Name: high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain at JoVE.com

כל המחברים בהכרת תודה מימון תמיכה מתוך קרן המחקר הלאומי של סינגפור דרך הברית סינגפור-MIT למחקר וטכנולוגיה (SMART) BioSystems ו Micromechanics (BioSyM) קבוצת מחקר רב-תחומי. המחברים ד ר ג'יאלאסקה וד ר ואן ולליט גם מממנים בהכרת תודה ותמיכה מקרן סאקס-קאבוונוב. המחברים מודים לוויליאם אונג וד ר סינג יאנאן ללעוס מהאוניברסיטה הטכנולוגית של נניאנג, סינגפור, למתן תאים אוליגודנדרוציטים בחולדות לניסויים מסוימים המתוארים בעבודה זו, והמחברים מודים לד ר ג. ושואשאני מ מכון מכונאי, האוניברסיטה הלאומית של סינגפור, סינגפור, לדיונים על תנודות באזור הגרעיני.

1. עיצוב התבנית היחידה להדמיה ברזולוציה גבוהה
הערה: התבנית לייצור לוחות polydiמתיל siloxane מתוכנן עם התכונות הבאות כדי לאפשר דימות עם עדשת השמן 100x טבילה והתאמה נכונה התקן מותאם אישית לבנות המכשיר (איור 1A, B).
<ol><li>לשמור על מידות לוחית הכולל כגון ז?...

<ol>
	<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+produced+by+nerve+cells+in+tissue+culture.">Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture.</a> Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Developmental Biology. 389, (1983).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-based+theory+of+morphogenesis+and+compact+wiring+in+the+central+nervous+system.">A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system.</a> Nature. , (1997).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+Extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Research. , 103-115 (2011).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).</li><li>Niki&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).</li><li>Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+during+chronic+secondary+degeneration+in+rat+optic+nerve.">Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, (2018).</li><li>Zeiger, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+mechanical+strain+induces+capillary+endothelial+cell+cycle+re-entry+and+sprouting.">Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting.</a> Physical Biology. 13, 1-16 (2017).</li><li>Jagielska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+promotes+oligodendrocyte+differentiation+by+global+changes+of+gene+expression.">Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).</li><li>Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+spatio-temporal+fluctuations+in+chromatin+compaction+states+characterize+stem+cells.">Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells.</a> Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).</li><li>Makhija, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+alters+cellular+and+nuclear+dynamics+at+early+stages+of+oligodendrocyte+differentiation.">Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).</li></ol>

המכשיר בעבר1 תוכנן עבור היישום של מתיחה לחילוץ מאמץ על תאים חסיד. העיצוב של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane בעבודה הזאת היה מספיק עבור ביוכימיים, כמו גם הדמיה ברזולוציה נמוכה של תאים נמתח. בעבודה זו, עוצב מחדש שכבת המשנה, ותצורה של הדמיה מקורית המסייעת להדמיית תאים משנית ברזולוציה גבו?...

