Name: high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain at JoVE.com

Tous les auteurs reconnaissent avec gratitude le soutien financier de la Fondation nationale de la recherche de Singapour par l’entremise du groupe de recherche interdisciplinaire de l’Alliance pour la recherche et la technologie (SMART) BioSystems et micromécanique (BioSyM) de Singapour-MIT. Les auteurs Dr. Jagielska et van Vliet reconnaissent également avec gratitude le financement et le soutien de la Fondation Saks-Kavanrire. Les auteurs remercient William ONG et le Dr Sing Yian Chew de l’Université technologique de Nanyang, à Singapour, pour avoir fourni des cellules progénitrices d’oligodendrocytes de rat pour certaines expériences décrites dans ce travail, et les auteurs remercient le Dr G. V. Shivashankar de Institut de mécanobiologie, Université nationale de Singapour, Singapour, pour les discussions sur les fluctuations des zones nucléaires.

1. conception du moule de polydiméthylsiloxane à un seul puits pour l’imagerie haute résolution
Remarque: le moule pour la fabrication de plaques de polydiméthylsiloxane est conçu avec les caractéristiques suivantes pour permettre l’imagerie avec une lentille d’immersion de l’huile 100X et un ajustement correct dans le dispositif de contrainte de construction sur mesure (figure 1a, B).
<ol><li>Conservez les dimensi...

<ol>
	<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+produced+by+nerve+cells+in+tissue+culture.">Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture.</a> Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Developmental Biology. 389, (1983).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-based+theory+of+morphogenesis+and+compact+wiring+in+the+central+nervous+system.">A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system.</a> Nature. , (1997).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+Extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Research. , 103-115 (2011).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).</li><li>Niki&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).</li><li>Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+during+chronic+secondary+degeneration+in+rat+optic+nerve.">Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, (2018).</li><li>Zeiger, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+mechanical+strain+induces+capillary+endothelial+cell+cycle+re-entry+and+sprouting.">Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting.</a> Physical Biology. 13, 1-16 (2017).</li><li>Jagielska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+promotes+oligodendrocyte+differentiation+by+global+changes+of+gene+expression.">Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).</li><li>Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+spatio-temporal+fluctuations+in+chromatin+compaction+states+characterize+stem+cells.">Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells.</a> Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).</li><li>Makhija, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+alters+cellular+and+nuclear+dynamics+at+early+stages+of+oligodendrocyte+differentiation.">Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).</li></ol>

Un dispositif a déjà été conçu pour l’application de souches de traction extracellulaires sur les cellules adhérentes. La conception du substrat du polydiméthylsiloxane dans ce travail était suffisante pour les dosages biochimiques, ainsi que pour l’imagerie à basse résolution des cellules étirées. Dans ce travail, le substrat a été remanié, et une nouvelle configuration d’imagerie qui facilite l’imagerie cellulaire sous-cellulaire à haute résolution a été introduite. Le...

