Name: high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00
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Alle Autoren danken der Unterstützung durch die National Research Foundation of Singapore durch die interdisziplinäre Forschungsgruppe Singapure-MIT Alliance for Research and Technology (SMART) BioSystems und Mikromechanik (BioSyM). Die Autoren Dr. Jagielska und Dr. Van Vliet danken auch der Finanzierung und Unterstützung der Saks-Kavanaugh Stiftung. Die Autoren danken William Ong und Dr. Sing Yian Chew von der Nanyang Technological University, Singapur, für die Bereitstellung von Rattenoligodendrocyte-Vorläuferzellen für einige Experimente, die in diesem Werk beschrieben werden, und die Autoren danken Dr. G. V. Shivashankar von Mechanobiologie Institut, National University of Singapore, Singapur, für Diskussionen über nukleare Flächenschwankungen.

1. Design der Einbrunnen-Polydimethylsiloxan-Form für hochauflösende Bildgebung
Hinweis: Die Form zur Herstellung von Polydimethylsiloxan-Platten ist mit folgenden Eigenschaften ausgestattet, um eine Bildgebung mit einer 100x Öltauchlinse und einer korrekten Passform in die maßgeschneiderte Dehnungsvorrichtung (Abbildung 1A, B) zu ermöglichen.
<ol><li>Halten Sie die gesamten Plattenmaße so, dass sie in die Klemmen der Dehn...

<ol>
	<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+produced+by+nerve+cells+in+tissue+culture.">Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture.</a> Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Developmental Biology. 389, (1983).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-based+theory+of+morphogenesis+and+compact+wiring+in+the+central+nervous+system.">A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system.</a> Nature. , (1997).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+Extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Research. , 103-115 (2011).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).</li><li>Niki&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).</li><li>Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+during+chronic+secondary+degeneration+in+rat+optic+nerve.">Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, (2018).</li><li>Zeiger, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+mechanical+strain+induces+capillary+endothelial+cell+cycle+re-entry+and+sprouting.">Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting.</a> Physical Biology. 13, 1-16 (2017).</li><li>Jagielska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+promotes+oligodendrocyte+differentiation+by+global+changes+of+gene+expression.">Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).</li><li>Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+spatio-temporal+fluctuations+in+chromatin+compaction+states+characterize+stem+cells.">Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells.</a> Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).</li><li>Makhija, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+alters+cellular+and+nuclear+dynamics+at+early+stages+of+oligodendrocyte+differentiation.">Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).</li></ol>

Ein Gerät wurde zuvor1 für den Einsatz von extrazellulärer Zugbelastung der anhaftenden Zellen entwickelt. Das Design des Polydimethylsiloxan-Substrats, das für biochemische Untersuchungen geeignet war, sowie die niedrig auflösende Abbildung von gestreckten Zellen. In dieser Arbeit wurde das Substrat neu gestaltet und eine neuartige bildgebende Konfiguration eingeführt, die hochauflösende subzelluläre Live-Zell-Bildgebung ermöglicht. Die Vorteile dieses Systems sind vielfältig: Es kann i...

