Name: high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain at JoVE.com

Alle auteurs dankbaar erkennen steun van de financiering van de National Research Foundation van Singapore via de Singapore-MIT Alliantie voor onderzoek en technologie (SMART) biosystemen en micromechanica (BioSyM) interdisciplinair Onderzoekgroep. Auteurs Dr. Jagielska en Dr. van Vliet erkennen ook de financiering en steun van de Saks-Kavanaugh Foundation. De auteurs bedanken William Ong en Dr zingen Yian kauwen van Nanyang technologische universiteit, Singapore, voor het verstrekken van Rat oligodendrocyte voorlopercellen voor een aantal experimenten beschreven in dit werk, en de auteurs bedanken Dr. G. V.. Mechanobiology Institute, Nationale Universiteit van Singapore, Singapore, voor discussies over nucleaire gebied schommelingen.

1. ontwerp van de single-well Polydimethylsiloxaan mal voor High-Resolution Imaging
Opmerking: de mal voor de productie Polydimethylsiloxaan platen is ontworpen met de volgende functies om beeldvorming met een 100x olie onderdompeling lens en een juiste pasvorm in de custom-build spanning apparaat (Figuur 1a, B).
<ol><li>Houd de totale plaatafmetingen zodanig dat het past in de klemmen van de stam apparaat. Opmerking: hier zi...

<ol>
	<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+produced+by+nerve+cells+in+tissue+culture.">Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture.</a> Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Developmental Biology. 389, (1983).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-based+theory+of+morphogenesis+and+compact+wiring+in+the+central+nervous+system.">A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system.</a> Nature. , (1997).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+Extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Research. , 103-115 (2011).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).</li><li>Niki&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).</li><li>Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+during+chronic+secondary+degeneration+in+rat+optic+nerve.">Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, (2018).</li><li>Zeiger, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+mechanical+strain+induces+capillary+endothelial+cell+cycle+re-entry+and+sprouting.">Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting.</a> Physical Biology. 13, 1-16 (2017).</li><li>Jagielska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+promotes+oligodendrocyte+differentiation+by+global+changes+of+gene+expression.">Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).</li><li>Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+spatio-temporal+fluctuations+in+chromatin+compaction+states+characterize+stem+cells.">Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells.</a> Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).</li><li>Makhija, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+alters+cellular+and+nuclear+dynamics+at+early+stages+of+oligodendrocyte+differentiation.">Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).</li></ol>

Een apparaat heeft eerder1 is ontworpen voor de toepassing van de extracellulaire trekspanning op aanhangende cellen. Het ontwerp van de Polydimethylsiloxaan substratum in dat werk was voldoende voor biochemische analyses, evenals de lage-resolutie beeldvorming van uitgerekte cellen. In dit werk werd de substratum herontworpen, en een nieuwe Imaging configuratie die een hoge-resolutie subcellular Live Cell Imaging vergemakkelijkt werd geïntroduceerd. De voordelen van dit systeem zijn talrijk: het...

