Name: chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından destekleniyordu (Emmy-Noether programı KR-3886/2-1 ve SFB-1074-J.K.; FOR2372)

1. PROTAC moleküllerinin hazırlanması
DIKKAT: kullanmadan önce lütfen tüm ilgili malzeme güvenlik veri sayfalarına (MSDS) danışın. Bu sentezler kullanılan kimyasalların birkaç toksik ve kanserojen vardır. Lütfen tüm uygun güvenlik uygulamalarını ve kişisel koruyucu ekipmanları kullanın.
<ol><li>Tert-butil N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) karbamat (bileşik 1) hazırlanması
	<ol>
<li>1, 1 '-carbonyldiimidazol Ekle (1,95 g, 12 mmol) ve bir k...

<ol>
	<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity.">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li><li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li><li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide.">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li><li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4(CRBN).">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li><li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3.">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins.">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li><li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide,+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma.">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia &amp; Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li><li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs.">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li><li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4,+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome.">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate.">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del(5q)+MDS.">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protacs:+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation.">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li><li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation.">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li><li>Schneekloth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+control+of+protein+levels:+selective+in+vivo+targeted+degradation.">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li><li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTACs:+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery.">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).</li><li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li><li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation+by+PROTACs.">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li><li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation.">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li><li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs:+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation.">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).</li><li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+TANK-Binding+Kinase+1.">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4.">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry &amp; Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases.">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li><li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery.">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li><li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon.">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li><li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids.">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+(BET)+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression.">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+Targeting+Chimeras+(PROTACs)+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+(ALK).">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li><li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics.">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li><li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells.">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li><li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity.">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li><li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide.">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li><li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes.">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li><li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1.">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cereblon+in+health+and+disease.">Cereblon in health and disease.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li><li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice.">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li></ol>

CRBN için burada açıklanan gibi homo-PROTACs tasarımı CRBN için pomalidomür spesifik benzeşimi dayanır, hangi başarıyla sayısız heterobifunktional PROTACs kullanılmıştır ve PROTAC gelişimi sonuçlandı 8 bir yüksek olarak Seçici CRBN düşürücü. Molekülün özgüllüğü zaten proteomik analizlerle onaylandı24. Genetik aracılı nakavt için, yan etkilerin dışlama ve doğrulanması zorlu ve zaman alıcı bir işlemdir. Buna ek olarak, kimyasal kaynaklı ...