Zellen und Gewebe im Körper werden verschiedenen mechanischen Ketten ausgesetzt, darunter auch Zugstämme. Die Auswirkungen dieser Hinweise auf die Biologie neuronaler Zellen sind jedoch noch nicht umfassend untersucht und vollständig verstanden worden. Im zentralen Nervensystem sind die Quellen der mechanischen Belastung das Entwicklungswachstumvon 1,2,3,4, physiologische Prozesse wie Rückenmarksbiegung, Blut und Hirnspinalflüssigkeit. Pulsierung und pathologische Zustände wie Trauma, Axonschwellung, Gliollennarbung oder Tumorwachstum5,6,7,8. Es lohnt sich zu untersuchen, wie sich Zugbelastung auf die Differenzierung von Oligodendrozyten und die anschließende Myelination von Axonen auswirkt, was ein kritischer Prozess im Wirbelsäulenmittelnervensystem ist. Mit Hilfe eines maßgeschneiderten Dehnungsgerätes und einer elastomeren Multiwell-Platte haben frühere Arbeiten9,10gezeigt , dass statische Einblutungsstrapazen die Oligodendrozytendifferenzierung durch globale Veränderungen der Genexpression erhöhen können. 10. Um ein weiteres Verständnis der Mechanismen der Dehnungsmechanotransduktion in diesen Zellen zu gewinnen, muss der bisherige Experimentalapparat so umgestaltet werden, wie er hier beschrieben wird, um eine hochauflösende Fluoreszenz-Abbildung der nuklearen Dynamik im Leben zu ermöglichen. Zellen unter Belastung. Konkret wird eine einfallsbringende Polydimethylsiloxan-Platte entwickelt, und die Bildkonfiguration wird neu gestaltet, um die Zeitraffer-Abbildung lebender Zellen unter Belastung durch eine 100x Öl-Tauchlinse zu ermöglichen. Um die negativen optischen Effekte von Polydimethylsiloxan im Lichtweg zu eliminieren, werden Zellen nicht durch die Polydimethylsiloxan-Platte, sondern in der umgekehrten Position durch das Deckglas abgebildet, das das Zellfach bedeckt. Mit diesem neuen bildgebenden Design werden hunderte von hochauflösenden Zeitraffer-Filmen aufgenommen, von einzelnen Zellkernen innerhalb intakter, anhaftierter Zellen, in denen Chromatin durch die Markierung von Histon H2B auf grünes fluoreszierendes Protein gekennzeichnet wird. Diese Filme zeigen, dass Zugstrapazen Veränderungen in der Chromatin-Struktur und-Dynamik induzieren, die mit dem Fortschreiten der Oligodendrozyten-Differenzierung im Einklang stehen.
Die Live-Zell-Bildgebung unter aufgesetzter Belastung ist technisch anspruchsvoll und erfordert ein mit dem Mikroskop-System kompatibles Gerätedesign. Das hier beschriebene individuelle Design stellt eine kostengünstige Alternative zu kommerziellen Lösungen dar. Seine Abmessungen ermöglichen den Einbau auf Mikroskop-Stufen und Live-Zell-Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung während der aufgetragenen Belastung. Das bildgebende Setup soll die Bildgebung von lebenden Zellen mit einer 100-fach-Öltauchlinse mit höchster Klarheit durch das Deckglas erleichtern, nicht durch die Schicht der Polydimethylsiloxan-Platte, die sonst die Bildqualität verringert und in den meisten Fällen üblich ist. Bildgebende Setups unter Belastung. Das Gerät, mit einer montierten Platte, die Zellen enthält, lässt sich auch einfach im Inkubator lagern. Dieses Gerät ist so konzipiert, dass es Substraten, die die anhaftende Zellkultur erleichtern und eine stabile und gleichmäßige Belastung über mehrere Tage hinweg erhalten, uniaxiale Belastung aufträgt. Das hier beschriebene Setup kann für die hochauflösende Abbildung verschiedener anhaftender Zelltypen unter Belastung genutzt werden, was es für Mechanotransduktionsstudien in vielen Bereichen der Zellmechanobiologie geeignet macht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primary cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats 
			were provided by Dr. S. Y. Chew&#39;s lab at Nanyang Technological University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high&#160; glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11996-065-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-608-50ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-776-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Stock components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroxine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold and PDMS plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - Dow Corning Sylgard 184</td>
			<td>Ellsworth</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold - Liquid Plastic</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Smooth Cast 310 - Trail Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate Coatings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface functionalization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3648-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>13306-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63578-AK-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1110501-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain

