Name: high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain at JoVE.com

ويعرب جميع المؤلفين عن امتنانهم للدعم التمويلي المقدم من مؤسسه البحوث الوطنية في سنغافورة من خلال مجموعه البحوث المتعددة التخصصات التابعة للتحالف بين سنغافورة ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا والبحوث والتكنولوجيا (SMART) والميكروميكانيكس (BioSyM). وأعرب المؤلفان الدكتور جاغيليسكا والدكتور فان فليت أيضا عن امتنانهما للتمويل والدعم المقدمين من مؤسسه Saks-كافانوغ. ويشكر المؤلفان وليام اونغ والدكتور سينغ يان تشيو من جامعه نانيانغ التكنولوجية ، سنغافورة ، لتوفير خلايا الفئران التي تقدم السلف لبعض التجارب الموصوفة في هذا العمل ، ويشكر المؤلفون الدكتور غ. ف. شيفاشانكار من معهد البيولوجيا الميكانيكية ، جامعه سنغافورة الوطنية ، سنغافورة ، لاجراء مناقشات بشان تقلبات المناطق النووية.

1. تصميم العفن polydimethylsiloxane واحد جيدا للتصوير عاليه الدقة
ملاحظه: تم تصميم قالب لتصنيع لوحات polydimethylsiloxane مع الميزات التالية لتمكين التصوير مع عدسه الغمر النفط 100x ويصلح الصحيح في جهاز سلاله مخصصه بناء (الشكل 1A، B).
<ol><li>الحفاظ علي ابعاد لوحه ال?...

<ol>
	<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+produced+by+nerve+cells+in+tissue+culture.">Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture.</a> Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Developmental Biology. 389, (1983).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-based+theory+of+morphogenesis+and+compact+wiring+in+the+central+nervous+system.">A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system.</a> Nature. , (1997).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+Extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Research. , 103-115 (2011).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).</li><li>Niki&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).</li><li>Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+during+chronic+secondary+degeneration+in+rat+optic+nerve.">Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, (2018).</li><li>Zeiger, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+mechanical+strain+induces+capillary+endothelial+cell+cycle+re-entry+and+sprouting.">Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting.</a> Physical Biology. 13, 1-16 (2017).</li><li>Jagielska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+promotes+oligodendrocyte+differentiation+by+global+changes+of+gene+expression.">Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).</li><li>Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+spatio-temporal+fluctuations+in+chromatin+compaction+states+characterize+stem+cells.">Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells.</a> Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).</li><li>Makhija, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+alters+cellular+and+nuclear+dynamics+at+early+stages+of+oligodendrocyte+differentiation.">Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).</li></ol>

وقد تم تصميم جهاز سابقا1 لتطبيق سلاله الشد خارج الخلية علي الخلايا الملتصقة. وكان تصميم الطبقة الفرعية بوليميثيلسيلاوكسان في ذلك العمل كافيا لاختبارات الكيمياء الحيوية ، فضلا عن التصوير المنخفض الاستبانة للخلايا المتمددة. وفي هذا العمل ، أعيد تصميم الطبقة الفرعية ، واستحدث?...