Cellen en weefsels in het lichaam worden onderworpen aan verschillende mechanische signalen, met inbegrip van trekspanningen. Echter, de effecten van deze signalen op de biologie van neurale cellen zijn nog niet uitvoerig bestudeerd en volledig begrepen. In het centrale zenuwstelsel, de bronnen van mechanische stam omvatten ontwikkelings groei1,2,3,4, fysiologische processen zoals het ruggenmerg buigen, bloed en hersenvocht pulsatie, en pathologische aandoeningen zoals trauma, axon zwelling, glial littekens, of tumorgroei5,6,7,8. Het is de moeite waard te onderzoeken hoe trekspanning invloed op de differentiatie van oligodendrocyten en de daaropvolgende myelination van axonen, dat is een kritisch proces in de gewervelde centrale zenuwstelsel. Met behulp van een op maat ontworpen stam apparaat en elastomere multiwell platen, vorige werken9,10 hebben aangetoond dat statische éénassige stam kan oligodendrocyte differentiatie te verhogen via de mondiale veranderingen in genexpressie 10. om verder inzicht te krijgen in de mechanismen van stam mechanotransduction in deze cellen, moet het vorige experimentele apparaat opnieuw worden ontworpen zoals hier beschreven, om een hoge-resolutie fluorescentie beeldvorming van kern dynamiek in het leven mogelijk te maken cellen onder spanning. Concreet, een single-well Polydimethylsiloxaan plaat is ontwikkeld, en de Imaging configuratie is vernieuwd om voor de time-lapse beeldvorming van levende cellen onder spanning met behulp van een 100x olie onderdompeling lens. Om de negatieve optische effecten van Polydimethylsiloxaan in het licht pad te elimineren, worden cellen niet door de Polydimethylsiloxaan plaat gebeeld, maar in de omgekeerde positie, door het afdekglas dat het compartiment van de cel bedekt. Met behulp van deze nieuwe Imaging design, honderden High-Resolution time-lapse films worden opgenomen, van de individuele celkern binnen intact aanhangende cellen, waar Chromatin wordt gekenmerkt door tagging histone H2B aan groene fluorescerende eiwitten. Deze films tonen aan dat de trekspanning veranderingen in Chromatin structuur en dynamica veroorzaakt die in overeenstemming met de vooruitgang van oligodendrocyte differentiatie zijn.
Live Cell Imaging onder toegepaste stam is technisch uitdagend en vereist een apparaat ontwerp dat compatibel is met de Microscoop systeem. Het aangepaste ontwerp hier beschreven biedt een goedkoop alternatief voor commerciële oplossingen. Zijn afmetingen stellen de installatie op Microscoop stadia en live-cel beeldvorming bij hoge ruimtelijke resolutie tijdens de toegepaste stam. De Imaging Setup is ontworpen om te vergemakkelijken levende cel beeldvorming met behulp van een 100x olie onderdompeling lens met de hoogste duidelijkheid, door het deksel glas, niet door de laag van Polydimethylsiloxaan plaat die anders vermindert de beeldkwaliteit en is gebruikelijk in de meeste Imaging setups onder spanning. Het apparaat, met een gemonteerde plaat met cellen, kan ook gemakkelijk worden opgeslagen in de incubator. Dit apparaat is ontworpen om éénassige stam toe te passen op Substrata dat de aanhangende cel cultuur te vergemakkelijken en handhaven van een stabiele en uniforme spanning over meerdere dagen. De hier beschreven opstelling kan voor de High-Resolution beeldvorming van diverse aanhangende cel types onder spanning worden gebruikt, die het maakt van toepassing op mechanotransduction studies op vele gebieden van cel Mechanobiology.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primary cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats 
			were provided by Dr. S. Y. Chew&#39;s lab at Nanyang Technological University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high&#160; glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11996-065-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-608-50ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-776-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Stock components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroxine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold and PDMS plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - Dow Corning Sylgard 184</td>
			<td>Ellsworth</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold - Liquid Plastic</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Smooth Cast 310 - Trail Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate Coatings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface functionalization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3648-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>13306-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63578-AK-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1110501-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain

Extracellulaire mechanische stam is bekend dat cel fenotypische reacties te lokken en heeft fysiologische relevantie in verschillende weefsel systemen. Om het effect van toegepaste extracellulaire trekspanning op cel populaties in vitro te vangen via biochemische assays, een apparaat is eerder ontworpen die kan eenvoudig worden vervaardigd en is klein genoeg om te passen in weefselkweek incubators, evenals op de top van Microscoop stadia. Echter, het vorige ontwerp van de Polydimethylsiloxaan substratum niet mogelijk hoge-resolutie subcellulaire beeldvorming via olie-onderdompeling doelstellingen. Dit werk beschrijft een herontworpen geometrie van de Polydimethylsiloxaan substratum en een aangepaste Imaging Setup die samen kunnen vergemakkelijken hoge-resolutie subcellulaire beeldvorming van levende cellen, terwijl onder toegepaste stam. Deze substratum kan worden gebruikt met dezelfde, eerder ontworpen apparaat en, dus, heeft dezelfde voordelen zoals hierboven vermeld, in aanvulling op het toestaan van hoge-resolutie optische beeldvorming. Het ontwerp van de Polydimethylsiloxaan substratum kan worden verbeterd door het opnemen van een raster dat zal vergemakkelijken het bijhouden van dezelfde cel voor en na de toepassing van de stam. Representatieve resultaten tonen een hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van fluorescerende gelabelde kernen binnen gespannen cellen gevangen met behulp van de methode hier beschreven. Deze kern dynamiek gegevens geven inzicht in het mechanisme waarmee de toegepaste trekspanning de differentiatie van oligodendrocyte voorlopercellen bevordert.

Recent werk gericht op het onderzoeken van het effect van trekspanning op oligodendrocyten10 toonde aan dat een 10% éénassige trekspanning de differentiatie van oligodendrocyte voorlopercellen door globale veranderingen in genexpressie bevordert. Het mechanisme achter deze veranderingen in genexpressie kan worden geprobeerd via de beeldvorming van subcellulaire parameters, zoals de cytoskelet structuur, transcriptiefactor lokalisatie, nucleaire dynamiek, en Chrom...