Es ist bekannt, dass eine technische Belastung für zellphälenförmige Reaktionen eine physiologische Relevanz in mehreren Gewebesystemen hervorruft. Um die Wirkung der aufgetragenen extrazellulären Zugbelastung auf die Zellpopulationen in vitro durch biochemische Assays zu erfassen, wurde zuvor ein Gerät entwickelt, das einfach hergestellt werden kann und klein genug ist, um Inkubatoren der Gewebekultur zu integrieren, sowie darüber hinaus Mikroskop-Stufen. Die bisherige Gestaltung des Polydimethylsiloxan-Substratums erlaubte jedoch keine hochauflösende subzelluläre Bildgebung über Öl-Immersionsziele. Diese Arbeit beschreibt eine neu gestaltete Geometrie des polydimethylsiloxanen Substrats und eine maßgeschneiderte Bildgebung, die zusammen eine hochauflösende subzelluläre Bildgebung lebender Zellen unter Auftragen der Last ermöglichen kann. Dieses Substrat kann mit dem gleichen, früher entworfenen Gerät verwendet werden und hat somit die gleichen Vorteile wie oben aufgelistet, zusätzlich zu einer hochauflösenden optischen Bildgebung. Das Design des Polydimethylsiloxan-Substratums kann durch die Einbettung eines Gitters verbessert werden, das die Verfolgung der gleichen Zelle vor und nach der Anwendung der Belastung erleichtert. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine hochauflösende Zeitraffer-Abbildung von fluoreszierend beschrifteten Kernen in angespannten Zellen, die mit der hier beschriebenen Methode erfasst werden. Diese Daten der nuklearen Dynamik geben Einblicke in den Mechanismus, durch den die angewandte Zugbelastung die Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen fördert.

Jüngste Arbeiten, die darauf abzielten, die Wirkung von Zugbelastung auf Oligodendrozyten10 zu untersuchen, zeigten, dass eine 10% uniaxiale Zugbelastung die Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch globale Veränderungen der Genexpression fördert. Der Mechanismus hinter diesen Veränderungen der Genexpression kann durch die Abbildung subzellulärer Parameter, wie der Zytoskelettstruktur, der Transkriptionsfaktor-Lokalisierung, der nuklearen Dy...

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High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Hochauflösende Bildgebung von Kerndynamik in Live-Zellen unter Uniaxialer Tensile-Straße

Mit Hilfe eines zuvor entwickelten Geräts zur mechanischen Belastung von Anbauzellen beschreibt dieser Beitrag eine neu gestaltete Substratum-Geometrie und ein maßgeschneidertes Gerät zur hochauflösenden Einzeller-Abbildung von angespannten Zellen mit einem 100x Öl-Immersionsziel.

