойчивости.Мы обнаружили, что соединение 8 индуцирует полную протеасомную деградацию Цереблона, не имеет побочных эффектов на жизнеспособности и пролиферации клеток ИКЗФ3. Распространение технологии проекта на другие цели имеет потенциал для инактивации и отслеживания белков, связанных с раком и другими заболеваниями. При адаптации этого метода для других препаратов и белков, следует тщательно исследовать молекулярные структуры препарата и цели белка, чтобы выбрать оптимальные связующим звенья и вложения.IMiDs не будет работать у мышей из-за точечных мутаций в Цереблоне, но существует трансгенная модель мыши, которая может быть использована для дальнейших исследований на животных. Поскольку помалидомид является аналогом талидомида, который является высокотератогенным, мы не рекомендуем беременным женщинам, работающим с этими препаратами.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Вдохновленные оригами самосборки Узорчатое и Reconfigurable Частицы

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Выделение и химическая характеристика липида А из грамотрицательных бактерий

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Подготовка прилипшие клетки для рентгеновской флуоресценции изображений по химической фиксации

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Химическое осаждение из органической Магнит, ванадия тетрацианоэтиленом

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Подготовка высоко пористый Координационного полимерных покрытий на макропористых полимерных монолитов для повышенного обогащения фосфопептидов

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Preparation of Macroporous Epitaxial Quartz Films on Silicon by Chemical Solution Deposition

Подготовка МАКРОПОРИСТОГО эпитаксиальных пленок кварца на кремнии химический раствор осаждения

This work describes the detailed protocol for preparing piezoelectric macroporous epitaxial quartz films on silicon(100) substrates. This is a three-step ...

Epitaxial Growth of Perovskite Strontium Titanate on Germanium via Atomic Layer Deposition

Эпитаксиального роста перовскита титаната стронция на германии с помощью атомного слоя осаждения

Atomic layer deposition (ALD) is a commercially utilized deposition method for electronic materials. ALD growth of thin films offers thickness control and ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Синтез червеобразных мицелл с помощью видимого света опосредованного дисперсионной полимеризации с использованием Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...