Name: high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00
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Tutti gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno al finanziamento della National Research Foundation di Singapore attraverso il gruppo di ricerca interdisciplinare di Singapore-MIT Alliance for Research e Technology (SMART) BioSystems e Micromechanics (BioSyM). Gli autori Dr. Jagielska e Dr. van Vliet riconoscono con gratitudine anche il finanziamento e il sostegno della Fondazione Saks-Kavanaugh. Gli autori ringraziano William ONG e Dr. Sing Yian Chew della Nanyang Technological University, Singapore, per aver fornito cellule progenitrici del ratto oligodendrocyte per alcuni esperimenti descritti in questo lavoro, e gli autori ringraziano il dottor G. V. Shivashankar da Istituto di meccanobiologia, Università nazionale di Singapore, Singapore, per le discussioni sulle fluttuazioni dell'area nucleare.

1. progettazione dello stampo a singolo pozzetto in polidimetilsilossano per immagini ad alta risoluzione
Nota: lo stampo per la produzione di lastre di polidimetilsilossano è stato progettato con le seguenti caratteristiche per consentire l'imaging con una lente di immersione a olio 100x e una corretta misura nel dispositivo di deformazione personalizzato-Build (Figura 1a, B).
<ol><li>Mantenere le dimensioni complessive della ...

<ol>
	<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+produced+by+nerve+cells+in+tissue+culture.">Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture.</a> Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Developmental Biology. 389, (1983).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-based+theory+of+morphogenesis+and+compact+wiring+in+the+central+nervous+system.">A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system.</a> Nature. , (1997).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+Extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Research. , 103-115 (2011).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).</li><li>Niki&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).</li><li>Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+during+chronic+secondary+degeneration+in+rat+optic+nerve.">Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, (2018).</li><li>Zeiger, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+mechanical+strain+induces+capillary+endothelial+cell+cycle+re-entry+and+sprouting.">Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting.</a> Physical Biology. 13, 1-16 (2017).</li><li>Jagielska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+promotes+oligodendrocyte+differentiation+by+global+changes+of+gene+expression.">Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).</li><li>Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+spatio-temporal+fluctuations+in+chromatin+compaction+states+characterize+stem+cells.">Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells.</a> Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).</li><li>Makhija, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+alters+cellular+and+nuclear+dynamics+at+early+stages+of+oligodendrocyte+differentiation.">Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).</li></ol>

Un dispositivo ha precedentemente1 stato progettato per l'applicazione di sforzo di trazione extracellulare su cellule aderenti. Il disegno del substrato di polidimetilsilossano in quel lavoro era sufficiente per i saggi biochimici, così come l'imaging a bassa risoluzione delle cellule allungate. In questo lavoro, il substrato è stato ridisegnato e è stata introdotta una nuova configurazione di imaging che facilita l'imaging cellulare subcellulare ad alta risoluzione. I vantaggi di questo siste...

