Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether-programmet kr-3886/2-1 och SFB-1074 till JK; FOR2372 till M.G.)

1. beredning av PROTAC molekyler
VAR försiktig: Se alla relevanta Materialsäkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Flera av de kemikalier som används i dessa synteser är giftiga och cancerframkallande. Använd alla lämpliga säkerhetsrutiner och personlig skyddsutrustning.
<ol><li>Beredning av tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) karbamat (sammansatt 1)
	<ol>
<li>Tillsätt 1, 1 '-karbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) och en katalytisk mängd av 4-(d...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li><li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation+by+PROTACs.">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li><li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation.">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li><li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs:+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation.">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).</li><li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

Utformningen av sådana homo-PROTAC som beskrivs här för CRBN förlitar sig på pomalidomid specifika affinitet till CRBN, som framgångsrikt har utnyttjats i många heterobifunktionella PROTAC och resulterat i utvecklingen av PROTAC 8 som en mycket selektiv CRBN degrader. Specificiteten hos vår molekyl har redan bekräftats av proteomiska analyser24. För genetiskt medierad knockout, uteslutning och validering av biverkningar är utmanande och tidskrävande. Dessutom är en ke...

Immunmodulerande läkemedel (imider) talidomid och dess analoger, lenalidomid och pomalidomid, alla godkända för behandling av multipelt myelom, binder till E3 ubiquitin Ligase cereblon (CRBN), en substratadapter för cullin4A-RING E3 ubiquitin Ligase (CRL4crbn)1,2,3. Bindning av imider ökar affiniteten av CRL4crbn till lymfoida transkriptionsfaktorerna Ikaros (IKZF1) och Aiolos (IKZF3), vilket leder till deras ubiquitination och nedbrytning (figur 1)4,5, 6 , 7 , 8. eftersom IKZF1 och IKZF3 är väsentliga för multipelt myelomceller, resulterar deras inaktivering i tillväxthämning. SALL4 hittades nyligen som en ytterligare Imid-inducerad Neo-substrat av crbn som sannolikt är ansvarig för teratogenicitet och den så kallade Contergan katastrof på 1950-talet orsakas av talidomid9,10. Däremot är kasein Kinas 1 α (CK1α) ett lenalidomid-specifikt substrat för crbn som är inblandad i den terapeutiska effekten i myelodysplastiskt syndrom med kromosom 5q borttagningar11.
Möjligheten för små molekyler att rikta ett specifikt protein för nedbrytning är en spännande implifiering för modern läkemedelsutveckling. Medan mekanismen för talidomid och dess analoger upptäcktes efter deras första användning hos människor, så kallade PRoteolysis targeting CHimeras (PROTAC) har utformats för att specifikt rikta ett protein av intresse (POI) (figur 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTAC är heterobifunktionella molekyler som består av en specifik ligand för POI ansluten via en länkare till en ligand av en E3 ubiquitin Ligase som crbn eller von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. PROTAC inducerar bildandet av en övergående ternära komplex, styra POI till E3 ubiquitin Ligase, vilket resulterar i dess ubiquitination och proteasomen nedbrytning. De stora fördelarna med PROTAC jämfört med konventionella hämmare är att bindningen till en POI är tillräcklig snarare än dess hämning och därför kan PROTAC potentiellt rikta ett mycket bredare spektrum av proteiner, inklusive sådana som ansågs vara oruggbara som transkriptionsfaktorer15. Dessutom, chimär molekyler agera katalytiskt och därför har en hög potens. Efter ubiquitin överföring till POI, separerar ternära komplexet och är tillgänglig för bildandet av nya komplex. Därför är mycket låga PROTAC-koncentrationer tillräckliga för nedbrytningen av målproteinet23.
Här beskriver vi syntesen av en pomalidomid-pomalidomid konjugerad homo-PROTAC (förening 8) som rekryterar crbn för nedbrytning av sig själv24. Den E3 ubiquitin Ligase CRBN fungerar som både rekryterare och målet på samma gång (figur 3). För att validera våra data syntetiserade vi också en negativ bindnings kontroll (sammansatt 9). Våra data bekräftar att den nyligen syntetiserade homo-PROTAC är specifik för CRBN nedbrytning och har endast minimala effekter på andra proteiner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