تخضع الخلايا والانسجه في الجسم لمختلف العظات الميكانيكية ، بما في ذلك سلالات الشد. ومع ذلك ، فان اثار هذه العظة علي بيولوجيا الخلايا العصبية لم تدرس بعد علي نطاق واسع وفهم تماما. في الجهاز العصبي المركزي ، وتشمل مصادر السلالة الميكانيكية النمو التنموي1،2،3،4، العمليات الفسيولوجية مثل الانحناء الحبل الشوكي والدم والسائل النخاعي نبض ، والحالات المرضية مثل الصدمة ، وتورم عصبي ، تندب جليال ، أو نمو الورم5،6،7،8. ومن الجدير بالبحث كيف تؤثر سلاله الشد علي التمايز من oligodendrocytes والنخاع اللاحقة من axons ، وهي عمليه حرجه في الجهاز العصبي المركزي فقاري. باستخدام جهاز سلاله مصممه خصيصا وصفائح المطاط المرن ، وقد أظهرت الاعمال السابقة9،10 ان سلاله أحاديه المحوري ثابته يمكن ان تزيد من التمايز اوليجوديندروسيتي عن طريق التغيرات العالمية في التعبير الجيني 10-ولاكتساب مزيد من الفهم لليات الضغط الألى في هذه الخلايا ، يجب أعاده تصميم الجهاز التجريبي السابق علي النحو الموصوف هنا ، لتمكين التصوير الفلوري العالي الاستبانة لديناميات الاسلحه النووية في العيش خلايا تحت الضغط. علي وجه التحديد ، يتم تطوير لوحه أحاديه البئر بوليميثيلسيلاوكسان ، ويتم أعاده تصميم تكوين التصوير للسماح للتصوير الفاصل الزمني للخلايا الحية تحت الضغط باستخدام عدسه الغمر النفط 100x. للقضاء علي الآثار البصرية السلبية polydimethylsiloxane في المسار الخفيف ، والخلايا التي لا يتم من خلال لوحه polydiميثيل siloxane ، ولكن في الموقف المقلوب ، من خلال غطاء الزجاج تغطي مقصوره الخلية. باستخدام هذا التصميم التصويري الجديد ، يتم تسجيل المئات من الأفلام ذات الفواصل الزمنيه عاليه الدقة ، من نوى الخلايا الفردية داخل الخلايا الملتصقة السليمة ، حيث يتم تسميه الكروماتين بوضع علامات هيستون H2B علي البروتين الفلوري الأخضر. هذه الأفلام تثبت ان سلاله الشد يدفع التغييرات في بنيه الكروماتين والديناميكيات التي تتسق مع تطور التمايز اوليجوديندروسيتي.
التصوير الخلوي الحي تحت السلالة التطبيقية صعب من الناحية الفنية ويتطلب تصميم جهاز متوافق مع نظام المجهر. ويقدم التصميم المخصص الموصوف هنا بديلا غير مكلف للحلول التجارية. وتمكن ابعاده من تركيبها علي مراحل المجهر وتصوير الخلايا الحية باستبانة مكانيه عاليه اثناء الضغط المطبق. تم تصميم اعداد التصوير لتسهيل تصوير الخلايا الحية باستخدام عدسه الغمر النفط 100x مع اعلي درجه وضوح ، من خلال غطاء الزجاج ، وليس من خلال طبقه من لوحه polydimethylsiloxane الذي يقلل من جوده الصورة ، وهو أمر شائع في معظم أجهزه التصوير تحت الضغط. يمكن أيضا تخزين الجهاز ، مع لوحه مثبته تحتوي علي خلايا ، بسهوله في الحاضنة. تم تصميم هذا الجهاز لتطبيق سلاله أحاديه المحور لأسطح التي تسهل ثقافة الخلايا الملتصقة والحفاظ علي سلاله مستقره وموحده علي مدي عده أيام. يمكن استخدام الاعداد الموصوف هنا للتصوير عالي الدقة لأنواع الخلايا الملتصقة المختلفة تحت الضغط ، مما يجعله قابلا للتطبيق علي الدراسات الميكانيكية في العديد من مجالات البيولوجيا الميكانيكية للخلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primary cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats 
			were provided by Dr. S. Y. Chew&#39;s lab at Nanyang Technological University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high&#160; glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11996-065-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-608-50ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-776-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Stock components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroxine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold and PDMS plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - Dow Corning Sylgard 184</td>
			<td>Ellsworth</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold - Liquid Plastic</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Smooth Cast 310 - Trail Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate Coatings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface functionalization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3648-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>13306-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63578-AK-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1110501-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain

