Name: high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain at JoVE.com

모든 저자는 연구 및 기술 (스마트) 바이오 시스템 및 마이크로 역학 연구 그룹에 대 한 싱가포르-MIT 얼라이언스를 통해 싱가포르 국립 연구 재단의 자금 지원을 기꺼이 인정 합니다. 저자, 야기 엘 스 카 박사와 반 블 릿 박사는 또한 Saks-카바 나 프 재단의 기금과 지원을 감사 하 게 인정 합니다. 저자는이 작품에 설명 된 몇 가지 실험에 대 한 쥐 oligodendrocyte 전구 세포를 제공 하기 위해, 싱가포르 난 양 기술 대학교에서 윌리엄 Ong 박사 노래 Yian 씹는 감사 합니다, 저자는 박사 g. v. Shivashankar 감사 원자력 지역 변동에 대 한 논의에 대 한 싱가포르, 싱가포르의 국립 대학, 기계 생물학 연구소.

1. 고해상도 이미징을 위한 단일 웰 실록 금형 설계
참고: 실록 플레이트 제조용 몰드는 100 배 오일 침 지 렌즈를 사용 하 여 이미징을 가능 하 게 하 고 맞춤 제작 변형 장치 (그림 1a, B)에 정확 하 게 맞도록 다음과 같은 기능으로 설계 되었습니다.
<ol><li>스트레인 장치의 클램프에 맞도록 전체 플레이트 치수를 유지 합니다. ?...

<ol>
	<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+produced+by+nerve+cells+in+tissue+culture.">Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture.</a> Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Developmental Biology. 389, (1983).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-based+theory+of+morphogenesis+and+compact+wiring+in+the+central+nervous+system.">A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system.</a> Nature. , (1997).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+Extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Research. , 103-115 (2011).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).</li><li>Niki&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).</li><li>Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+during+chronic+secondary+degeneration+in+rat+optic+nerve.">Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, (2018).</li><li>Zeiger, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+mechanical+strain+induces+capillary+endothelial+cell+cycle+re-entry+and+sprouting.">Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting.</a> Physical Biology. 13, 1-16 (2017).</li><li>Jagielska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+promotes+oligodendrocyte+differentiation+by+global+changes+of+gene+expression.">Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).</li><li>Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+spatio-temporal+fluctuations+in+chromatin+compaction+states+characterize+stem+cells.">Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells.</a> Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).</li><li>Makhija, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+alters+cellular+and+nuclear+dynamics+at+early+stages+of+oligodendrocyte+differentiation.">Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).</li></ol>

장치는 이전에 부착 세포에 세포 외 인장 긴장의 응용 프로그램을 위해 설계 되었습니다. 그 일에 있는 실록 하 층의 디자인은 생화학 분석을 위해 충분 했습니다, 기지개 한 세포의 저해상도 화상 진 찰 뿐 아니라. 이 작품에서, 하 층은 재설계 되었고, 고해상도의 세포 성 살아있는 세포 이미징을 용이 하 게 하는 새로운 이미징 구성이 도입 되었다. 이 시스템의 장점은 여러 가?...