İmmünomodülatör ilaçlar (IMiDs) thalidomür ve onun analogları, lenalidomür ve pomalidomür, multipl Myeloma tedavisi için onaylanmış, E3 Ubiquitin ligaz cereblon (CRBN) bind, cullin4A-RING E3 Ubiquitin ligaz için bir substrat adaptörü (CRL4crbn)1,2,3. İmids bağlayıcı CRL4crbn lenfoid transkripsiyon faktörleri ikaros (IKZF1) ve Aiolos (IKZF3), kendi mayası ve bozulma yol açan benzeşimi geliştirir (Şekil 1)4,5, 6 , 7 , 8. bu yana IKZF1 ve IKZF3 multipl miyelom hücreleri için gerekli olan, büyüme inhibisyonu onların inaktivasyon sonuçları. SALL4 son zamanlarda, thalidomür9,10neden 1950 ' lerde teratogenisite ve sözde Contergan felaketinden sorumlu büyük olasılıkla crbn ek bir İmid kaynaklı Neo-substrat olarak bulundu. Buna karşılık, kasein kinaz 1α (CK1α), kromozom 5q silme11ile myelodisplastik sendromunda terapötik etkiye BULAŞMıŞ crbn lenalidomür spesifik bir substrat.
Küçük moleküllerin bozulma için spesifik bir protein hedeflemesini yeteneği modern ilaç gelişimi için heyecan verici bir ima. Thalidomür ve onun analogları mekanizması insanlarda ilk kullanımından sonra keşfedilen iken, bu nedenle PRoteolysis targeting Chimeras (protacs) olarak adlandırılan özellikle bir faiz (POI) bir protein hedef için tasarlanmıştır (Şekil 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs, crbn veya von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20gibi bir E3 Ubiquitin ligaz bir ligand için bir bağlayıcı ile bağlı POI için belirli bir ligand oluşur heterobifetertional moleküller 21,22. Protacs bir geçici Üçlü Kompleks oluşumunu teşvik, E3 Ubiquitin ligaz için POI yönlendirmek, onun mayası ve proteasomal bozulması sonuçlanan. PROTACs konvansiyonel inhibitörler üzerinde önemli avantajları bir POı için bağlayıcı yerine onun inhibisyonu daha yeterli olduğunu ve bu nedenle PROTACs potansiyel olarak kabul edildi gibi proteinlerin çok daha geniş bir spektrum hedef olabilir böyle undruggable olarak transkripsiyon faktörleri15. Buna ek olarak, chimerik molekülleri katalytically hareket ve bu nedenle yüksek bir potens var. İÇN 'ye Ubiquitin transferinden sonra, Üçlü Kompleks ayrışıp ve yeni kompleksleri oluşumu için kullanılabilir. Böylece, çok düşük PROTAC konsantrasyonları hedef protein23bozulması için yeterlidir.
Burada bir pomalidomür-pomalidomür konjuge homo-Protac sentezini açıklamak (bileşik 8) kendini bozulması için crbn acemi24. E3 Ubiquitin ligaz CRBN aynı zamanda hem işveren hem de hedef olarak hizmet vermektedir (Şekil 3). Verilerimizi doğrulamak için, aynı zamanda negatif bağlama kontrolü sentezlenmiş (bileşik 9). Verilerimiz yeni sentezlenmiş homo PROTAC 'ın CRBN bozulması için spesifik olduğunu ve diğer proteinlerde sadece minimal etkilere sahip olduğunu teyit ediyor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Carbonyldiimidazole</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>C0119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>385506</td>
			<td>Compound 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>148270250</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamidstamml&#246;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aiolos (D1C1E) mAB</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>15103S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRBN antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA045910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-Gln-OH</td>
			<td>TCI chemicals</td>
			<td>B1649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348445000</td>
			<td>Extra Dry over Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse (HRP conjugated)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>14859S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane, 99 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8507</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLN4942</td>
			<td>biomol (cayman)</td>
			<td>Cay15217-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#945;-Tubulin antibody produced in mouse (B512)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0830,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89761</td>
			<td>Compound 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6977.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL spray</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12049-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical inactivation of the e3 ubiquitin ligase cereblon by pomalidomide-based homo-protacs

İmmünomodülatör ilaçlar (imids) thalidomür ve onun analogları, lenalidomür ve pomalidomür, multipl Myeloma tedavisi için tüm FDA onaylı ilaçlar, ikaros (IKZF1) ve Aiolos lenfoid transkripsiyon faktörlerinin mayası ve bozulma neden (IKZF3) proteasomal bozulma için cereblon (CRBN) E3 Ubiquitin ligaz üzerinden. İmids yakın zamanda Chimeras (protacs) hedefleyen bifonksiyonel proteoliz nesil için kullanılan edilmiştir crbn E3 ligaz tarafından mayası ve proteasomal bozulması için diğer proteinlerin hedef. Biz tasarlanan ve sentezlenmiş pomalidomür tabanlı homobifunctional protacs ve kendi kendini yönettiği mayası ve crbn bozulması teşvik yeteneğini analiz. Burada, CRBN hem E3 Ubiquitin ligaz hem de hedef aynı anda hizmet vermektedir. Homo-PROTAC bileşik 8 IKZF1 ve IKZF3 üzerinde sadece minimal kalan etkileri ile yüksek bir potens ile crbn düşer. Bileşik 8 tarafından crbn inaktivasyonu hücre canlılığı ve farklı Multipl myelom hücre hatları proliferasyon üzerinde hiçbir etkisi yoktu. Bu homo-Protac multipl miyelom hücrelerinde imids etkilerini CPAP. Bu nedenle, bizim homodimeric pomalidomür bazlı bileşikler CRBN 's endojen substratlar ve fizyolojik fonksiyonları belirlemek ve IMiDs moleküler mekanizmasını araştırmak için yardımcı olabilir.