תאים ורקמות בגוף חשופים רמזים מכניים שונים, כולל זנים מתיחה. עם זאת, ההשפעות של רמזים אלה על ביולוגיה של תאים עצביים עדיין לא נחקרו בהרחבה והבינו באופן מלא. במערכת העצבים המרכזית, מקורות זן מכני כוללים צמיחה התפתחותית1,2,3,4, תהליכים פיזיולוגיים כגון כיפוף חוט השדרה, דם ונוזל שדרתי ומצבים פתולוגיים כגון טראומה, הנפיחות אקסון, הצטלקות גליה, או צמיחה הגידול5,6,7,8. כדאי לחקור כיצד זן מתיחה משפיע על הבידול של oligodendrocytes הפוך ואת מיאלואידית הבאים של אקסונים, שהוא תהליך קריטי במערכת העצבים המרכזית של בעלי החוליות. באמצעות מותאם אישית מעוצב המכשיר מאמץ ולוחיות אלסטומרים multiwell, העבודות הקודמות9,10 הראו כי זן סטטי של היחידה יכול להגדיל בידול באמצעות שינויים גלובליים ביטוי גנטי 10. כדי להשיג הבנה נוספת של המנגנונים של מנגנון הלחץ בתאים אלה, המנגנון הנסיוני הקודם חייב להיות מחדש כמתואר כאן, כדי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של קרינה פלואורסצנטית של דינמיקה גרעינית בחיים תאים תחת לחץ. באופן ספציפי, צלחת בודדת polydiמתיל siloxane מפותחת, ואת התצורה הדמיה מחדש כדי לאפשר את הדמיה בזמן לפקיעה של תאים חיים תחת זן באמצעות עדשת השמן 100x טבילה. כדי לחסל את ההשפעות האופטיות השליליות של polydiמתיל siloxane במסלול האור, התאים הם התמונה לא דרך הצלחת polydiמתיל siloxane, אבל בתנוחה הפוכה, דרך הזכוכית לכסות כיסוי תא התא. באמצעות עיצוב זה הדמיה חדשה, מאות ברזולוציה גבוהה הזמן לפקיעה סרטים נרשמות, של גרעיני תא בודדים בתוך תאים חסיד שלמים, שם כרומטין מתויג על ידי תיוג היסטון H2B לחלבון פלורסנט ירוק. סרטים אלה מדגימים כי זן מתיחה גורם שינויים מבנה כרומטין ודינמיקה כי הם עקביים עם ההתקדמות של אוליגודנדרוציטים בידול.
הדמיה של תאים חיים תחת זן שימושית היא מאתגרת טכנית ודורש עיצוב המכשיר תואם את מערכת המיקרוסקופ. העיצוב המותאם אישית המתואר כאן מציג חלופה זולה לפתרונות מסחריים. מימדים שלה לאפשר ההתקנה שלה על שלבי מיקרוסקופ לחיות הדמיה של התא ברזולוציה מרחבית גבוהה במהלך מאמץ להחיל. ההתקנה הדמיה נועד להקל על הדמיית תאים חיים באמצעות עדשת השמן 100x טבילה עם הבהירות הגבוהה ביותר, דרך זכוכית העטיפה, לא דרך השכבה של צלחת polydiמתיל siloxane אשר אחרת מקטין את איכות התמונה נפוצה ביותר כיוונוני הדמיה תחת לחץ. המכשיר, עם צלחת רכוב המכיל תאים, ניתן גם לאחסן בקלות בחממה. התקן זה נועד להחיל זן uniaxial כדי שכבות להקל על תרבות התא מחסיד ולשמור על מאמץ יציב ואחיד על פני ימים מרובים. ההתקנה המתוארת כאן יכולה לשמש עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של סוגי תאים שונים החסיד מתחת ללחץ, מה שהופך אותו לרלוונטי ללימודי מכניזציה בתחומים רבים של תא מכניאוביולוגיה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primary cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats 
			were provided by Dr. S. Y. Chew&#39;s lab at Nanyang Technological University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high&#160; glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11996-065-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-608-50ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-776-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Stock components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroxine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold and PDMS plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - Dow Corning Sylgard 184</td>
			<td>Ellsworth</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold - Liquid Plastic</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Smooth Cast 310 - Trail Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate Coatings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface functionalization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3648-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>13306-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63578-AK-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1110501-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain

