Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 y SFB-1074 a J.K.; FOR2372 a M.G.)

1. Preparación de moléculas PROTAC
ADVERTENCIA: Consulte todas las fichas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de su uso. Varios de los productos químicos utilizados en estas síntesis son tóxicos y cancerígenos. Utilice todas las prácticas de seguridad y equipos de protección personal adecuados.
<ol><li>Preparación de carbamato tert-butilo N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)(compuesto 1)
	<ol>
<li>Añadir 1,1'-carbonyldiimidazol (1,95 ...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li><li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation+by+PROTACs.">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li><li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation.">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li><li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs:+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation.">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).</li><li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

El diseño de tales homo-PROTAC como se describe aquí para CRBN se basa en la afinidad específica de la pomalidomida con CRBN, que se ha utilizado con éxito en numerosos PROTAC heterobifuncionales y dio lugar al desarrollo de PROTAC 8 como un altamente degradador selectivo de CRBN. La especificidad de nuestra molécula ya ha sido confirmada por los análisis proteómicos24. Para el knockout genéticamente mediado, la exclusión y validación de los efectos secundarios es difíc...

La litimida de los fármacos inmunomoduladores (IID) y sus análogos, lenalidomida y pomalidomida, todos aprobados para el tratamiento del mieloma múltiple, se unen a la e3 ubiquitina ligreblon (CRBN), un adaptador de sustrato para cullin4A-RING E3 ubiquitina ligerina (CRL4CRBN)1,2,3. La unión de los IMID mejora la afinidad de CRL4CRBN con los factores de transcripción linfoide Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3), lo que lleva a su ubiquitinación y degradación (Figura1)4,5, 6 , 7 , 8. Dado que IKZF1 e IKZF3 son esenciales para múltiples células de mieloma, sus resultados de inactivación en la inhibición del crecimiento. SALL4 fue encontrado recientemente como un neo-sustrato adicional inducido por el IMiD de CRBN que es probablemente responsable de la teratogenicidad y la llamada catástrofe de Contergan en la década de 1950 causada por talidomida9,10. Por el contrario, la caseína quinasa 1o (CK1o) es un sustrato específico de lenalidomida de CRBN que está implicado en el efecto terapéutico en el síndrome mielodisplásico con deleciones del cromosoma 5q11.
La capacidad de las moléculas pequeñas para apuntar a una proteína específica para la degradación es una implicación emocionante para el desarrollo de fármacos modernos. Mientras que el mecanismo de talidomida y sus análogos fue descubierto después de su primer uso en humanos, los llamados Proteólisis Targeting Chimeras (PROTACs) han sido diseñados para apuntar específicamente a una proteína de interés (POI) (Figura 2)12,13,14,15,16,17,18. Los PROTACACs son moléculas heterobifuncionales que consisten en un ligando específico para el PDI conectado a través de un vinculador a un ligando de una ligasa de ubiquitina E3 como CRBN o von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Los PROTAC inducen la formación de un complejo ternario transitorio, dirigiendo el PDI a la ligasa de ubiquitina E3, lo que resulta en su ubiquitinación y degradación proteasomal. Las principales ventajas de los PROTAC sobre los inhibidores convencionales es que la unión a un PDI es suficiente en lugar de su inhibición y, por lo tanto, los PROTAC pueden potencialmente apuntar a un espectro mucho más amplio de proteínas, incluidas las que se consideraron ingodibles como factores de transcripción15. Además, las moléculas quiméricas actúan catalíticamente y por lo tanto tienen una alta potencia. Después de la transferencia de ubiquitina al PDI, el complejo ternario se disocia y está disponible para la formación de nuevos complejos. Por lo tanto, las concentraciones muy bajas de PROTAC son suficientes para la degradación de la proteína diana23.
Aquí describimos la síntesis de un homo-PROTAC conjugado conjugado pomalidomida-pomalidomida (compuesto 8)que recluta CRBN para la degradación de sí mismo24. El CRBN de la ligasa de ubiquitina E3 sirve como reclutador y objetivo al mismo tiempo (Figura3). Para validar nuestros datos, también sintetizamos un control de enlace negativo (compuesto 9). Nuestros datos confirman que el homo-PROTAC recién sintetizado es específico para la degradación de CRBN y sólo tiene efectos mínimos en otras proteínas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