Immunmodulerande läkemedel (imider) talidomid och dess analoger, lenalidomid och pomalidomid, alla FDA-godkända läkemedel för behandling av multipelt myelom, inducera ubiquitination och nedbrytning av lymfoida transkriptionsfaktorerna Ikaros (IKZF1) och Aiolos (IKZF3) via cereblon (crbn) E3 ubiquitin Ligase för proteasomen nedbrytning. Imids har nyligen utnyttjats för generering av bifunktionell proteolys inriktning chimärer (PROTAC) att rikta andra proteiner för ubiquitination och proteasomen nedbrytning av crbn E3 Ligase. Vi designade och syntetiserade pomalidomid-baserade homobifunktionella PROTAC och analyserade deras förmåga att inducera självstyrd ubiquitination och nedbrytning av CRBN. Här fungerar CRBN som båda, E3 ubiquitin Ligase och målet på samma gång. Homo-PROTAC Compound 8 försämrar crbn med en hög potens med endast minimala kvarvarande effekter på IKZF1 och IKZF3. CRBN inaktivering av sammansatta 8 hade ingen effekt på cellernas lönsamhet och spridning av olika multipelt myelom cellinjer. Denna homo-PROTAC upphäver effekterna av imider i multipelt myelomceller. Därför, våra homodimeric pomalidomid-baserade föreningar kan bidra till att identifiera CRBN ' s endogena substrat och fysiologiska funktioner och undersöka den molekylära mekanismen för imider.

Här beskrev vi design, syntes och biologisk utvärdering av en homodimeric pomalidomid-baserade PROTAC för nedbrytningen av CRBN. Vår PROTAC samverkar samtidigt med två crbn-molekyler och bildar ternära komplex som inducerar själv ubiquitination och proteasomen nedbrytning av crbn med endast minimala kvarvarande effekter på pomalidomid-inducerad Neo-substrat IKZF1 eller IKZF3.
Av en serie tidigare publicerade pomalidomidb...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Detta arbete beskriver syntesen och karakterisering av en pomalidomid-baserade, bifunktionella homo-PROTAC som en ny metod för att inducera ubiquitination och nedbrytning av E3 ubiquitin Ligase cereblon (CRBN), målet för talidomid analoger.

Kemisk inaktivering av den E3 ubiquitin Ligase Cereblon av pomalidomid-baserade homo-PROTAC