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain at JoVE.com

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Hoge-resolutie beeldvorming van kern dynamiek in levende cellen onder Éénassige trekspanning

Met behulp van een eerder ontworpen apparaat om mechanische belasting toe te passen op aanhangende cellen, dit document beschrijft een vernieuwde substratum geometrie en een aangepaste apparaat voor hoge-resolutie single-cell beeldvorming van gespannen cellen met een 100x olie onderdompeling doelstelling.

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

We hebben eerder een apparaat ontworpen om mechanische belasting toe te passen op aanhangende cellen. In het huidige werk hebben we de geometrie van het substratum opnieuw ontworpen en de setup aangepast voor hoge resolutie beeldvorming van deze stamcellen. Het belangrijkste voordeel van dit cel-stretching systeem is dat het een hoge resolutie subcellulaire beeldvorming biedt bij 100x van de stamcellen.Het aantonen van de substratum fabricage zal Vicki zijn, een onderzoeksassistent van mijn lab. Begin met het ontwerpen van een single-well polydimethylsiloxane schimmel door mee te volgen in het bijbehorende tekstprotocol. Meng vervolgens 20 delen van een polydimethylsiloxanebasis met één deel uithardingsmiddel in een wegwerpbeker.Na het gemengd worden, plaatst u het polydimethylsiloxaanmengsel gedurende 30 minuten in een vacuüm de-gasser op 0,8 bar om de bellen uit het mengsel te verwijderen. Giet vervolgens de polydimethylsiloxanemix in de mal en de schotel. Verwijder eventuele extra bellen in dit stadium door het opnieuw te vergassen op 0,8 bar vacuüm gedurende 30 minuten.Wanneer het ontgassen is voltooid, bak de monsters op 80 graden Celsius op een nivelleringstafel gedurende twee uur. Verwijder vervolgens voorzichtig de monsters uit de oven en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Snijd de randen met een mes en pel voorzichtig de genezen polydimethylsiloxaan.Op de 150 millimeter diameter polydimethylsiloxane, trek een twee centimeter bij twee centimeter raster met een marker. Binnen elk vierkant, teken een centimeter bij een centimeter vierkant, waardoor een marge van 0,5 centimeter aan alle kanten. Gebruik een mes om zorgvuldig te snijden langs de lijnen en het verkrijgen van vierkante compartimenten.Maak vervolgens de monsters schoon door ze in 100% aceton gedurende vier uur, 100% ethanol gedurende nog eens vier uur en vervolgens vier uur in autoclaved water te ontcunken. Plaats de gereinigde monsters op paraffine folie backing papier in een 150 millimeter diameter plastic schotel en droog het monster in een 80 graden Celsius oven voor vier uur. Verzegel de gerechten met paraffinefolie en bewaar ze in een koude kamer tot verder gebruik.Bereid voorloper cellen en schor ze in proliferatie medium. Zaad deze cellen met een dichtheid van 35.000 cellen per vierkante centimeter op PDL-gecoate plastic oppervlakken. Pas het volume van het proliferatiemedium aan op drie milliliter per tien centimeter in het kwadraat.Een lager volume van de media kan leiden tot celklonteren, die voortvloeien uit oppervlaktespanning krachten, terwijl een hoger volume van de media in de gerechten kan leiden tot de media te morsen over. Oogst op de derde dag na het zaaien de cellen en tel ze met een hemocytometer. Dan zaad 35,000 cellen per polydimethylsiloxane plaat met 700 microliter proliferatie medium.Voeg vervolgens een plasmische constructie toe aan het labelen van de histone H2B-complexen van de cel met groen fluorescerend eiwit door de instructies van de fabrikant te volgen. Monteer na 24 uur de polydimethylsiloxaanmonsters met cellen die op het uniaxiale stamapparaat moeten worden uitgerekt. Verander vervolgens het medium in alle monsters in differentiatiemedium.Meet de ongetrainde celcompartiment lengte en draai het stadium micrometer schroef om de lengte van het celcompartiment te verhogen met de gewenste hoeveelheid stam. Laat de uitgerekte en ongesretched polydimethylsiloxanemonsters in de couveuse op 37 graden Celsius tot beeldvorming. Bereid de microscoop incubator voor live beeldvorming door het instellen van de incubator temperatuur op 37 graden Celsius.Breng vervolgens een 100x olieonderdompelingsdoelstelling naar de centrale positie, omdat de objectieve turnit later niet toegankelijk zal zijn. Eenmaal in positie, schroef het doel en schroef het terug