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Wir haben bereits ein Gerät entwickelt, um mechanische Dehnungaufhalten auf haftende Zellen anzuwenden. In der aktuellen Arbeit haben wir die Geometrie des Substratums neu gestaltet und das Setup für die hochauflösende Bildgebung dieser Stammzellen angepasst. Der Hauptvorteil dieses Zell-Stretching-Systems ist, dass es eine hochauflösende subzelluläre Bildgebung bei 100-fachen der Stammzellen bietet.Die Substratum-Fertigung demonstriert Vicki, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor. Beginnen Sie mit dem Entwerfen einer Single-Well-Polydimethylsiloxan-Form, indem Sie dem begleitenden Textprotokoll folgen. Als nächstes mischen Sie 20 Teile einer Polydimethylsiloxan-Basis mit einem Teilhärtungsmittel in einem Einwegbecher.Nach dem Mischen die Polydimethylsiloxan-Mischung in einen Vakuum-Engasser bei 0,8 bar für 30 Minuten legen, um die Blasen aus der Mischung zu entfernen. Dann gießen Sie die Polydimethylsiloxan-Mischung in die Form und die Schale. Entfernen Sie in dieser Phase alle zusätzlichen Blasen, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 0,8 bar Vakuum wieder entgasen.Wenn die Entgasung abgeschlossen ist, backen Sie die Proben bei 80 Grad Celsius auf einem Nivellierungstisch für zwei Stunden. Als nächstes entfernen Sie die Proben vorsichtig aus dem Ofen und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen. Schneiden Sie die Kanten mit einer Klinge und schälen Sie das ausgehärtete Polydimethylsiloxan vorsichtig heraus.Zeichnen Sie auf dem Polydimethylsiloxan mit einem Durchmesser von 150 Millimetern ein zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter großes Gitter mit einem Marker. Zeichnen Sie innerhalb jedes Quadrats einen Zentimeter mal einen Zentimeter Quadrat, so dass auf allen Seiten ein Rand von 0,5 Zentimetern übrig bleibt. Verwenden Sie eine Klinge, um sorgfältig entlang der Linien zu schneiden und quadratische Fächer zu erhalten.Als nächstes reinigen Sie die Proben, indem Sie sie vier Stunden lang in 100% Aceton, für weitere vier Stunden 100% Ethanol und dann vier Stunden lang in autoklaviertem Wasser gießen. Legen Sie die gereinigten Proben auf Paraffinfolienunterlagepapier in eine Kunststoffschale mit einem Durchmesser von 150 Millimetern und trocknen Sie die Probe vier Stunden lang in einem 80-Grad-Celsius-Ofen. Wenn Sie fertig sind, versiegeln Sie die Gerichte mit Paraffinfolie und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung in einem Kühlraum.Bereiten Sie Vorläuferzellen vor und suspendieren Sie sie im Proliferationsmedium. Säen Sie diese Zellen mit einer Dichte von 35.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf PDL-beschichtete Kunststoffoberflächen. Passen Sie das Volumen des Proliferationsmediums auf drei Milliliter pro zehn Zentimeter Quadratfläche an.Ein geringeres Medienvolumen kann zu Zellverklumpung führen, die durch Oberflächenspannungskräfte entsteht, während ein höheres Medienvolumen in den Schalen dazu führen kann, dass die Medien überschwappen. Am dritten Tag nach der Aussaat die Zellen ernten und mit einem Hämozytometer zählen. Dann Samen 35 000 Zellen pro Polydimethylsiloxan-Platte mit 700 Mikroliter Proliferationsmedium.Als Nächstes fügen Sie ein Plasmisches Konstrukt hinzu, um die Histon-H2B-Komplexe der Zelle mit grünem fluoreszierendem Protein zu beschriften, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Montieren Sie nach 24 Stunden die Polydimethylsiloxan-Proben mit Zellen, die auf der uniaxialen Dehnungsvorrichtung gedehnt werden sollen. Ändern Sie dann das Medium in allen Proben in Differenzierungsmedium.Messen Sie die untrainierte Zellkompartimentlänge und drehen Sie die Bühnenmikrometerschraube, um die Zellfachlänge um die gewünschte Dehnung zu erhöhen. Lassen Sie die gestreckten und ungestreckten Polydimethylsiloxan-Proben im Inkubator bei 37 Grad Celsius bis zur Bildgebung. Bereiten Sie den Mikroskop-Inkubator für die Live-Bildgebung vor, indem Sie die Inkubatortemperatur auf 37 Grad Celsius einstellen.Als nächstes bringen Sie ein 100-faches Öl-Immersionsziel in die zentrale Position, da die objektive Drehung später nicht mehr zugänglich sein wird. Sobald sie in Position sind, schrauben Sie das Objektiv ab und schrauben Es mit einem Objektivring wieder zusammen, damit das Ziel näher an die Zellen gebracht werden kann. Fügen Sie dann einen Tropfen Öl zum Ziel hinzu.Mit einem kundenspezifisch bedruckten