Cellule e tessuti nel corpo sono sottoposti a vari spunti meccanici, compresi i ceppi di trazione. Tuttavia, gli effetti di questi spunti sulla biologia delle cellule neurali non sono ancora stati studiati ampiamente e compresi completamente. Nel sistema nervoso centrale, le fonti di ceppo meccanico includono la crescita dello sviluppo1,2,3,4, processi fisiologici come piegatura del midollo spinale, sangue e liquido cerebrospinale pulsazioni e condizioni patologiche come trauma, gonfiore assone, cicatrici gliali o crescita tumorale5,6,7,8. Vale la pena di indagare su come la tensione di trazione influisce sulla differenziazione degli oligodendrociti e sulla successiva mielinazione degli assoni, che è un processo critico nel sistema nervoso centrale dei vertebrati. Utilizzando un dispositivo di deformazione personalizzato e piastre multipozzetto elastomeriche, i lavori precedenti9,10 hanno dimostrato che la deformazione uniassiale statica può aumentare la differenziazione dell'oligodendrocyte attraverso cambiamenti globali nell'espressione genica 10. per ottenere un'ulteriore comprensione dei meccanismi di meccanotrasduzione della deformazione in queste cellule, il precedente apparato sperimentale deve essere ridisegnato come descritto qui, per consentire l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione delle dinamiche nucleari in vita cellule sotto sforzo. In particolare, viene sviluppata una piastra di polidimetilsilossano monopozzetto e la configurazione di imaging è ridisegnata per consentire l'imaging time-lapse di cellule vive sotto sforzo utilizzando una lente di immersione a olio 100x. Per eliminare gli effetti ottici negativi del polidimetilsilossano nel percorso della luce, le cellule vengono immagine non attraverso la piastra di polidimetilsilossano, ma nella posizione invertita, attraverso il vetro di copertura che copre il compartimento cellulare. Utilizzando questo nuovo design di imaging, vengono registrate centinaia di filmati time-lapse ad alta risoluzione, di singoli nuclei di cellule all'interno di cellule aderenti integre, dove la cromatina è etichettata mediante l'etichettatura dell'istone H2B in proteine fluorescenti verdi. Questi film dimostrano che la tensione di trazione induce cambiamenti nella struttura della cromatina e nelle dinamiche che sono coerenti con la progressione della differenziazione dell'oligodendrocyte.
L'imaging a cellule vive sotto sforzo applicato è tecnicamente impegnativo e richiede un design del dispositivo compatibile con il sistema del microscopio. Il design personalizzato qui descritto presenta un'alternativa economica alle soluzioni commerciali. Le sue dimensioni consentono l'installazione su stadi del microscopio e l'imaging delle cellule vive ad alta risoluzione spaziale durante la deformazione applicata. La configurazione dell'imaging è progettata per facilitare l'imaging delle cellule in tempo reale utilizzando una lente di immersione a olio 100x con la massima chiarezza, attraverso il vetro di copertura, non attraverso lo strato di piastra in polidimetilsilossano che altrimenti diminuisce la qualità dell'immagine ed è comune nella maggior parte configurazioni di imaging sotto sforzo. Il dispositivo, con una piastra montata contenente celle, può anche essere conservato facilmente nell'incubatrice. Questo dispositivo è progettato per applicare la deformazione uniassiale a substrati che facilitano la coltura delle cellule aderenti e mantengono una deformazione stabile e uniforme in più giorni. La configurazione descritta qui può essere utilizzata per l'imaging ad alta risoluzione di vari tipi di cellule aderenti sotto sforzo, rendendolo applicabile agli studi di meccanotrasduzione in molti campi della meccanobiologia cellulare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primary cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats 
			were provided by Dr. S. Y. Chew&#39;s lab at Nanyang Technological University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high&#160; glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11996-065-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-608-50ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-776-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Stock components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroxine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold and PDMS plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - Dow Corning Sylgard 184</td>
			<td>Ellsworth</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold - Liquid Plastic</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Smooth Cast 310 - Trail Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate Coatings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface functionalization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3648-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>13306-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63578-AK-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1110501-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain

Ceppo meccanico extracellulare è noto per suscitare risposte fenotipiche cellulari e ha rilevanza fisiologica in diversi sistemi tissutali. Per catturare l'effetto dello sforzo di trazione extracellulare applicato sulle popolazioni cellulari in vitro attraverso saggi biochimici, un dispositivo è stato precedentemente progettato che può essere fabbricato semplicemente ed è abbastanza piccolo da adattarsi all'interno di incubatori di coltura tissutale, così come sopra fasi del microscopio. Tuttavia, il precedente disegno del substrato di polidimetilsilossano non ha consentito l'imaging subcellulare ad alta risoluzione attraverso obiettivi di immersione in olio. Questo lavoro descrive una geometria ridisegnata del substrato di polidimetilsilossano e una configurazione di imaging personalizzata che insieme può facilitare l'imaging subcellulare ad alta risoluzione delle cellule vive mentre è sotto sforzo applicato. Questo substrato può essere utilizzato con lo stesso dispositivo progettato in precedenza e, quindi, ha gli stessi vantaggi di cui sopra, oltre a consentire l'imaging ottico ad alta risoluzione. Il design del substrato di polidimetilsilossano può essere migliorato incorporando una griglia che faciliterà il tracciamento della stessa cellula prima e dopo l'applicazione della deformazione. I risultati rappresentativi dimostrano l'imaging time-lapse ad alta risoluzione di nuclei con etichetta fluorescente all'interno di cellule tese catturate utilizzando il metodo descritto qui. Questi dati di dinamica nucleare forniscono approfondimenti sul meccanismo mediante il quale la deformazione a trazione applicata favorisce la differenziazione delle cellule progenitrici dell'oligodendrocyte.

I recenti lavori volti a indagare l'effetto della deformazione a trazione sugli oligodendrociti10 hanno mostrato che un ceppo di trazione uniassiale del 10% promuove la differenziazione delle cellule progenitrici dell'oligodendrocyte mediante cambiamenti globali nell'espressione genica. Il meccanismo dietro questi cambiamenti nell'espressione genica può essere sondato attraverso l'imaging dei parametri subcellulari, come la struttura del citoscheletro, la localizz...