in elkaar met een objectieve ring, zodat het doel dichter bij de cellen kan worden gebracht. Voeg vervolgens een druppel olie toe aan het doel.Met behulp van een op maat bedrukte houder, coat de houder met vacuüm vet aan de periferie van het raam en plaats een nummer nul dikte glazen coverslip op het bovenste oppervlak van de houder. Tape het plastic venster op de microscoop stadium. Schroef vervolgens een Z-vertaalfase op het microscooppodium en verplaats deze naar de hoogste Z-positie.Verwijder 500 microliter van het medium van de uitgerekte polydimethylsiloxaneplaat die moet worden afgebeeld en voeg dit medium toe aan de glazen coverslip in het witte plastic venster. Gebruik vervolgens een steriele pincet om het vierkante compartiment voorzichtig los te maken van de polydimethylsiloxaneplaat. Houd het stamapparaat rechtop, zodat de cellen naar boven, boven het witte plastic venster gericht zijn en het stamapparaat voorzichtig omkeren, zodat een extra medium direct in het midden van de glazen coverslip met de cellen naar beneden naar beneden kan vallen.Plaats het onderste deel van het stamapparaat op de Z-vertaalfase met behulp van dubbelzijdige tape om het op zijn plaats te houden. Tijdens het kijken door het oculair onder helder-veld, heel langzaam brengen de stam apparaat naar beneden en beweeg het doel omhoog om zich te concentreren op de cellen. Voer deze focusstap langzaam uit, afwisselend het verlagen van de Z-vertaalfase en het verhogen van het doel.Als de Z-vertaalfase te veel verlaagt, kunnen de cellen comprimeren en dus afsterven. Als we het doel te hoog verhogen, kan het de glazen afdekking breken en het medium laten lekken. Scan de polydimethylsiloxaneplaat in X- en Y-richtingen om een cel te vinden die een fluorescerende kern heeft, met behulp van epiflorescentie bij 488 nanometer excitatie.Zorg er ook voor dat de cel een geschikte morfologie heeft wanneer u naar het monster onder een helder veld kijkt. Neem breedveld- of open-pinholebeelden van de kern op met 488 nanometer golflengte-excitatie en van de cel met heldere veldexcitatie met intervallen van 30 seconden per frame gedurende een totale duur van ten minste 30 minuten. De opnieuw ontworpen geometrie van het substratum polydimethylsiloxane en de beeldvormingsopstelling in deze video minimaliseren de afstand tussen de cellen en het doel.Dit maakt time-lapse beeldvorming van fluorescerend gelabelde celkernen mogelijk met behulp van een 100x olieonderdompelingsdoelstelling. Om de nucleaire schommelingen te meten, zet eerst het nucleaire gebied versus de tijd in kaart. Vervolgens detrend de gegevens met behulp van een derde orde polynomial.En tot slot, plot restschommelingen en bereken de standaarddeviatie van de resterende schommelingen. De nucleaire schommelingen van de oligodendrocyte voorlopercellen, na chemische inductie van differentiatie met en zonder een 10%trekstendam, tonen aan dat met chemische inductie alleen al de amplitude van nucleaire schommelingen een significante afname vertoonde na 48 uur, maar niet na 24 uur. Aan de andere kant vertoonde de chemische inductie samen met een treksstam van 10% een significante daling na 24 uur, die constant bleef zonder verdere vermindering na 48 uur.Het belangrijkste om te onthouden is dat de werkafstand van de gekozen doelstelling gelijk moet zijn aan of groter moet zijn dan de diepte van het celcompartiment plus de dikte van de coverslip. Het substratum kan opnieuw worden ontworpen om een raster op te nemen, wat de beeldvorming van dezelfde cel voor en na het aanbrengen van spanning zou vergemakkelijken, omdat een voor- en na-type gegevensset het geluid van experimentele fouten vermindert. Met behulp van deze imaging setup, veel subcellulaire verschijnselen binnen aanhangende levende cellen, zoals eiwitlokalisatie of dynamiek van cellulaire componenten, kan worden afgebeeld binnen enkele seconden na de toepassing van de mechanische stam.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Hoge resolutie 3D-beeldvorming van Ex-Vivo Biologische monsters door Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

Magnetisch-Assisted Remote Controlled microkatheter Tip Doorbuiging onder Magnetic Resonance Imaging

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Voorbereiding van Mica Ondersteunde lipidendubbellagen voor hoge resolutie optische microscopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...