Halter den Halter mit Vakuumfett am Rand des Fensters beschichten und eine Nummer Null Dicke Glasabdeckung auf die Oberseite des Halters legen. Kleben Sie das Kunststofffenster auf die Mikroskopbühne. Als nächstes schrauben Sie eine Z-Übersetzungsstufe auf die Mikroskopstufe und bewegen Sie sie in die oberste Z-Position.Entfernen Sie 500 Mikroliter des Mediums von der zu bebilderten gestreckten Polydimethylsiloxanplatte, und fügen Sie dieses Medium auf den Glasdeckel im weißen Kunststofffenster ein. Verwenden Sie dann eine sterile Pinzette, um das quadratische Fach vorsichtig von der Polydimethylsiloxan-Platte zu lösen. Halten Sie die Dehnungsvorrichtung in einer aufrechten Position, so dass die Zellen nach oben, über dem weißen Kunststofffenster und vorsichtig invertieren sie die Dehnungsvorrichtung, so dass jedes zusätzliche Medium direkt in der Mitte der Glasabdeckung mit nach unten gerichteten Zellen abfallen kann.Legen Sie den unteren Teil des Zuggeräts mit doppelseitigem Klebeband auf die Z-Übersetzungsstufe, um ihn an Ort und Stelle zu halten. Beim Blick durch das Okular unter hellem Feld, sehr langsam bringen Sie das Dehnungsgerät nach unten und bewegen Sie das Ziel nach oben, um sich auf die Zellen zu konzentrieren. Führen Sie diesen Fokussierungsschritt langsam durch, indem Sie zwischen dem Absenken der Z-Übersetzungsstufe und der Erhöhung des Ziels wechseln.Wenn die Z-Übersetzungsstufe zu stark absinkt, könnten die Zellen komprimieren und damit absterben. Wenn wir das Ziel zu hoch anheben, könnte es den Glasdeckel brechen und das Medium auslaufen lassen. Scannen Sie die Polydimethylsiloxan-Platte in X- und Y-Richtung, um eine Zelle zu finden, die einen fluoreszierenden Kern hat, mit Epifloreszenz bei 488 Nanometern Anregung.Stellen Sie außerdem sicher, dass die Zelle über eine geeignete Morphologie verfügt, wenn Sie die Probe unter hellem Feld betrachten. Zeichnen Sie Weitfeld- oder Offenelochbilder des Kerns mit 488 Nanometern Wellenlängenanregung und der Zelle mit Hellfeldanregung in 30-Sekunden-Intervallen pro Frame für eine Gesamtdauer von mindestens 30 Minuten auf. Die neu gestaltete Geometrie des Polydimethylsiloxan-Substrats und das in diesem Video gezeigte Bildgebungs-Setup minimiert den Abstand zwischen den Zellen und dem Objektiv.Dies ermöglicht eine Zeitraffer-Bildgebung von fluoreszierend markierten Zellkernen mit einem 100-fachen Öl-Immersion-Objektiv. Um die nuklearen Schwankungen zu messen, planen Sie zuerst das Kerngebiet im Vergleich zur Zeit. Dann detrendieren Sie die Daten mit einem Polynom dritter Ordnung.Und schließlich, diagramm Restschwankungen und berechnen Standardabweichung der Restschwankungen. Die nuklearen Schwankungen der Oligodendrozytor-Vorläuferzellen nach chemischer Induktion der Differenzierung mit und ohne 10%Zugstamm zeigen, dass bei chemischer Induktion allein die Amplitude von Kernschwankungen bei 48 Stunden, aber nicht bei 24 Stunden signifikant abnahm. Auf der anderen Seite zeigte die chemische Induktion zusammen mit einem 10%stensiven Stamm einen signifikanten Rückgang nach 24 Stunden, der ohne weitere Reduktion bei 48 Stunden konstant blieb.Das Wichtigste, was man sich merken sollte, ist, dass der Arbeitsabstand des gewählten Ziels gleich oder größer sein sollte als die Tiefe des Zellfachs plus die Dicke des Deckels. Das Substratum kann neu gestaltet werden, um ein Raster zu integrieren, das die Bildgebung derselben Zelle vor und nach der Anwendung des Stammes erleichtern würde, da ein Vorher-Nachher-Dataset-Typ das Rauschen reduziert, das durch experimentelle Fehler entsteht. Mit diesem bildgebenden Setup können viele subzelluläre Phänomene innerhalb anhaftender Lebendzellen, wie die Proteinlokalisierung oder die Dynamik zellulärer Komponenten, innerhalb von Sekunden nach der Anwendung der mechanischen Dehnung abbilden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Forschung

Biotechnik

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

Magnetisch-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Durchbiegung unter Magnetic Resonance Imaging

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

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Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Erstbewertung der Antikörper-Konjugate mit Viral-abgeleitete Peptide zur Erhöhung der zellulären Akkumulation und Verbesserung der Tumor gezielt modifiziert

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