ومن المعروف ان السلالة الميكانيكية خارج الخلية للحصول علي الاستجابات الظاهرية الخلوية ولها صله فسيولوجية في العديد من أنظمه الانسجه. للتقاط تاثير ضغط الشد خارج الخلية التطبيقية علي الخلايا السكانية في المختبر عن طريق الاختبارات البيوكيميائية ، وقد تم تصميم جهاز سابقا التي يمكن ان تكون ملفقه ببساطه وصغيره بما يكفي لتناسب داخل حاضنات ثقافة الانسجه ، وكذلك علي راس مراحل المجهر. ومع ذلك ، فان التصميم السابق للطبقة الفرعية polydimethylsiloxane لا يسمح بالتصوير الخلوي العالي الاستبانة عن طريق أهداف غمر الزيت. يصف هذا العمل هندسه أعيد تصميمها للطبقة الفرعية polydimethylsiloxane واعداد التصوير المخصصة التي يمكن ان تسهل معا التصوير الخلوي العالي الاستبانة للخلايا الحية اثناء الضغط المطبق. يمكن استخدام هذه الطبقة الفرعية مع نفس الجهاز المصمم سابقا ، التالي ، لديه نفس المزايا المذكورة أعلاه ، بالاضافه إلى السماح بالتصوير البصري عالي الدقة. ويمكن تحسين تصميم الطبقة الفرعية polydimethylsiloxane بدمج شبكه من شانها ان تسهل تتبع نفس الخلية قبل وبعد تطبيق السلالة. تظهر النتائج التمثيلية تصويرا بفواصل زمنيه عاليه الدقة لفلوريسسينتلي المسمية نواه داخل الخلايا المجهدة الملتقطة باستخدام الطريقة الموصوفة هنا. هذه البيانات ديناميات النووية تعطي رؤى في اليه التي الشد المطبقة يعزز التمايز من الخلايا الجذعية اوليجوديندروسيتي.

وأظهرت الاعمال الاخيره التي تهدف إلى التحقيق في تاثير إجهاد الشد علي oligodendrocytes10 ان سلاله الشد أحاديه المحور 10 ٪ يعزز التمايز من الخلايا السلف oligodendrocytes من التغيرات العالمية في التعبير الجيني. ويمكن سبر اليه الكامنة وراء هذه التغييرات في التعبير الجيني عن طري?...

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain at JoVE.com

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

تصوير عالي الدقة لديناميكيات نوويه في الخلايا الحية تحت ضغط الشد المحوري

وباستخدام جهاز مصمم مسبقا لتطبيق السلالة الميكانيكية علي الخلايا الملتصقة ، تصف هذه الورقة هندسه الطبقة الفرعية المعاد تصميمها وجهازا مخصصا للتصوير عالي الاستبانة للخلايا المتوترة بهدف غمر الزيت بنسبه 100x.