זן מכני מכניים ידוע לעורר תגובות פנוטיות תאים והוא בעל רלוונטיות פיזיולוגית במספר מערכות רקמה. כדי ללכוד את ההשפעה של מאמץ מתיחה שימושית הלחץ על אוכלוסיות תאים בתוך מבחנה באמצעות ביוכימיים הביוכימי, המכשיר תוכנן בעבר אשר יכול להיות מפוברק פשוט הוא קטן מספיק כדי להתאים בתוך מחממות התרבות רקמות, כמו גם על גבי שלבי המיקרוסקופ. עם זאת, העיצוב הקודם של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane לא אפשרו הדמיה משנית ברזולוציה גבוהה באמצעות מטרות טבילה בשמן. עבודה זו מתארת את הגיאומטריה המחודש של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane ואת הגדרת הדמיה מותאמת אישית כי ביחד יכול להקל על הדמיה משנית ברזולוציה גבוהה של תאים חיים בעוד תחת לחץ מוחל. ניתן להשתמש ברובד משנה זה עם אותו התקן מעוצב מוקדם יותר, ומכאן, יש יתרונות זהים לאלה המפורטים לעיל, בנוסף להתרת הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה. העיצוב של שכבת המשנה polydiמתיל siloxane ניתן לשפר על ידי שילוב של רשת אשר להקל על מעקב אחר אותו תא לפני ואחרי היישום של זן. תוצאות הנציג להפגין ברזולוציה גבוהה לפקיעה זמן הדמיה של גרעיני בעלי תווית בתוך תאים מתוחים שנתפסו באמצעות השיטה המתוארת כאן. נתונים אלה הדינמיקה הגרעינית לתת תובנות לתוך המנגנון שבו לחץ מתיחה להחיל מקדם הבידול של תאים אוליגודנדרוציטים קדמון.

העבודה האחרונה שמטרתה לחקור את ההשפעה של זן מתיחה על oligodendrocytes הפוך10 הראה כי 10% זן מתיחה uniaxial מקדם את הבידול של תאים אוליגודנדרוציטים קדמון על ידי שינויים גלובליים ביטוי הגנים. המנגנון מאחורי שינויים אלה ביטוי הגנים ניתן לנחקר באמצעות הדמיה של פרמטרים subcellular,...

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain at JoVE.com

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

ברזולוציה גבוהה הדמיה של דינמיקה גרעינית בתאים חיים תחת מתיחה Uniaxial המתח

באמצעות התקן שתוכנן בעבר כדי להחיל זן מכני לתאים חסיד, נייר זה מתאר גיאומטריה תת שכבה מחדש מכשיר מותאם אישית עבור ברזולוציה גבוהה תא יחיד הדמיה של תאים מתוחים עם המטרה טבילה 100x שמן.