Burada CRBN bozulması için bir homodimerik pomalidomür tabanlı PROTAC tasarım, sentez ve biyolojik değerlendirme açıklanmıştır. Bizim PROTAC iki CRBN molekülleri ile aynı anda etkileşime girer ve pomalidomür kaynaklı Neo-substrat IKZF1 veya IKZF3 üzerinde sadece minimal kalan etkileri ile CRBN kendi kendine ubiquitination ve proteasomal bozulması indükler Üçlü kompleksleri formları.
Daha önce yayınlanan ...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs at JoVE.com

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Bu çalışma, bir pomalidomür bazlı sentez ve karakterizasyon açıklar, yeni bir yaklaşım olarak bir roman yaklaşımı ve E3 Ubiquitin ligaz cereblon (CRBN), thalidomür analogların hedefi bozulması teşvik etmek.

Pomalidomür tabanlı homo-PROTACs tarafından E3 Ubiquitin ligase Cereblon kimyasal Inaktivasyonu

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Homodimeric PROTACs Cereblon ilk kimyasal inhibitörleri ve daha fazla talidomid analogların moleküler mekanizması açıklığa kavuşturmak için yardımcı olabilir, hem de Cereblon fizyolojik işlevini araştırmak için. Bu yeni PROTAC platformu teknolojisi, özellikle takip edilemeyen olarak kabul edilen ilgi proteinlerini hedeflemek için son derece yararlı olabilir. CRBN inhibisyonu tek başına anti-tümör aktivitesi yoktur.Ancak, CRBN bozunanobezite, bulaşıcı hastalıklar ve diğer hastalıklarda klinik etkileri olabilir. Sentez zorlu ve bir PROTAC bileşiği tasarlarken etkili protein bozunur oluşturmak için optimum bağlayıcılar ve eki bulmak zor. Başlamak için, 100 mililitre lik yuvarlak dipli bir şişeye 2,46 gram Boc korumalı L-glutamin ve 50 mililitre tetrahidrofuran yerleştirin ve bir dakika boyunca 800 rpm'de karıştırın.Sonra, 1 1 gram, 1'karbonildiimidazol ve 4-piridin bir katalitik miktarda ekleyin. Glutimid bileşiğin net renksiz çözeltisi elde etmek için reflü de 10 saat karıştırmaya devam edin. Çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve çözücüyciyi döner buharlaştırıcı ile çıkarın.Etil asetat 200 mililitre kalıntı redissolve ve ayırıcı huni içine dökün. Organik katmanı 50 mililitre deiyonize su ve salamura ile yıkayın ve organik katmanı sodyum sülfat üzerine kurulayın. Yerçekimi desiccant kaldırmak için silika jel ile çözüm filtre, ve sonra etil asetat 200 mililitre ile silika jel durulayın.Renksiz bir katı olarak Bileşik 1 elde etmek için vakum altında filtrasyon solvent çıkarın. Kullanmadan önce ürünü bir gecede vakum altında kurulayın. Sonra, bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir 100 mililitre yuvarlak alt şişe de buzul asetik asit 20 mililitre sodyum asetat 0.50 gram çözün.3-floroftalans anhidrit 1.25 gram ve glutarimid 1.14 gram ekleyin ve Bileşik 3 mor bir çözüm elde etmek için altı saat reflü karıştırın. Karışımı oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve sonra deiyonize su 100 mililitre içine dökün ve Bileşik 3 çökelti için 10 dakika karıştırın. Filtrasyon ile katı toplamak, su ve petrol eter ile yıkayın ve iki gün boyunca vakum altında kurulayın.Sonra, 50 mililitrelik Schlenk şişesine 0,83 gram Bileşik Üç ve 20 mililitre kuru dimetil sülfoksit yerleştirin ve iki dakika karıştırın. Alfa omega diamin bağlayıcı Bileşik 0.22 gram ekleyin 6, ve N mililitre, N-diisopropiletiltilemin ve argon altında karışımı karıştırın 90 santigrat derece için 18 saat boyunca homodimer elde etmek 8 koyu yeşil karışımı. Karışımı oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve 100 mililitre deiyonize suya dökün.Etil asetat üç 50 mililitre porsiyon içine ürün ayıklayın, organik katmanları birleştirmek ve 50 mililitre su ve salamura her onları yıkayın. Yıkanmış organik katmanı sodyum sülfat üzerine kurutun, kurutucuyu filtreleyin ve vakum un altındaki çözücüü çıkarın. Kalıntıyı en az miktarda kromatografi çözücüde çözün ve saflaştırma için silika jel kolona uygulayın.Floresan ürün fraksiyonları toplamak, bunları birleştirmek ve sarı bir katı olarak Homodimer 8 elde etmek için çözücü kaldırın. Başlamak için, 100 mililitre yuvarlak alt şişede dimetilformamid 25 mililitre Glutarimid 1 2.28 gram çözünür. Bu çözeltide 2,76 gram öğütülmüş potasyum karbonatı askıya alın.Daha sonra, 20-gauge iğne ile donatılmış bir şırınga içine iyodometan 0,62 mililitre çizin. 