Les cellules et les tissus dans le corps sont soumis à divers indices mécaniques, y compris les souches de traction. Cependant, les effets de ces indices sur la biologie des cellules neuronales n’ont pas encore été étudiés de manière exhaustive et pleinement compris. Dans le système nerveux central, les sources de déformation mécanique comprennent la croissance du développement1,2,3,4, les processus physiologiques tels que la flexion de la moelle épinière, le sang et le liquide céphalo-rachidien pulsations, et pathologies telles que traumatisme, gonflement Axon, cicatrices gliales, ou croissance tumorale5,6,7,8. Il est intéressant d’étudier comment la déformation de la traction affecte la différenciation des oligodendrocytes et la myélination subséquente des axones, qui est un processus critique dans le système nerveux central des vertébrés. À l’aide d’un dispositif de déformation conçu sur mesure et de plaques multipuits en élastomère, les travaux antérieurs9,10 ont montré que la souche uniaxiale statique peut augmenter la différenciation des oligodendrocytes par des changements globaux dans l’expression des gènes 10. pour mieux comprendre les mécanismes de la mécanotransduction de la souche dans ces cellules, l’appareil expérimental précédent doit être redessiné comme décrit ici, pour permettre l’imagerie par fluorescence à haute résolution de la dynamique nucléaire dans les conditions de vie cellules sous tension. Plus précisément, une plaque de polydiméthylsiloxane à un seul puits est développée et la configuration d’imagerie est redessinée pour permettre l’imagerie en accéléré des cellules vivantes sous contrainte à l’aide d’une lentille d’immersion à l’huile de 100 x. Pour éliminer les effets optiques négatifs du polydiméthylsiloxane dans la voie de la lumière, les cellules sont imagées non pas par la plaque de polydiméthylsiloxane, mais dans la position inversée, à travers le verre de couverture couvrant le compartiment cellulaire. Grâce à cette nouvelle conception d’imagerie, des centaines de films en accéléré à haute résolution sont enregistrés, de noyaux cellulaires individuels dans des cellules adhérentes intactes, où la chromatine est étiquetée par le marquage de l’histone H2B à la protéine fluorescente verte. Ces films démontrent que la déformation par traction induit des changements dans la structure et la dynamique de la chromatine qui sont compatibles avec la progression de la différenciation des oligodendrocytes.
L’imagerie cellulaire en direct sous contrainte appliquée est techniquement difficile et nécessite une conception d’appareil compatible avec le système de microscope. La conception personnalisée décrite ici présente une alternative peu coûteuse aux solutions commerciales. Ses dimensions permettent son installation sur les stades du microscope et l’imagerie cellulaire en direct à haute résolution spatiale pendant la déformation appliquée. La configuration d’imagerie est conçue pour faciliter l’imagerie cellulaire en direct à l’aide d’une lentille d’immersion à l’huile de 100 x avec la plus grande clarté, à travers le verre de couverture, pas par la couche de la plaque de polydiméthylsiloxane qui, autrement, diminue la qualité de l’image et est commune dans la plupart configurations d’imagerie sous tension. L’appareil, avec une plaque montée contenant des cellules, peut également être stocké facilement dans l’incubateur. Cet appareil est conçu pour appliquer une souche uniaxiale à des substrats qui facilitent la culture de cellules adhérentes et maintiennent une souche stable et uniforme sur plusieurs jours. La configuration décrite ici peut être utilisée pour l’imagerie haute résolution de divers types de cellules adhérentes sous contrainte, ce qui le rend applicable aux études de mécanotransduction dans de nombreux domaines de la mécanobiologie cellulaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primary cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats 
			were provided by Dr. S. Y. Chew&#39;s lab at Nanyang Technological University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high&#160; glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11996-065-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-608-50ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-776-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Stock components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroxine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold and PDMS plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - Dow Corning Sylgard 184</td>
			<td>Ellsworth</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold - Liquid Plastic</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Smooth Cast 310 - Trail Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate Coatings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface functionalization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3648-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>13306-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63578-AK-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1110501-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain

La souche mécanique extracellulaire est connue pour susciter des réponses phénotypiques cellulaires et a une pertinence physiologique dans plusieurs systèmes tissulaires. Pour capter l’effet de la déformation extracellulaire appliquée sur les populations cellulaires in vitro via des dosages biochimiques, un dispositif a déjà été conçu qui peut être fabriqué simplement et est assez petit pour s’adapter à l’intérieur des incubateurs de culture tissulaire, ainsi que sur le dessus de étapes du microscope. Cependant, la conception antérieure du substrat de polydiméthylsiloxane n’autorisait pas l’imagerie subcellulaire à haute résolution par des objectifs d’immersion en huile. Ce travail décrit une géométrie redessinée du substrat de polydiméthylsiloxane et une configuration d’imagerie personnalisée qui, ensemble, peut faciliter l’imagerie sous-cellulaire à haute résolution des cellules vivantes pendant la déformation appliquée. Ce substrat peut être utilisé avec le même appareil conçu précédemment et, par conséquent, a les mêmes avantages que énumérés ci-dessus, en plus d’autoriser l’imagerie optique haute résolution. La conception du substrat de polydiméthylsiloxane peut être améliorée en incorporant une grille qui facilitera le suivi de la même cellule avant et après l’application de la souche. Les résultats représentatifs démontrent une imagerie en accéléré à haute résolution des noyaux marqués fluorescemment dans les cellules tendues capturées à l’aide de la méthode décrite ici. Ces données sur la dynamique nucléaire donnent un aperçu du mécanisme par lequel la souche de traction appliquée favorise la différenciation des cellules progénitrices des oligodendrocytes.

Des travaux récents visant à étudier l’effet de la contrainte de traction sur les oligodendrocytes10 ont montré qu’une souche de traction uniaxiale de 10% favorise la différenciation des cellules progénitrices d’oligodendrocytes par des changements globaux dans l’expression des gènes. Le mécanisme derrière ces changements dans l’expression génique peut être sondé par l’imagerie des paramètres subcellulaires, tels que la structure du cytosqu...