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Våra homodimeriska PROTACs är de första kemiska hämmarna av Cereblon och kan hjälpa till att ytterligare klarlägga den molekylära mekanismen för talidomid analoger, samt att undersöka den fysiologiska funktionen av Cereblon. Denna nya PROTAC-plattformsteknik kan vara till stor hjälp för att specifikt rikta in sig på proteiner av intresse som annars anses vara ospårbara. CRBN hämning ensam har ingen anti-tumör aktivitet.Emellertid, CRBN degraders kan ha kliniska konsekvenser i fetma, infektionssjukdomar och andra sjukdomar. Syntesen är utmanande och det är svårt att hitta optimala länkare och fastsättning för att generera effektiva protein degraders när man utformar en PROTAC förening. Till att börja med, placera 2,46 gram Boc-skyddade L-glutamin och 50 milliliter tetrahydrofuran i en 100 milliliter rundbottnad kolv, och rör om vid 800 rpm i en minut.Tillsätt sedan 1,95 gram 1, 1'carbonyldiimidazole och en katalytisk mängd 4-pyridin. Fortsätt omrörning i 10 timmar vid återflöde för att få en klar färglös lösning av glutarimid förening. Låt lösningen svalna till rumstemperatur, och ta bort lösningsmedlet med en roterande förångare.Rödissolera återstoden i 200 milliliter etylacetat och häll den i en separatorisk tratt. Tvätta det organiska lagret med 50 milliliter vardera av avjoniserat vatten och saltlake, och torka det organiska lagret över natriumsulfat. Gravitation filtrera lösningen genom kiselgel för att ta bort torkmedlet, och skölj sedan kiselgelen med 200 milliliter etylacetat.Avlägsna lösningsmedlet från filtratet under vakuum för att erhålla Compound 1 som ett färglöst fast ämne. Torka produkten under vakuum över natten innan du använder den. Därefter lös 0,50 gram natriumacetat i 20 milliliter i glacial ättiksyra i en 100 milliliter rund-botten kolv utrustad med en stirba.Tillsätt 1,25 gram 3-fluoroftal anhydrid och 1,14 gram glutarimid och rör om vid återloppskoningar i sex timmar för att få en lila lösning av Compound 3. Låt blandningen svalna till rumstemperatur, och häll den sedan i 100 milliliter avjoniserat vatten och rör om i 10 minuter för att fälla ut Compound 3. Samla fast genom filtrering, tvätta den med vatten och petroleumeter, och torka den under vakuum i två dagar.Placera därefter 0,83 gram Compound Three och 20 milliliter av torr dimetylsulfioxid i en 50 milliliter Schlenk kolv och rör om i två minuter. Tillsätt 0,22 gram alfa omega diamine linker Compound 6, och 1,05 milliliter av N, N-diisopropyletylamin och rör blandningen under argon vid 90 grader celsius i 18 timmar för att få Homodimer 8 i en mörkgrön blandning. Låt blandningen svalna till rumstemperatur och häll den i 100 milliliter av avjoniserat vatten.Extrahera produkten i tre 50 milliliter portioner etylacetat, kombinera de organiska skikten, och tvätta dem med 50 milliliter vardera av vatten och saltlake. Torka det tvättade organiska skiktet över natriumsulfat, filtrera ut torkmedlet och ta bort lösningsmedlet under vakuum. Rödissolve återstoden i en minimal mängd kromatografi lösningsmedel och gäller för en kiselgel kolumn för rening.Samla ihop de fluorescerande produktfraktionerna, kombinera dem och ta bort lösningsmedlet för att erhålla Homodimer 8 som ett gult fast ämne. Till att börja, lös 2,28 gram Glutarimide 1 i 25 milliliter dimetylformamid i en 100 milliliter rundbottenkolv. Suspend 2,76 gram fräst kaliumkarbonat i denna lösning.Dra sedan 0,62 milliliter i en spruta utrustad med en nål med 20 gauge. Tillsätt iodometan drop-wise under loppet av 10 sekunder. Propp kolven med en gummi septum, och tillsätt en vent nål.Sonikera blandningen i två timmar vid rumstemperatur för att erhålla Glutarimide Compound 2. Späd blandningen med 50 milliliter etylacetat och häll den i en separatorisk tratt. Skölj kolven i tratten med ytterligare 50 milliliter etylacetat.Arbeta upp produkten och rena den med kiselgelkolonnkromatografi för att erhålla Glutarimide 2 som ett färglöst fast ämne. Jämför retentionstiderna för Glutarimid Föreningar 1 och 2 för att bekräfta att N-metylering var framgångsrik. För att börja valideringen, behandla flera myelom celler med de föreningar av intresse.Isolera de relevanta proteinerna, och förbered prover för en Western Blot-analys av proteinnedbrytning. Därefter, förbereda en gel sandwich för SDS-PAGE och fyll anod bufferttanken med ett pH 8,9 tris-HCl lösning. Ladda proteinproverna i gelen och kör den på 70 Volt i 20 minuter, följt av 115 volt i 150 minuter.Därefter förbereder du 1x överföringsbuffert för immunoblotting och flyttar försiktigt gelen från sin kassett till överföringsbufferten till jämvikt. Man måste vara väldigt försiktig när man tar bort gelen