10 saniye boyunca iyodometan damla-bilge ekleyin. Stopper bir lastik septum ile şişe, ve bir havalandırma iğnesi ekleyin.Glutarimide Bileşik 2 elde etmek için oda sıcaklığında iki saat boyunca karışımı sonicate. Karışımı 50 mililitre etil asetat ile seyreltin ve ayırıcı bir huniye dökün. Şişeyi 50 mililitre daha etil asetatla huniye durulayın.Ürünü çalıştırın ve renksiz bir katı olarak Glutimid 2 elde etmek için silika jel sütun kromatografisi ile arındırın. N-metilasyonun başarılı olduğunu doğrulamak için Glutimid Bileşikleri 1 ve 2'nin bekletme sürelerini karşılaştırın. Doğrulamaya başlamak için, birden fazla miyelom hücrelerini ilgi çekici bileşiklerle tedavi edin.İlgili proteinleri izole edin ve protein yıkımının Batı Leke analizi için numuneler hazırlayın. Daha sonra, SDS-PAGE için bir jel sandviç hazırlayın ve anod tampon tankını pH 8.9 tris-HCl çözeltisi ile doldurun. Jel içine protein örnekleri yükve 20 dakika boyunca 70 Volt çalıştırın, 150 dakika boyunca 115 volt takip.Daha sonra, immünoblotting için 1x transfer tampon ulayın ve dikkatle dengelemek için transfer tampon için kasetten jel taşıyın. Jeli denge için kasetten çıkarırken çok dikkatli olmalısın, çünkü çok hızlı bir şekilde patlayabilir ve buruşabilir. 0.45 mikrometrelik poliviniliden diflorit membranını saf metanolde en az 20 saniye boyunca aktif hale getirin ve 1x transfer tamponuna batırın.Jel ve membran 10 dakika boyunca dengesağlar. Daha sonra, Batı Blotting kasetmonte ve membran proteinleri aktarmak için 90 dakika boyunca 180 miliamperes uygulayın. Daha sonra, immünoboyama ile proteinleri görselleştirin.Hücre canlılığı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, ilk olarak, tohum 50, 000 multipl miyelom hücreleri biyolojik triplicate bir 96 iyi plaka iyi başına. DMSO veya Bileşik 8, Bileşik 9 veya pomalidomid 0.1, bir veya 10 mikromolar içeren medya her iyi 100 mikrolitre ekleyin. Hücre canlılık kurtarma deneyi gerçekleştirmek için, bunun yerine üç saat boyunca, pomalidomid bir mikromolar çözeltisi ekledikten sonra, üç saat boyunca Bileşik 8 100 nanomolar çözüm ile hücreleri tedavi.Hücreleri %5 karbondioksit atmosferinde 37 derecede 24, 48 veya 96 saat kuluçkaya yatırın ve canlılığı Parlak bir tözle ölçün. Homodimerik PROTAC 8'in yapısı proton ve karbon NMR ile doğrulandı. Heterodimerik PROTAC 9 negatif kontrol olarak sentezlendi, glutarimide kısmı içinde N-metilasyon Cereblon kaybı ile sonuçlanır gibi, veya CRBN, bağlama yeteneği.Homo PROTAC 8 lenfoid transkripsiyon faktörleri IKZF1 ve IKZF3 üzerinde minimal etkileri ile tam proteozomal CRBN yıkımı yakın indüklenen. Buna karşılık, hetero PROTAC 9 pomalidomides benzer davranış gösterdi. Bileşik 8 indüklenen CRBN bozunması proteozomun doğrudan inhibitörü tarafından engellenebilir veya dolaylı olarak netilasyon inhibisyonu tarafından engellenebilir.Bileşik 8 ile önceden tedavi edilen hücreler pomalidomidin IKZF1 ve IKZF3 üzerindeki etkilerine önemli ölçüde direndi. Bileşik 8 indüklenen CRBN bozulması, 96 saat sonra bileek 9 ve pomalidomidden IKZF3 bozulmasına göre multipl miyelom hücre canlılığı üzerinde çok daha az etkiye sahipti. Bileşik 8 ile ön tedavi edilen multipl miyelom hücreleri pomalidomide maruz kaldığında tedavi edilmeyen hücrelere göre önemli ölçüde daha fazla canlılığa sahipti, bu da Bileşik 8'in immünmodülatör IMiD ilaç direncini taklit etmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir.Biz Bileşik 8 Cereblon tam proteazomal bozulma neden olduğunu bulundu, IKZF1 ve IKZF3 hücre canlılığı ve çoğalması üzerinde hiçbir yan etkisi yoktur. Proje teknolojisinin diğer hedeflere genişletilmesi, kanser ve diğer hastalıklarla ilgili proteinlerin etkisiz hale ilmesi ve izlenmesi potansiyeline sahiptir. Bu tekniği diğer ilaçlar ve proteinler için uyarlarken, en uygun bağlantıları ve ekleri seçmek için ilacın moleküler yapılarını ve protein hedefini dikkatle araştırmalıdır.MiDs Cereblon bir nokta mutasyonu nedeniyle farelerde çalışmaz, ancak daha fazla hayvan çalışmaları için kullanılabilecek bir transgenik knock-in fare modeli vardır. Pomalidomid analog talidomid olduğundan, yüksek oranda teratojeniktir, bu ilaçlarla çalışan hamile kadınları önermiyoruz.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami Inspired Desenli ve Reconfigurable Parçacıkların Self-assembly