La talidomida de los fármacos inmunomoduladores (IMID) y sus análogos, lenalidomida y pomalidomida, todos los medicamentos aprobados por la FDA para el tratamiento del mieloma múltiple, inducen ubiquitinación y degradación de los factores de transcripción linfoide Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3) a través de la ligasa de ubiquitina cereblon (CRBN) E3 para la degradación proteasomal. Los IMID se han utilizado recientemente para la generación de proteólisis bifuncional dirigida a quimeras (PROTAC) para apuntar a otras proteínas para la ubiquitinación y la degradación proteasomal por la ligasa CRBN E3. Diseñamos y sintetizamos PROTACfuncionales basados en pomalidomida y analizamos su capacidad para inducir la ubiquitinación autodirigida y la degradación de CRBN. Aquí, CRBN sirve como ambos, la ligada a la ubiquitina E3 y el objetivo al mismo tiempo. El compuesto homo-PROTAC 8 degrada CRBN con una alta potencia con sólo efectos restantes mínimos sobre IKZF1 e IKZF3. La inactivación de CRBN por compuesto 8 no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular y la proliferación de diferentes líneas celulares de mieloma múltiple. Este homo-PROTAC deroga los efectos de los ID En múltiples células de mieloma. Por lo tanto, nuestros compuestos homodíricos a base de pomalidomida pueden ayudar a identificar los sustratos endógenos y las funciones fisiológicas de CRBN e investigar el mecanismo molecular de los IMID.

Aquí describimos el diseño, síntesis y evaluación biológica de un PROTAC homodimérico basado en pomalidomida para la degradación de CRBN. Nuestro PROTAC interactúa simultáneamente con dos moléculas CRBN y forma complejos ternarios que inducen la autoubiquitinación y la degradación proteasomal de CRBN con sólo efectos mínimos restantes sobre neo-sustratos inducidos por pomalidomida IKZF1 o IKZF3.
De una serie de mol...

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Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Este trabajo describe la síntesis y caracterización de un homo-PROTAC bifuncional basado en pomalidomida como un enfoque novedoso para inducir la ubiquitinación y degradación de la e3 ubiquitina ligreblon (CRBN), el objetivo de los análogos de la talidomida.

Inactivación química del E3 Ubiquitin Ligase Cereblon por Homo-PROTACs basados en Pomalidomida