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

لقد سبق أن قمنا بتصميم جهاز لتطبيق الضغط الميكانيكي على الخلايا المنضمة. في العمل الحالي، قمنا بإعادة تصميم هندسة الـ substratum وتخصيص الإعداد للتصوير عالي الدقة لهذه الخلايا السلالة. الميزة الرئيسية لهذا النظام تمديد الخلية هو أنه يوفر التصوير دون الخلوي عالية الدقة في 100x من الخلايا سلالة.إثبات تلفيق الغواصات سيكون (فيكي) مساعدة أبحاث من مختبري تبدأ بتصميم قالب polydimethylsiloxane واحد جيدا باتباع طول في بروتوكول النص المرافق. المقبل، مزيج 20 أجزاء من قاعدة polydimethylsiloxane مع وكيل علاج جزء واحد في كوب المتاح.مرة واحدة مختلطة، ووضع مزيج polydimethylsiloxane في فراغ دي غازر في 0.8 شريط لمدة 30 دقيقة لإزالة الفقاعات من هذا المزيج. ثم، صب مزيج polydimethylsiloxane في القالب والطبق. إزالة أي فقاعات إضافية في هذه المرحلة عن طريق إزالة الغاز مرة أخرى في فراغ 0.8 شريط لمدة 30 دقيقة.عندما يكتمل إزالة الغاز، اخبز العينات عند 80 درجة مئوية على طاولة التسوية لمدة ساعتين. المقبل، وإزالة العينات بعناية من الفرن والسماح لهم تهدئة إلى درجة حرارة الغرفة. قطع حواف مع شفرة وقشر بلطف خارج polydimethylsiloxane الشفاء.على 150 ملليمتر قطرها polydimethylsiloxane ، رسم سنتيمترين في اثنين من الشبكة سنتيمتر مع علامة. داخل كل مربع، رسم سنتيمتر واحد في سنتيمتر واحد مربع، وترك هامش من 0.5 سنتيمتر على جميع الجوانب. استخدم شفرة لقطع بعناية على طول الخطوط والحصول على مقصورات مربعة.بعد ذلك، قم بتنظيف العينات عن طريق احتضانها في 100٪ من الأسيتون لمدة أربع ساعات، 100٪ إيثانول لمدة أربع ساعات إضافية، ثم في الماء المُقلَف لمدة أربع ساعات. ضع العينات النظيفة على ورق دعم فيلم البارافين داخل طبق بلاستيكي قطره 150 ملليمتر وجفف العينة في فرن درجة مئوية 80 لمدة أربع ساعات. عند الانتهاء، ختم الأطباق مع فيلم البارافين وتخزينها في غرفة باردة حتى مزيد من الاستخدام.إعداد الخلايا السلف وتعليقها في وسط الانتشار. بذور هذه الخلايا في كثافة 35،000 خلية في سنتيمتر مربع على الأسطح البلاستيكية المغلفة PDL. ضبط حجم الانتشار المتوسط إلى ثلاثة ملليلتر لكل عشرة سنتيمترات مربعة من مساحة السطح.قد يؤدي انخفاض حجم الوسائط إلى تكتل الخلايا ، الناتج عن قوى التوتر السطحي ، في حين أن حجمًا أكبر من الوسائط في الأطباق قد يتسبب في تسرب الوسائط. في اليوم الثالث بعد البذر، حصاد الخلايا وعدها باستخدام مقياس الهيموسيت. ثم، البذور 35،000 خلية في لوحة بوليديميثيلسيلوكسيان مع 700 ميكرولترات من متوسطة الانتشار.بعد ذلك، أضف بناء بلازميك لوضع علامات على مجمعات H2B في الحجر الهاستون في الخلية مع البروتين الفلورسنت الأخضر باتباع تعليمات الشركة المصنعة. بعد 24 ساعة، قم بتركيب عينات بوليديميثيلسيلوكسيان مع الخلايا التي تمتد على جهاز السلالة الأحادية. ثم، تغيير الوسيطة في كافة العينات إلى الوسيطة التمايز.قياس طول مقصورة الخلية غير المدربة وتحويل المسمار ميكرومتر المرحلة لزيادة طول حجرة الخلية من قبل المبلغ المطلوب من سلالة. اترك عينات البوليديميثيلسيلوكسين المتمددة وغير الممدودة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى التصوير. إعداد حاضنة المجهر للتصوير الحي من خلال تحديد درجة حرارة الحاضنة إلى 37 درجة مئوية.المقبل، وجلب 100x هدف الغمر النفط إلى الموقف المركزي، كما turnit الهدف لن يكون الوصول إليها في وقت لاحق. مرة واحدة في موقف، فك الهدف والمسمار مرة أخرى جنبا إلى جنب مع حلقة الهدف، بحيث يمكن تحقيق الهدف أقرب إلى الخلايا. ثم، إضافة قطرة من النفط إلى الهدف.باستخدام حامل مطبوع حسب الطلب، اغطي الحامل بالشحوم الفراغية في محيط النافذة ووضع غطاء زجاجي سُمك عدد صفر على السطح العلوي من الحامل. الشريط نافذة من البلاستيك على مرحلة المجهر. بعد ذلك، المسمار مرحلة الترجمة Z على مرحلة المجهر ونقلها إلى أعلى Z الموقف.