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

עיצבנו בעבר מכשיר כדי להחיל זן מכני על תאים חסידים. בעבודה הנוכחית, עיצבנו מחדש את הגיאומטריה של תת-המצע והתאמנו אישית את ההתקנה להדמיה ברזולוציה גבוהה של תאי זן אלה. היתרון העיקרי של מערכת זו מתיחת תאים היא שהיא מספקת הדמיה תת תאית ברזולוציה גבוהה ב 100x של תאי המתח.הפגנת ייצור התת-סטרטום תהיה ויקי, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. התחל בתכנון תבנית פולי דימימתילסילוקסאן באורך של באר אחת על-ידי ביצוע בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, מערבבים 20 חלקים של בסיס polydimethylsiloxane עם חלק אחד ריפוי סוכן ב חד פעמית.לאחר ערבוב, מניחים את תערובת polydimethylsiloxane בוואקום de-gasser ב 0.8 בר במשך 30 דקות כדי להסיר את הבועות מן התערובת. לאחר מכן, יוצקים את תערובת polydimethylsiloxane לתוך התבנית ואת המנה. הסר את כל בועות נוספות בשלב זה על ידי de-gassing אותו שוב ב 0.8 בר ואקום במשך 30 דקות.כאשר ביטול הגזים הושלם, אופים את הדגימות ב 80 מעלות צלזיוס על שולחן פילינג במשך שעתיים. לאחר מכן, להסיר בזהירות את הדגימות מהתנור ולתת להם להתקרר לטמפרטורת החדר. חותכים את הקצוות עם להב בעדינות לקלף את polydimethylsiloxane נרפא.על פולידימתילסילוקסאן בקוטר 150 מילימטר, צייר רשת של שני סנטימטרים בשני סנטימטרים עם סמן. בתוך כל ריבוע, לצייר סנטימטר אחד על ידי ריבוע סנטימטר אחד, משאיר מרווח של 0.5 ס"מ מכל הצדדים. השתמש בלהב כדי לחתוך בזהירות לאורך הקווים ולקבל תאים מרובעים.לאחר מכן, לנקות את הדגימות על ידי דגירה אותם 100% אצטון במשך ארבע שעות, 100% אתנול במשך ארבע שעות נוספות, ולאחר מכן במים autoclaved במשך ארבע שעות. מניחים את הדגימות המנוקות על נייר גיבוי של סרט פרפין בתוך צלחת פלסטיק בקוטר 150 מ"מ ומייבשים את הדגימה בתנור של 80 מעלות במשך ארבע שעות. בסיום, לאטום את הכלים עם סרט פרפין ולאחסן אותם בחדר קר עד לשימוש נוסף.להכין תאים מולדים ולהשעות אותם במדיום התפשטות. זרע תאים אלה בצפיפות של 35, 000 תאים לס"מ מרובע על משטחי פלסטיק מצופים PDL. כוונן את נפח אמצעי ההתפשטות לשלושה מיליליטר לכל עשרה ס"מ בריבוע של שטח הפנים.נפח נמוך יותר של מדיה עלול להוביל לגוש תאים, הנובע ממתח פנים, בעוד נפח גבוה יותר של מדיה במנות עלול לגרום לתקשורת לזלוג. ביום השלישי לאחר הזריעה, לקצור את התאים ול לספור אותם באמצעות hemocytometer. לאחר מכן, זרע 35, 000 תאים לכל צלחת polydimethylsiloxane עם 700 microliters של מדיום התפשטות.לאחר מכן, הוסיפו מבנה פלסמי לתיוג מתחמי H2B של התא עם חלבון פלואורסצנטי ירוק על ידי ביצוע הוראות היצרן. לאחר 24 שעות, הר את דגימות polydimethylsiloxane עם תאים להיות מתוח על המכשיר זן uniaxial. לאחר מכן, לשנות את המדיום בכל הדגימות למדיום ההתברות.למדוד את אורך תא התא ללא מעצורים ולהפוך את בורג מיקרומטר הבמה כדי להגדיל את אורך תא התא על ידי כמות הרצויה של המתח. השאירו את דגימות הפולידמימתילסילוקסאן המתוחות והבלתי מרוסנות באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס עד להדמיה. הכינו את חממת המיקרוסקופ להדמיה חיה על ידי קביעת טמפרטורת החממה ל-37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להביא יעד טבילת שמן 100x לעמדה המרכזית, כמו התור האובייקטיבי לא יהיה נגיש מאוחר יותר. ברגע בעמדה, לבטל את המטרה לדפוק אותו בחזרה יחד עם טבעת אובייקטיבית, כך המטרה ניתן לקרב את התאים. לאחר מכן, להוסיף טיפת שמן למטרה.