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain at JoVE.com

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Imagerie à haute résolution de la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes sous contrainte de traction uniaxiale

À l’aide d’un dispositif conçu antérieurement pour appliquer une déformation mécanique aux cellules adhérentes, cet article décrit une géométrie de substrat redessinée et un appareil personnalisé pour l’imagerie à une seule cellule à haute résolution de cellules tendues avec un objectif d’immersion en huile de 100 x.

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Nous avons déjà conçu un dispositif pour appliquer une souche mécanique aux cellules adhérentes. Dans les travaux actuels, nous avons repensé la géométrie du substrat et personnalisé la configuration de l’imagerie haute résolution de ces cellules souches. Le principal avantage de ce système d’étirement cellulaire est qu’il fournit une imagerie subcellulaire à haute résolution à 100x des cellules souches.Vicki, assistante de recherche de mon laboratoire, démontrera la fabrication du substrat. Commencez par concevoir un moule en polydiméthane très bien en suivant le protocole texte qui l’accompagne. Ensuite, mélangez 20 parties d’une base en polydiméthylsiloxane avec un agent de séchage de pièce dans une tasse jetable.Une fois mélangé, placer le mélange de polydimethylsiloxane dans un vide de-gasser à 0,8 bar pendant 30 minutes pour enlever les bulles du mélange. Verser ensuite le mélange de poly diméthylsiloxane dans le moule et le plat. Enlevez les bulles supplémentaires à ce stade en la dé-gazant à nouveau à vide de 0,8 bar pendant 30 minutes.Lorsque le dé-gazage est terminé, cuire les échantillons à 80 degrés Celsius sur une table de nivellement pendant deux heures. Ensuite, retirez soigneusement les échantillons du four et laissez-les refroidir à température ambiante. Couper les bords à l’arme d’une lame et éplucher délicatement le polydiméthane séché.Sur le polydimethylsiloxane de 150 millimètres de diamètre, dessiner une grille de deux centimètres par deux centimètres avec un marqueur. Dans chaque carré, dessiner un centimètre par un centimètre carré, laissant une marge de 0,5 centimètres de tous les côtés. Utilisez une lame pour couper soigneusement le long des lignes et obtenir des compartiments carrés.Ensuite, nettoyez les échantillons en les incubant à 100% d’acétone pendant quatre heures, 100% éthanol pendant quatre heures supplémentaires, puis dans de l’eau autoclavée pendant quatre heures. Placez les échantillons nettoyés sur du papier sulfurisé à l’intérieur d’un plat en plastique de 150 millimètres de diamètre et séchez l’échantillon dans un four de 80 degrés Celsius pendant quatre heures. Une fois terminé, sceller les plats avec du film de paraffine et les conserver dans une chambre froide jusqu’à nouvel usage.Préparer les cellules progénitrices et les suspendre dans un milieu de prolifération. Ensemencer ces cellules à une densité de 35 000 cellules par centimètre carré sur des surfaces en plastique recouvertes de PDL. Ajuster le volume du milieu de prolifération à trois millilitres par dix centimètres carrés de surface.Un volume plus faible de médias peut entraîner l’agglutination des cellules, résultant des forces de tension de surface, tandis qu’un volume plus élevé de médias dans les plats peut provoquer un débordement des médias. Le troisième jour après l’ensemencement, récoltez les cellules et comptez-les à l’aide d’un hémomètre. Puis, graine 35 000 cellules par plaque de polydiméthane et 700 microlitres de milieu de prolifération.Ensuite, ajoutez une construction plasmique à l’étiquetage des complexes histone H2B de la cellule avec des protéines fluorescentes vertes en suivant les instructions du fabricant. Après 24 heures, monter les échantillons de polydiméthaneiloxane avec des cellules à étirer sur le dispositif de contrainte uniaxiale. Ensuite, changez le milieu dans tous les échantillons en milieu de différenciation.Mesurez la longueur non tendue du compartiment cellulaire et tournez la vis du micromètre de scène pour augmenter la longueur du compartiment cellulaire par la quantité de contrainte désirée. Laissez les échantillons de poly diméthylsiloxane étirés et non tendus dans l’incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à l’imagerie. Préparez l’incubateur au microscope pour l’imagerie vivante en fixant la température de l’incubateur à 37 degrés Celsius.Ensuite, apportez un objectif d’immersion d’huile 100x à la position centrale, car le turnit objectif ne sera pas accessible plus tard. Une fois en position, dévissez l’objectif et vissez-le de nouveau avec un anneau objectif, de sorte que l’objectif peut être rapproché des cellules. Ensuite, ajouter une goutte d’huile à l’objectif.