إزالة 500 ميكرولترات من المتوسط من لوحة البوليديميثيلسيلوكسيان امتدت لتكون صورة، وإضافة هذا المتوسط على غطاء الزجاج في نافذة من البلاستيك الأبيض. ثم استخدمي ملاقط معقم لفصل المقصورة المربعة بعناية عن لوحة بوليديميثيل سيلوكسان. عقد جهاز سلالة في وضع مستقيم بحيث تواجه الخلايا لأعلى، فوق نافذة بلاستيكية بيضاء وعكس بعناية جهاز سلالة، وذلك للسماح لأي انخفاض متوسطة اضافية مباشرة في منتصف غطاء الزجاج مع الخلايا التي تواجه لأسفل.ضع الجزء السفلي من الجهاز الإجهاد على مرحلة الترجمة Z باستخدام الشريط على الوجهين لعقد في مكان. بينما تبحث من خلال العدسة تحت حقل مشرق، ببطء شديد جلب الجهاز سلالة أسفل ونقل الهدف حتى التركيز على الخلايا. تنفيذ هذه الخطوة التركيز ببطء، بالتناوب بين خفض مرحلة الترجمة Z ورفع الهدف.إذا كانت مرحلة الترجمة Z يخفض كثيرا، يمكن ضغط الخلايا وبالتالي يموت. إذا رفعنا الهدف عاليا جدا، فإنه يمكن كسر غطاء الزجاج وتسبب المتوسطة لتسرب. مسح لوحة polydimethylsiloxane في الاتجاهات X و ص للعثور على الخلية التي لديها نواة الفلورسنت، وذلك باستخدام epiflorescence في 488 نانومتر الإثارة.تأكد أيضاً من أن الخلية لديها مورفولوجيا مناسبة عند النظر إلى العينة تحت حقل مشرق. سجل صور واسعة النطاق أو مفتوحة الفتح للنواة مع 488 نانومتر من الإثارة الطول الموجي وللخلية مع استثارة حقل مشرق على فترات 30 ثانية لكل إطار لمدة إجمالية لا تقل عن 30 دقيقة. الهندسة المعاد تصميمها من substratum polydimethylsiloxane وإعداد التصوير هو مبين في هذا الفيديو يقلل من المسافة بين الخلايا والهدف.وهذا يتيح التصوير الفاصل الزمني لخلايا الخلايا المسماة بالفلورسنت باستخدام هدف غمر الزيت 100x. لقياس التقلبات النووية، أولاً، قم بمؤامرة المنطقة النووية مقابل الوقت. ثم، detrend البيانات باستخدام متعدد الحدود من أجل ثالث.وأخيرا، مؤامرة التقلبات المتبقية وحساب الانحراف المعياري للتقلبات المتبقية. التقلبات النووية للخلايا السلف oligodendrocyte، بعد التعريفي الكيميائي من التمايز مع وبدون سلالة الشد 10٪، تبين أنه مع التعريفي الكيميائي وحده، فإن اتساع التقلبات النووية أظهرت انخفاضا كبيرا في 48 ساعة، ولكن ليس في 24 ساعة. من ناحية أخرى، الحث الكيميائي جنبا إلى جنب مع 10٪ من الشد أظهرت انخفاض كبير في 24 ساعة، والتي ظلت ثابتة دون مزيد من الانخفاض في 48 ساعة.أهم شيء يجب تذكره هو أن مسافة العمل للهدف المختار يجب أن تكون مساوية أو أكبر من عمق حجرة الخلية بالإضافة إلى سمك الغطاء. ويمكن إعادة تصميم substratum لتشمل الشبكة ، والتي من شأنها أن تسهل التصوير الخلية نفسها قبل وبعد تطبيق سلالة ، منذ قبل وبعد نوع من مجموعة البيانات يقلل من الضوضاء القادمة من خطأ تجريبي. باستخدام هذا الإعداد التصوير، يمكن تصوير العديد من الظواهر دون الخلوية داخل الخلايا الحية المنضمة، مثل توطين البروتين أو ديناميات المكونات الخلوية، في غضون ثوان من تطبيق السلالة الميكانيكية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

عالية الدقة 3D تصوير السابقين فيفو العينات البيولوجية بواسطة CT مايكرو

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

تعيش خلية من خلايا التصوير تعرب عن ترحيل البروتينات Fluorescently الموسومة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

المستمر الملاحظة المجهرية عالية الدقة من تنسخي الشيخوخة في الخميرة الناشيء.

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

مغناطيسيا بمساعدة البعيد تلميح Microcatheter الشواهد الانحراف تحت التصوير بالرنين المغناطيسي

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

إعداد ميكا المدعومة الدهون طبقات ثنائية لارتفاع القرار المجهر الضوئي التصوير

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

يعيش التصوير خلية خلال الإمتداد الميكانيكية

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

تعديل التقييم الأولى لجسم-يصرف مع الببتيدات المشتقة من الفيروسية لزيادة تراكم الخلوية وتحسين استهداف الورم

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...