från kassetten för jämvikt, eftersom den kan brista och crumple mycket snabbt. Sänk ner ett 0,45 mikrometer polyvinyliden difluoridmembran i ren metanol i minst 20 sekunder för att aktivera den, och sänk den sedan i 1x överföringsbuffert.Låt gelen och membranet jämvikt i 10 minuter. Sedan monterar du den västra Blotting-kassetten och applicerar 180 milliamperes i 90 minuter för att överföra proteinerna till membranet. Efteråt visualiserar proteiner genom immunostaining.För att utvärdera effekterna på cellernas livskraft, först, utsäde 50, 000 multipelt myelom celler per brunn av en 96 väl platta i biologisk tre exemplar. Lägg till varje brunn 100 mikroliter av media som innehåller DMSO, eller en 0,1, en eller 10 mikromolar av Compound 8, Compound 9, eller pomalidomid. För att utföra cell viabilitet rescue experiment, istället behandla cellerna med en 100 nanomolar lösning av Compound 8 i tre timmar, antingen före eller efter att lägga till en en mikromolarlösning av pomalidomid.Inkubera cellerna i 24, 48 eller 96 timmar vid 37 grader celsius i en 5%koldioxid atmosfär, och mäta cellens livskraft med en självlysande analys. Strukturen av homodimeric PROTAC 8 bekräftades med proton och kol NMR. Heterodimeric PROTAC 9 var syntetiseras som en negativ kontroll, som N-metylering inom glutarimide delen resulterar i en förlust av Cereblon, eller CRBN, bindande förmåga.Den homo PROTAC 8 inducerad nära komplett proteosomal CRBN nedbrytning med minimala effekter på lymfoida transkription faktorerna IKZF1 och IKZF3. Däremot visade hetero PROTAC 9 beteende som liknar pomalidomider. Sammansatt 8 inducerad CRBN-nedbrytning kunde blockeras av en direkt hämmare av proteasomen, eller indirekt blockeras av netylationshämning.Celler som förbehandlats med Compound 8 motstod signifikant effekterna av pomalidomid på IKZF1 och IKZF3. Sammansatta 8 inducerad CRBN nedbrytning hade mycket mindre av en effekt på multipelt myelom cellen livskraft efter 96 timmar än IKZF1 och IKZF3 nedbrytning från Compound 9 och pomalidomid gjorde. Multipelt myelom celler pre-treated med Compound 8 hade betydligt större livskraft när de utsätts för pomalidomid än obehandlade celler, vilket tyder på att Compound 8 skulle kunna användas för att efterlikna immunmodulerande IMiD läkemedelsresistens.Vi fann att Compound 8 inducerar fullständig proteasomal nedbrytning av Cereblon, har inga biverkningar på IKZF1 och IKZF3 cellen livskraft och spridning. Att utvidga projekttekniken till andra mål har potential att inaktivera och spåra proteiner relaterade till cancer och andra sjukdomar. Vid anpassning av denna teknik för andra läkemedel och proteiner bör man noggrant undersöka läkemedlets molekylära strukturer och proteinmålet att välja de optimala länkarna och bilagorna.IMiDs kommer inte att fungera hos möss på grund av en punktmutation i Cereblon, men en transgen knock-in musmodell finns som kan användas för ytterligare djurstudier. Som pomalidomid är en analog talidomid, som är mycket teratogen, rekommenderar vi inte gravida kvinnor som arbetar med dessa läkemedel.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami inspirerade självorganisering av Mönstrade och omkonfigurerbara partiklar

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolering och kemisk karakterisering av lipid A från gramnegativa bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Förbereda Vidhäftande Cells för röntgen fluorescens avbildning av Chemical Fixering

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Chemical Vapor Deposition av en organisk magnet, Vanadium tetracyanoeten

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Framställning av mycket porösa samordningspolymerbeläggningar på Makroporösa polymermonoliter för Enhanced Anrikning av fosfopeptider

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Preparation of Macroporous Epitaxial Quartz Films on Silicon by Chemical Solution Deposition

Framställning av Makroporösa epitaxiella kvarts filmer Silicon av Chemical Solution Deposition

This work describes the detailed protocol for preparing piezoelectric macroporous epitaxial quartz films on silicon(100) substrates. This is a three-step ...

Epitaxial Growth of Perovskite Strontium Titanate on Germanium via Atomic Layer Deposition

Epitaxiell tillväxt av Perovskite strontiumtitanat på Germanium via Atomic Layer Deposition

Atomic layer deposition (ALD) is a commercially utilized deposition method for electronic materials. ALD growth of thin films offers thickness control and ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Syntes av maskliknande Miceller med synligt ljus medierad dispersionspolymerisation Använda Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...