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High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Imaging ad alta risoluzione di dinamiche nucleari in cellule vive sotto tensione uniassiale

Utilizzando un dispositivo progettato in precedenza per applicare la deformazione meccanica alle celle aderenti, questo documento descrive una geometria del substrato ridisegnata e un apparato personalizzato per l'imaging a cella singola ad alta risoluzione delle cellule tese con un obiettivo di immersione in olio 100x.

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

In precedenza abbiamo progettato un dispositivo per applicare la deformazione meccanica alle celle aderenti. Nel lavoro attuale, abbiamo ridisegnato la geometria del substrato e personalizzato la configurazione per l'imaging ad alta risoluzione di queste cellule di deformazione. Il vantaggio principale di questo sistema di allungamento cellulare è che fornisce un imaging subcellulare ad alta risoluzione a 100 volte le cellule di deformazione.A dimostrare la fabbricazione del substrato sarà Vicki, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Inizia progettando uno stampo in polidimetilsiloxano a pozzo singolo seguendo il protocollo di testo di accompagnamento. Quindi, mescolare 20 parti di una base di polidimetilsilossano con un agente polimerizzante di una parte in una tazza monouso.Una volta miscelato, posizionare la miscela di polidimetilsilossano in un de-gassatore sottovuoto a 0,8 bar per 30 minuti per rimuovere le bolle dalla miscela. Quindi, versare il mix di polidimetilossano nello stampo e nel piatto. Rimuovere eventuali bolle aggiuntive in questa fase de-gaszzando di nuovo a 0,8 bar di vuoto per 30 minuti.Al termine della de-gassificazione, cuocere i campioni a 80 gradi Celsius su un tavolo di livellamento per due ore. Quindi, rimuovere con cura i campioni dal forno e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. Tagliare i bordi con una lama e sbucciare delicatamente il polidimetilsiloxano stagionato.Sulla griglia di 150 millimetri di diametro polidimetilossano, disegnare una griglia di due centimetri per due centimetri con un marcatore. All'interno di ogni quadrato, disegnare un centimetro per un centimetro quadrato, lasciando un margine di 0,5 centimetri su tutti i lati. Utilizzare una lama per tagliare con cura lungo le linee e ottenere scomparti quadrati.Quindi, pulire i campioni incubandoli in acetone al 100% per quattro ore, 100% etanolo per altre quattro ore e quindi in acqua autoclavata per quattro ore. Posizionare i campioni puliti sulla carta di supporto del film di paraffina all'interno di un piatto di plastica di 150 millimetri di diametro e asciugare il campione in un forno a 80 gradi Celsius per quattro ore. Al termine, sigillare i piatti con pellicola di paraffina e conservarli in una stanza fredda fino a un ulteriore utilizzo.Preparare le cellule progenitrici e sospenderle nel mezzo di proliferazione. Semina queste cellule ad una densità di 35.000 cellule per centimetro quadrato su superfici plastiche rivestite di PDL. Regolare il volume del mezzo di proliferazione a tre millilitri per dieci centimetri quadrati di superficie.Un volume inferiore di mezzi può portare al raggruppamento cellulare, derivante da forze di tensione superficiale, mentre un volume più elevato di mezzi nei piatti può causare la fuoriuscita del supporto. Il terzo giorno dopo la semina, raccogliere le cellule e contarle usando un emocitometro. Quindi, seminare 35.000 cellule per piastra di polidimetilsilossano con 700 microlitri di mezzo di proliferazione.Successivamente, aggiungi un costrutto plasmatico per etichettare i complessi H2B istono della cellula con proteine fluorescenti verdi seguendo le istruzioni del produttore. Dopo 24 ore, montare i campioni di polidimetilsilossano con cellule da allungare sul dispositivo di deformazione uniassiale. Quindi, cambiare il mezzo in tutti i campioni in mezzo di differenziazione.Misurare la lunghezza del compartimento cellulare non teso e ruotare la vite del micrometro dello stadio per aumentare la lunghezza del compartimento cellulare della quantità di deformazione desiderata. Lasciare i campioni di polidimetilossano di polidimetilsilano allungati e non allungati nell'incubatrice a 37 gradi Celsius fino all'imaging. Preparare l'incubatore di microscopi per l'imaging dal vivo impostando la temperatura dell'incubatore a 37 gradi Celsius.Successivamente, porta