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Chemical Vapor Deposition of an Organic Magnet, Vanadium Tetracyanoethylene

Bir Organik Magnet CVD, Vanadyum Tetracyanoethylene

Recent progress in the field of organic materials has yielded devices such as organic light emitting diodes (OLEDs) which have advantages not found in ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Phosphopeptides Gelişmiş Zenginleştirme için Makrogözenekli Polimer Monoliths üzerinde yüksek Gözenekli Koordinasyon Polymer Coatings Hazırlanması

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Preparation of Macroporous Epitaxial Quartz Films on Silicon by Chemical Solution Deposition

Kimyasal Çözüm Biriktirme tarafından Silisyum üzerinde Makrogözenekli Epitaksiyel Kuvars Filmlerin Hazırlanması

This work describes the detailed protocol for preparing piezoelectric macroporous epitaxial quartz films on silicon(100) substrates. This is a three-step ...

Epitaxial Growth of Perovskite Strontium Titanate on Germanium via Atomic Layer Deposition

Atomik Katman Biriktirme aracılığıyla Germanyum üzerinde Perovskit Stronsiyum Titanate Epitaksiyel Büyüme

Atomic layer deposition (ALD) is a commercially utilized deposition method for electronic materials. ALD growth of thin films offers thickness control and ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Photoredox Katalizörü kullanarak görünür ışık aracılığı ile dispersiyon polimerleştirilmesi ile solucan gibi miseller Facile sentezi

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...