בעזרת מחזיק מודפס בהתאמה אישית, מצפים את המחזיק בשומן ואקום בשולי החלון ומ מניחים כיסוי זכוכית בעובי אפס מספר על המשטח העליון של המחזיק. תדביק את חלון הפלסטיק לשלב המיקרוסקופ. לאחר מכן, בורג שלב תרגום Z על הבמה מיקרוסקופ להעביר אותו למיקום Z העליון ביותר.הסר 500 microliters של המדיום מן צלחת polydimethylsiloxane מתוח להיות בתמונה, ולהוסיף מדיום זה על כיסויי הזכוכית בחלון פלסטיק לבן. לאחר מכן, השתמש בזוג פינצטה סטרילית כדי לנתק בזהירות את התא המרובע מצלחת polydimethylsiloxane. החזק את התקן המתח במצב זקוף כך שהתאים פונים כלפי מעלה, מעל חלון הפלסטיק הלבן והפוך בזהירות את התקן המתח, כדי לאפשר לכל מדיום נוסף לרדת ישירות באמצע כיסוי הזכוכית כשהתאים פונים כלפי מטה.מקם את החלק התחתון של התקן המתח על במת התרגום Z באמצעות קלטת דו-צדדית כדי להחזיק אותו במקומו. תוך כדי התבוננות דרך העינית תחת שדה בהיר, לאט מאוד להביא את התקן המתח למטה ולהזיז את המטרה למעלה כדי להתמקד בתאים. בצעו את צעד ההתמקדות באיטיות, לסירוגין בין הורדת שלב תרגום Z לבין העלאת המטרה.אם שלב התרגום Z מוריד יותר מדי, התאים יכולים לדחוס ומכאן למות. אם אנחנו מעלים את המטרה גבוהה מדי, זה יכול לשבור את כיסוי הזכוכית ולגרום למדיום לדלוף. סרוק את לוחית הפולי דימימתילסילוקסאן בכיווני X ו- Y כדי למצוא תא שיש לו גרעין פלואורסצנטי, באמצעות תפרחת ב 488 ננומטר עירור.כמו כן, ודא שלתא יש מורפולוגיה מתאימה בעת התבוננות בדגימה תחת שדה בהיר. הקלט תמונות רחבות-שדה או פתח-חור של הגרעין עם 488 ננומטרים של עירור באורך גל ותא עם עירור שדה בהיר במרווחים של 30 שניות למסגרת למשך כולל של 30 דקות לפחות. הגיאומטריה שעוצבה מחדש של תת-האסטרטום polydimethylsiloxane ומערך ההדמיה המוצג בסרטון זה ממזערים את המרחק בין התאים לבין המטרה.זה מאפשר הדמיה לשגות זמן של גרעיני תאים המסומן באופן פלואורסצנטי באמצעות מטרה טבילת שמן 100x. כדי למדוד את התנודות הגרעיניות, תחילה לתכנן את האזור הגרעיני לעומת הזמן. לאחר מכן, לחץ על הנתונים באמצעות פולינום מסדר שלישי.ולבסוף, תנודות שיורית העלילה ולחשב סטיית תקן של התנודות שיורית. התנודות הגרעיניות של תאי האחווה אוליגודנדרוציטים, בעקבות אינדוקציה כימית של התברואה עם ובלי זן מתיחה של 10%, מראות כי עם אינדוקציה כימית בלבד, משרעת של תנודות גרעיניות הראתה ירידה משמעותית ב 48 שעות, אבל לא ב 24 שעות. מצד שני, אינדוקציה כימית יחד עם זן מתיחה 10% הראו ירידה משמעותית ב 24 שעות, אשר נשאר קבוע ללא הפחתה נוספת ב 48 שעות.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא כי מרחק העבודה של המטרה שנבחרה צריך להיות שווה או גדול יותר מעומק תא התא בתוספת עובי הכיסוי. ניתן לעצב מחדש את תת-המצע כך שישלב רשת, דבר שיקל על הדמיית אותו תא לפני ואחרי יישום של זן, שכן סוג של ערכת נתונים לפני ואחרי מפחית את הרעש המגיע משגיאה ניסיונית. באמצעות הגדרת הדמיה זו, ניתן לדמיין תופעות תת-תאיות רבות בתאים חיים חסידיים, כגון לוקליזציה של חלבונים או דינמיקה של רכיבים תאיים, תוך שניות מיישום הזן המכאני.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של Ex-Vivo דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרו-CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

הסטת Assisted-מגנטי מרחוק מבוקרת Microcatheter עצה תחת הדמיית תהודה מגנטית

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...