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Nuestros PROTAC homodiméricos son los primeros inhibidores químicos de Cereblon y pueden ayudar a dilucidar aún más el mecanismo molecular de los análogos de talidomida, así como a investigar la función fisiológica de Cereblon. Esta nueva tecnología de plataforma PROTAC puede ser muy útil para apuntar específicamente a proteínas de interés que de otro modo se consideran incontrolables. La inhibición de CRBN por sí sola no tiene actividad antitumorátuma.Sin embargo, los degradantes del CRBN pueden tener implicaciones clínicas en la obesidad, enfermedades infecciosas y otros trastornos. La síntesis es desafiante y es difícil encontrar enlaces y unión óptimos para generar degradadores de proteínas eficaces al diseñar un compuesto PROTAC. Para empezar, coloque 2,46 gramos de L-glutamina protegida por boc y 50 mililitros de tetrahidrofurano en un matraz de fondo redondo de 100 mililitros, y revuelva a 800 rpm durante un minuto.A continuación, añadir 1,95 gramos de 1, 1'carbonyldiimidazol y una cantidad catalítica de 4-piridina. Continúe revolviendo durante 10 horas al reflujo para obtener una solución transparente e incolora de compuesto de glutrimida. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente y retire el disolvente con un evaporador rotatorio.Redissolve el residuo en 200 mililitros de acetato de etilo y vierta en un embudo separador. Lavar la capa orgánica con 50 mililitros cada uno de agua desionizada y salmuera, y secar la capa orgánica sobre sulfato de sodio. La gravedad filtra la solución a través de gel de sílice para eliminar el desecante, y luego enjuagar el gel de sílice con 200 mililitros de acetato de etilo.Retire el disolvente del filtrado al vacío para obtener el Compuesto 1 como sólido incoloro. Seque el producto al vacío durante la noche antes de usarlo. A continuación, disolver 0,50 gramos de acetato de sodio en 20 mililitros de ácido acético glacial en un matraz de fondo redondo de 100 mililitros equipado con una barra de agitación.Añadir 1,25 gramos de anhídrido fluorofletólico y 1,14 gramos de glutatión y remover al reflujo durante seis horas para obtener una solución púrpura del Compuesto 3. Deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente, y luego vierta en 100 mililitros de agua desionizada y revuelva durante 10 minutos para precipitar el Compuesto 3. Recoger el sólido por filtración, lavarlo con agua y éter de petróleo, y secarlo al vacío durante dos días.A continuación, coloque 0,83 gramos de Compuesto Tres y 20 mililitros de sulfóxido de dimetil seco en un matraz Schlenk de 50 mililitros y revuelva durante dos minutos. Añadir 0,22 gramos de vinculador de diamina de omega alfa Compuesto 6, y 1,05 mililitros de N, N-diisopropylethylamine y agitar la mezcla bajo argón a 90 grados centígrados durante 18 horas para obtener Homodimer 8 en una mezcla verde oscuro. Dejar enfriar la mezcla a temperatura ambiente y verter en 100 mililitros de agua desionizada.Extraiga el producto en tres porciones de 50 mililitros de acetato de etilo, combine las capas orgánicas y lávelas con 50 mililitros cada una de agua y salmuera. Seque la capa orgánica lavada sobre sulfato de sodio, filtre el desecante y retire el disolvente al vacío. Redissolve el residuo en una cantidad mínima de disolvente de cromatografía y aplíquelo a una columna de gel de sílice para su purificación.Recoger las fracciones de producto fluorescentes, combinarlas y retirar el disolvente para obtener el Homodimer 8 como un sólido amarillo. Para empezar, disolver 2,28 gramos de glutrimida 1 en 25 mililitros de dimetilformamida en un matraz de fondo redondo de 100 mililitros. Suspenda 2,76 gramos de carbonato de potasio molido en esta solución.A continuación, dibuje 0,62 mililitros de yodometano en una jeringa equipada con una aguja de calibre 20. Añade la gota de yodometano en el transcurso de 10 segundos. Tape el matraz con un tabique de goma y agregue una aguja de ventilación.Sonicar la mezcla durante dos horas a temperatura ambiente para obtener Glutarimide Compound 2. Diluir la mezcla con 50 mililitros de acetato de etilo y verter en un embudo separador. Enjuague el matraz en el embudo con otros 50 mililitros de acetato de etilo.Elaborar el producto y purificarlo con cromatografía de columna de gel de sílice para obtener Glutarimide 2 como un sólido incoloro. Compare los tiempos de retención de los compuestos de glutrimida 1 y 2 para confirmar que la metilación N tuvo éxito. Para comenzar la validación, trate las células del mieloma múltiple con los compuestos de interés.Aísle las proteínas pertinentes y prepare muestras para un análisis de Western Blot de la degradación de proteínas. A