un obiettivo di immersione dell'olio 100x nella posizione centrale, poiché la svolta oggettiva non sarà accessibile in seguito. Una volta in posizione, svitare l'obiettivo e avvitarlo insieme a un anello obiettivo, in modo che l'obiettivo possa essere avvicinato alle celle. Quindi, aggiungi una goccia di olio all'obiettivo.Utilizzando un supporto stampato su misura, rivestire il supporto con grasso sottovuoto alla periferia della finestra e posizionare un copriscivolo in vetro a spessore zero sulla superficie superiore del supporto. Nastro la finestra di plastica sul palco del microscopio. Successivamente, avvitare una fase di traslazione Z sullo stadio del microscopio e spostarla nella posizione Z più in alto.Rimuovere 500 microlitri del mezzo dalla piastra di polidimetilsiloxane allungata da imaged, e aggiungere questo mezzo sul coverslip di vetro nella finestra di plastica bianca. Quindi, utilizzare un paio di pinzette sterili per staccare con cura il compartimento quadrato dalla piastra di polidimetilsiloxano. Tenere il dispositivo di deformazione in posizione verticale in modo che le celle siano rivolte verso l'alto, sopra la finestra di plastica bianca e invertire attentamente il dispositivo di deformazione, in modo da lasciare cadere qualsiasi mezzo extra direttamente al centro del coperchio di vetro con le celle rivolte verso il basso.Posizionare la parte inferiore del dispositivo di deformazione sullo stadio di traslazione Z utilizzando nastro a doppia mano per tenerlo in posizione. Mentre guardi attraverso l'oculare sotto un campo luminoso, porta molto lentamente il dispositivo di deformazione verso il basso e sposta l'obiettivo verso l'alto per concentrarti sulle cellule. Eseguire lentamente questo passaggio di messa a fuoco, alternando l'abbassamento della fase di traduzione Z e l'innalzamento dell'obiettivo.Se la fase di traslazione Z si abbassa troppo, le celle potrebbero comprimere e quindi morire. Se alziamo l'obiettivo troppo in alto, potrebbe rompere il coperchio del vetro e causare la perdita del mezzo. Scansionare la piastra polidimetilossano in direzioni X e Y per trovare una cellula che abbia un nucleo fluorescente, usando l'epiflorescenza a 488 nanometri di eccitazione.Assicurarsi inoltre che la cellula abbia una morfologia appropriata quando si guarda il campione sotto un campo luminoso. Registrare immagini a campo largo o a foro aperto del nucleo con 488 nanometri di eccitazione della lunghezza d'onda e della cellula con eccitazione a campo luminoso a intervalli di 30 secondi per fotogramma per una durata totale di almeno 30 minuti. La geometria ridisegnata del substrato di polidimetilossano e la configurazione di imaging mostrata in questo video riducono al minimo la distanza tra le cellule e l'obiettivo.Ciò consente l'imaging time-lapse di nuclei cellulari etichettati fluorescentmente utilizzando un obiettivo di immersione dell'olio 100x. Per misurare le fluttuazioni nucleari, tracciare prima l'area nucleare rispetto al tempo. Quindi, detrend i dati utilizzando un polinomio di terzo ordine.Infine, tracciare le fluttuazioni residue e calcolare la deviazione standard delle fluttuazioni residue. Le fluttuazioni nucleari delle cellule progenitrici degli oligodendrociti, a seguito dell'induzione chimica della differenziazione con e senza un ceppo di trazione del 10%, mostrano che con la sola induzione chimica, l'ampiezza delle fluttuazioni nucleari ha mostrato una diminuzione significativa a 48 ore, ma non a 24 ore. D'altra parte, l'induzione chimica e una tensione di trazione del 10% hanno mostrato una diminuzione significativa a 24 ore, che è rimasta costante senza ulteriori riduzioni a 48 ore.La cosa più importante da ricordare è che la distanza di lavoro dell'obiettivo scelto dovrebbe essere uguale o maggiore della profondità del compartimento cellulare più lo spessore del coverslip. Il substrato può essere riprogettato per incorporare una griglia, che faciliterebbe l'imaging della stessa cella prima e dopo l'applicazione dello sforzo, poiché un tipo di set di dati prima e dopo riduce il rumore proveniente da errori sperimentali. Utilizzando questa configurazione di imaging, molti fenomeni subcellulari all'interno di cellule vive aderenti, come la localizzazione proteica o la dinamica dei componenti cellulari, possono essere immagini in pochi secondi dall'applicazione del ceppo meccanico.

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