바디에 있는 세포 그리고 조직은 장력 긴장을 포함 하 여 각종 기계적인 단서를 복종 됩니다. 그러나, 신경 세포의 생물학에 대 한 이러한 단서의 효과 아직 광범위 하 게 공부 하 고 완전히 이해 하지. 중추 신 경계에서 기계적 변형의 원인으로는발달 성장1,2,3,4, 척수 벤딩, 혈액 및 뇌 척 수액과 같은 생리 학적 과정이 포함 됩니다. 맥 동 및 외상, 축 삭 부 종, 신경 교 흉터 또는 종양 성장5,6,8과 같은 병리학 적 상태. 인장 변형이 oligodendrocytes의 분화와 축 삭의 후속 초 화에 영향을 미치는 방법을 조사 하는 것이 가치가 있다,이는 척추 동물 중추 신 경계에서 중요 한 과정 이다. 사용자 정의 설계 된 스트레인 디바이스와 엘라 스토 머 멀티 웰 플레이트를 사용 하 여, 이전 작품9,10 은 정적 일축 변형이 유전자 발현 의 글로벌 변화를 통해 oligodendrocyte 분화를 증가 시킬 수 있음을 보여주었다 10.이 세포에서 스트레인 기계 전달의 메커니즘에 대 한 이해를 돕기 위해, 이전 실험 장치는 여기에 기술 된 바와 같이 재설계 되어야 하며, 생활에서의 핵 역학의 고해상도 형광 이미징을 가능 하 게 합니다. 셀을 변형 합니다. 구체적으로는 단일 웰 실록 플레이트가 개발 되 고 이미징 구성이 재설계 되어 100 배 오일 침 지 렌즈를 사용 하 여 균 주 하에서 라이브 셀의 타임 랩 스 이미징이 가능 하도록 설계 되었습니다. 빛 통로에서 실록의 부정적인 광학적 효과를 없애기 위해, 세포는 실록 판을 거치지 않고, 거꾸로 위치 하 고, 커버 글래스를 통해 세포 구획을 덮는 것을 이미지화 한다. 이 새로운 이미징 디자인을 사용 하 여, 수백 개의 고해상도 타임 랩 스 영화가 기록 됩니다, 여기서 염색 질은 녹색 형광 단백질에 히스톤 H2B 태그에 의해 표시 되는, 온전한 부착 세포 내에서 개별 세포 핵. 이러한 영화는 인장 변형이 oligodendrocyte 분화의 진행과 일치 하는 크로마 틴 구조 및 역학의 변화를 유도 한다는 것을 증명 한다.
적용 된 스트레인 하에서의 살아있는 세포 화상 진 찰은 기술적으로 도전적이 고 현미경 시스템과 호환이 되는 장치 디자인이 필요 합니다. 여기에 설명 된 사용자 정의 디자인은 상업용 솔루션에 대 한 저렴 한 대안을 제시 합니다. 그것의 차원은 적용 한 긴장 도중 높은 공간 해결책에 있는 현미경 단계 및 살아있는 세포 화상 진 찰에 그것의 설치를 가능 하 게 합니다. 이미징 설정은 이미지 품질을 저하 시키는 실록 plate의 레이어를 거치지 않고 커버 글래스를 통해 가장 높은 선명도를 가진 100 배 오일 침 지 렌즈를 사용 하 여 라이브 셀 이미징이 가능 하도록 설계 되었으며 대부분의 경우 이미징 설정을 변형 합니다. 장치는 세포를 포함 하는 거치 된 격판덮개로, 또한 인큐베이터에서 쉽게 저장 될 수 있습니다. 이 장치는 부착 세포 배양을 용이 하 게 하 고 여러 날에 걸쳐 안정적이 고 균일 한 변형을 유지 하는 서브 지층에 일축 변형을 적용 하도록 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 설정은 균 주 하에서 다양 한 부착 세포 유형의 고해상도 이미징에 사용 될 수 있다, 그것은 세포 기계 생물학의 많은 분야에서 기계 전달 연구에 적용.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primary cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats 
			were provided by Dr. S. Y. Chew&#39;s lab at Nanyang Technological University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high&#160; glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11996-065-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-608-50ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-776-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Stock components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroxine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold and PDMS plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - Dow Corning Sylgard 184</td>
			<td>Ellsworth</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold - Liquid Plastic</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Smooth Cast 310 - Trail Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate Coatings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface functionalization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3648-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>13306-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63578-AK-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1110501-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain

세포 외 기계적 변형은 세포 표현 형 반응을 유도 하는 것으로 알려져 있으며, 여러 조직 시스템에서 생리 적 관련성을 갖는다. 생 화 확 적인 분석을 통해 시험관 내 세포 집단에 적용 된 세포 외 인장 균 주의 효과를 포착 하기 위해, 장치는 이전에 간단 하 게 제작 될 수 있고 조직 배양 인큐베이터 내부에 들어갈 정도로 작아 설계 되었으며, 뿐만 아니라 상단에 현미경 단계. 그러나, 실록 하 층의 이전 디자인은 기름 침수 목표를 통해 고 분해능 세포 화상 진 찰을 허용 하지 않았습니다. 이 작업은 실록 하위 계층의 재설계 된 형상과 함께 적용 된 스트레인 하에서 라이브 셀의 고해상도 세포 이미징을 용이 하 게 할 수 있는 사용자 정의 이미징 설정을 설명 합니다. 이 하위 계층은 동일한 이전에 설계 된 장치와 함께 사용할 수 있으며, 따라서 고해상도 광학 이미징을 허용 하는 것 외에도 위에 나열 된 것과 동일한 이점이 있습니다. 실록 하 층의 설계는 스트레인의 적용 전후에 동일한 셀을 추적 하는 것을 용이 하 게 하는 그리드를 통합 함으로써 개선 될 수 있다. 대표적인 결과는 여기에 설명 된 방법을 사용 하 여 포착 된 변형 된 세포 내에서 형광 표지 된 핵의 고해상도 타임 랩 스 이미징을 보여줍니다. 이러한 핵 역학 데이터는 적용 된 인장 변형이 oligodendrocyte 전구 세포의 분화를 촉진 하는 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다.