continuación, prepare un sándwich de gel para SDS-PAGE y llene el tanque tampón de ánodo con una solución de pH 8.9 tris-HCl. Cargue las muestras de proteínas en el gel y ejecútela a 70 Voltios durante 20 minutos, seguido de 115 voltios durante 150 minutos.A continuación, prepare el tampón de transferencia 1x para inmunoblotting y mueva cuidadosamente el gel de su cassette al tampón de transferencia para equilibrarlo. Hay que tener mucho cuidado cuando se quita el gel del cassette para el equilibrio, ya que puede estallar y arrugar muy rápidamente. Sumerja una membrana de difluoruro de polivinilideno de 0,45 micrómetros en metanol puro durante al menos 20 segundos para activarlo y, a continuación, sumerjala en un tampón de transferencia 1x.Deje que el gel y la membrana se equilibren durante 10 minutos. A continuación, montar el cassette Western Blotting y aplicar 180 miliamperios durante 90 minutos para transferir las proteínas a la membrana. Después, visualizar las proteínas por inmunomancha.Para evaluar los efectos sobre la viabilidad celular, primero, siembra 50.000 células de mieloma múltiple por pozo de una placa de 96 pozos en triplicado biológico. Añadir a cada pocódica 100 microlitros de medios que contengan DMSO, o un micromolar 0.1, uno o 10 de Compuesto 8, Compuesto 9 o pomalidomida. Para realizar el experimento de rescate de viabilidad celular, tratar las células con una solución nanomolar 100 de Compuesto 8 durante tres horas, antes o después de agregar una solución micromolar de pomalidomida.Incubar las células durante 24, 48 o 96 horas a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono del 5%, y medir la viabilidad celular con un ensayo luminiscente. La estructura del PROTAC 8 homodimérico se confirmó con protones y RMN de carbono. ProTAC 9 heterodimérico fue sintetizado como un control negativo, como N-metilación dentro de la porción de glutatión resulta en una pérdida de Cereblon, o CRBN, capacidad de unión.El homo PROTAC 8 indujo una degradación proteosómica casi completa de CRBN con efectos mínimos en los factores de transcripción linfoide IKZF1 e IKZF3. Por el contrario, el hetero PROTAC 9 mostró un comportamiento similar a los pomalidomides. Compuesto 8 la degradación inducida de CRBN podría ser bloqueada por un inhibidor directo del proteosoma, o indirectamente bloqueada por inhibición de la netilación.Las células pretratadas con el Compuesto 8 resistieron significativamente los efectos de la pomalidomida en IKZF1 e IKZF3. La degradación inducida por el CRBN inducida por el compuesto 8 tuvo mucho menos efecto sobre la viabilidad de las células del mieloma múltiple después de 96 horas que la degradación de IKZF1 e IKZF3 del Compuesto 9 y la pomalidomida. Las células del mieloma múltiple pretratadas con el Compuesto 8 tenían una viabilidad significativamente mayor cuando se exponían a pomalidomida que las células no tratadas, lo que sugiere que el Compuesto 8 podría utilizarse para imitar la resistencia a los fármacos IMiD inmunomoduladores.Encontramos que el Compuesto 8 induce la degradación proteasomal completa de Cereblon, no tiene efectos secundarios sobre la viabilidad y proliferación celular IKZF1 e IKZF3. Extender la tecnología del proyecto a otros objetivos tiene el potencial de inactivar y rastrear proteínas relacionadas con el cáncer y otras enfermedades. Al adaptar esta técnica para otros fármacos y proteínas, se debe investigar cuidadosamente las estructuras moleculares de la droga y el objetivo proteico para elegir los enlaces y accesorios óptimos.Los IMiD no funcionarán en ratones debido a una mutación puntual en Cereblon, pero existe un modelo de ratón knock-in transgénico que se puede utilizar para estudios con animales adicionales. Como la pomalidomida es una talidomida análoga, que es altamente teratogénica, no recomendamos a las mujeres embarazadas que trabajen con estos medicamentos.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami Inspired autoensamblaje de partículas modeladas y Reconfigurable

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Investigación

Química

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Preparación de células adherentes, por Imágenes de fluorescencia de rayos X por Química Fijación

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Deposición de vapor químico de un imán Orgánica, vanadio tetracianoetileno

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

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Preparación de altamente poroso Coordinación Polymer Coatings en macroporosas Polymer Monolitos de Enriquecimiento mejorada de Phosphopeptides

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

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