À l’aide d’un support imprimé sur mesure, enduire le support de graisse sous vide à la périphérie de la fenêtre et placer un couvercle en verre d’épaisseur zéro sur la surface supérieure du support. Collez la fenêtre en plastique sur l’étape du microscope. Ensuite, vissez une étape de traduction Z sur l’étape du microscope et déplacez-la vers la position Z la plus élevée.Retirez 500 microlitres du milieu de la plaque de polydiméthane étirée pour être photographié, et ajoutez ce milieu sur le couvercle en verre dans la fenêtre en plastique blanc. Ensuite, utilisez une paire de pinces stériles pour détacher soigneusement le compartiment carré de la plaque de polydimethylsiloxane. Maintenez le dispositif de contrainte dans une position verticale de sorte que les cellules soient orientées vers le haut, au-dessus de la fenêtre en plastique blanc et inversent soigneusement le dispositif de contrainte, de sorte que laisser n’importe quel milieu supplémentaire tomber directement au milieu du coverslip en verre avec les cellules faisant face vers le bas.Placez la partie inférieure de l’appareil de contrainte sur l’étape de traduction Z à l’aide de ruban adhésif à double face pour le maintenir en place. Tout en regardant à travers l’oculaire sous le champ lumineux, très lentement apporter le dispositif de contrainte vers le bas et déplacer l’objectif vers le haut pour se concentrer sur les cellules. Effectuez cette étape de focalisation lentement, en alternant entre l’abaissement de l’étape de traduction Z et l’élévation de l’objectif.Si l’étape de traduction Z s’abaisse trop, les cellules pourraient se comprimer et donc mourir. Si nous élevons l’objectif trop haut, il pourrait briser le couvercle en verre et provoquer une fuite du milieu. Scannez la plaque de polydiméthane dans les directions X et Y pour trouver une cellule qui a un noyau fluorescent, en utilisant l’épiflorescence à 488 nanomètres excitation.Assurez-vous également que la cellule a une morphologie appropriée lorsque vous regardez l’échantillon sous un champ lumineux. Enregistrez des images à champ large ou à sténopé ouvert du noyau avec 488 nanomètres d’excitation de longueur d’onde et de la cellule avec excitation de champ lumineux à intervalles de 30 secondes par image pour une durée totale d’au moins 30 minutes. La géométrie redessinée du substrat de polydimethylsiloxane et la configuration d’imagerie montrée dans cette vidéo minimisent la distance entre les cellules et l’objectif.Cela permet l’imagerie en accéléré des noyaux cellulaires étiquetés fluorescents à l’aide d’un objectif d’immersion d’huile 100x. Pour mesurer les fluctuations nucléaires, tracez d’abord la zone nucléaire par rapport au temps. Ensuite, détendez les données à l’aide d’un polynomial de troisième ordre.Enfin, tracez les fluctuations résiduelles et calculez l’écart type des fluctuations résiduelles. Les fluctuations nucléaires des cellules progénitrices d’oligodendrocyte, suivant l’induction chimique de la différenciation avec et sans souche de 10%tensile, montrent qu’avec l’induction chimique seule, l’amplitude des fluctuations nucléaires a montré une diminution significative à 48 heures, mais pas à 24 heures. D’autre part, l’induction chimique avec une souche 10%tensile a montré une diminution significative à 24 heures, qui est restée constante sans autre réduction à 48 heures.La chose la plus importante à retenir est que la distance de travail de l’objectif choisi doit être égale ou supérieure à la profondeur du compartiment cellulaire plus l’épaisseur du coverslip. Le substrat peut être repensé pour intégrer une grille, ce qui faciliterait l’imagerie de la même cellule avant et après l’application de la souche, car un type avant et après de l’ensemble de données réduit le bruit provenant d’une erreur expérimentale. À l’aide de cette configuration d’imagerie, de nombreux phénomènes subcellulaires dans les cellules vivantes adhérentes, tels que la localisation des protéines ou la dynamique des composants cellulaires, peuvent être photographiés en quelques secondes après l’application de la souche mécanique.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Haute résolution à fibre optique pour les Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Recherche

Bio-ingénierie

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution Imaging 3D des Ex-Vivo Échantillons biologiques par Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Continue observation microscopique à haute résolution de réplicative vieillissement chez la levure de bourgeonnement

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

Magnétique assistée à distance de déviation contrôlée Astuce Microcatheter sous imagerie par résonance magnétique

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Évaluation initiale des anticorps-conjugués modifié avec Peptides viraux dérivés pour accroître l’Accumulation cellulaire et améliorer le ciblage tumoral

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...