최근의 작업은 oligodendrocytes에서 인장 변형의 영향을 조사 하기 위한 것으로, 10% 일축 인장 변형이 유전자 발현의 전 세계적 변화에 의해 oligodendrocyte 전구 세포의 분화를 촉진 한다는 것을 보여주었다. 유전자 발현에서 이러한 변화 뒤에 메커니즘은 세포 골격 구조, 전사 인자 국 소화, 핵 역학 및 염색 질 조직과 같은 세포 성 파라미터의 이미징을 통해 프...

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain at JoVE.com

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

이전에 설계 된 장치를 사용 하 여 부착 세포에 기계적 변형을 적용 하는이 백서는 새롭게 디자인 된 하 층 구조와 100 배 오일 침 지 대물 렌즈를 사용 하 여 변형 된 셀의 고해상도 단일 셀 이미징을 위한 맞춤형 장치를 설명 합니다.

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

우리는 이전에 부착 셀에 기계적 변형을 적용하는 장치를 설계했습니다. 현재 작업에서, 우리는 하위 층의 형상을 재 설계하고 이러한 변형 세포의 고해상도 이미징을위한 설정을 사용자 정의했다. 이 세포 스트레칭 시스템의 주요 장점은 스트레인 세포의 100x에서 고해상도 세포 전도 영상을 제공한다는 것입니다.하위 지제작을 시연하는 것은 내 실험실의 연구 조수 인 비키가 될 것입니다. 먼저 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라 단일 웰 폴리디메틸실록산 몰드를 디자인합니다. 다음으로 폴리디메틸실록산 베이스의 20개 부분을 일회용 컵에 하나의 부품 경화제와 혼합합니다.혼합되면 폴리디메틸실록산 믹스를 진공 드 가스솔에 0.8 bar에 30분간 놓아 거품을 섞어 제거합니다. 그런 다음 폴리디메틸실록산 믹스를 금형과 접시에 붓습니다. 이 단계에서 0.8 bar 진공 상태에서 30분 동안 다시 가스를 제거하여 추가 거품을 제거합니다.탈가스가 완료되면 수평 테이블에 섭씨 80도에서 샘플을 2시간 동안 굽습니다. 다음으로, 조심스럽게 오븐에서 샘플을 제거하고 실온으로 냉각할 수 있습니다. 블레이드로 가장자리를 자르고 경화 된 폴리디메틸실록산을 부드럽게 벗깁니다.직경 150mm의 폴리디메틸실록산에서 마커로 2센티미터 그리드를 그립니다. 각 사각형 내에서 1센티미터를 1센티미터 로 끌어올아 모든 면에서 0.5cm의 마진을 남깁니다. 블레이드를 사용하여 라인을 따라 조심스럽게 자르고 사각형 구획을 얻습니다.다음으로, 4시간 동안 100% 아세톤, 100% 에탄올을 4시간 동안 배양한 다음 4시간 동안 오토클레이브 워터로 샘플을 청소합니다. 청소된 샘플을 150mm 직경의 플라스틱 접시 안에 파라핀 필름 백킹 페이퍼에 놓고 샘플을 섭씨 80도 오븐에서 4시간 동안 건조시로 만듭니다. 완료되면 파라핀 필름으로 요리를 밀봉하고 추가 사용이 있을 때까지 차가운 방에 보관하십시오.전구 세포를 준비하고 증식 배지에서 중단하십시오. 이 세포를 35, 평방 센티미터당 000 개의 세포로 PDL 코팅 플라스틱 표면에 시드하십시오. 증식 배지의 부피를 표면적 의 10센티미터 제곱당 3밀리리터로 조정합니다.매체의 양이 적을수록 표면 장력력으로 인해 세포 가동이 발생할 수 있으며, 접시에 있는 미디어의 양이 많을수록 미디어가 유출될 수 있습니다. 파종 후 셋째 날에는 세포를 수확하고 혈류계를 사용하여 계산합니다. 이어서, 종자 35, 000 세포당 폴리디메틸실록산 플레이트당 700 마이크로리터의 증식 배지.다음으로 제조업체의 지시에 따라 세포의 히스톤 H2B 복합체에 녹색 형광 단백질을 라벨링하는 플라스믹 구조를 추가합니다. 24시간 후, 단산소 균주 장치에 뻗어질 세포를 가진 폴리디메틸실록산 샘플을 장착한다. 그런 다음 모든 샘플에서 배지를 분화 매체로 변경합니다.훈련되지 않은 셀 컴파트먼트 길이를 측정하고 스테이지 마이크로미터 나사를 돌려 원하는 양의 균주에 의해 셀 컴파트먼트 길이를 늘립니다. 화상 진찰까지 37섭씨에서 인큐베이터에 뻗어 있고 뻗지 않은 폴리디메틸실록산 샘플을 둡니다. 인큐베이터 온도를 섭씨 37도로 설정하여 라이브 이미징을 위한 현미경 인큐베이터를 준비합니다.다음으로, 목표 턴릿에 접근할 수 없기 때문에 100배 오일 침지 목표를 중앙 위치에 가져옵니다. 일단 위치에 있으면 목표를 풀고 객관적인 링과 함께 다시 나사를 짜서 목표를 세포에 더 가까이 가져올 수 있습니다. 그런 다음 목표에 오일 한 방울을 추가합니다.맞춤형 인쇄 홀더를 사용하여 창 주변에 진공 그리스로 홀더를 코팅하고 홀더의 상단 표면에 숫자 0 두께 유리 커버슬립을 놓습니다. 플라스틱 창을 현미경 단계에 테이프로 테이프로 두습니다. 다음으로, Z 번역 스테이지를 현미경 스테이지에 나사로 배치하고 가장 많은 Z 위치로 이동합니다.이미지화할 확장된 폴리디메틸실록산 플레이트에서 배지 500마이크로리터를 제거하고 흰색 플라스틱 창의 유리 커버슬립에 이 매체를 추가합니다. 그런 다음 멸균 핀셋 한 쌍을 사용하여 폴리디메틸실록산 플레이트에서 사각형 구획을 조심스럽게 분리합니다. 스트레인 장치를 똑바로 세워 서 세포가 위쪽을 향하고 있고, 흰색 플라스틱 창 위에 조심스럽게 변형 장치를 반전시키도록 하여, 세포가 아래로 향하는 유리 커버슬립의 중간에 직접 떨어뜨리도록 한다.스트레인 장치의 하단 부분을 양면 테이프를 사용하여 Z 번역 단계에 배치하여 제자리에 고정합니다. 밝은 필드 아래 접피스를 통해 보는 동안, 매우 천천히 변형 장치를 아래로 가져와 세포에 초점을 목표를 이동합니다. Z 번역 단계의 하강과 목표 의 제기 사이에 번갈아 이 초점 단계를 천천히 수행합니다.Z 번역 단계가 너무 많이 낮아지면 세포가 압축되어 죽을 수 있습니다. 목표를 너무 높게 올리면 유리 커버슬립을 깨고 매체가 누출될 수 있습니다. 488 나노미터 흥분에서 에필플로클레스엔션을 사용하여 형광 핵을 가지고 있는 세포를 찾기 위해 X 및 Y 방향으로 폴리디메틸실록산 플레이트를 스캔한다.또한 밝은 필드 아래 샘플을 볼 때 세포에 적절한 형태가 있는지 확인하십시오. 488나노미터의 파장 여기를 가진 핵의 광시야 또는 개방핀홀 이미지를 기록하고, 프레임당 30초 간격으로 30초 간격으로 밝은 필드 흥분을 가진 세포의 총 지속 시간 30분. 폴리디메틸실록산 의 형상과 이 비디오에 표시된 이미징 설정은 세포와 목표 사이의 거리를 최소화합니다.이를 통해 100x 오일 침지 목표를 사용하여 형광으로 표지된 세포 핵의 시간 경과 이미징을 가능하게 합니다. 핵 변동을 측정하려면 먼저 핵 지역을 시간 대비 플롯합니다. 그런 다음, 제 3 차 다항형을 사용하여 데이터를 해독한다.그리고 마지막으로 잔류 변동을 플롯하고 잔류 변동의 표준 편차를 계산합니다. 올리고덴드로시테 전구세포의 핵 변동은 10%인장 균주 유무에 관계없이 분화의 화학적 유도에 따라 화학적 인장균만으로는 48시간 만에 핵 변동이 크게 감소한 것으로 나타났지만 24시간은 아닌 24시간 동안은 그렇지 않다. 한편, 화학유도는 10%인장 균주와 함께 24시간 에서 현저한 감소를 보였으며, 이는 48시간 에서 추가 감소 없이 일정하게 유지되었습니다.기억해야 할 가장 중요한 것은 선택한 목표의 작업 거리가 셀 컴파트먼트의 깊이와 커버슬립의 두께보다 같거나 클 수 있다는 것입니다. 데이터 세트의 전후 유형이 실험 오류로 인한 소음을 감소시키기 때문에 하위 계층은 변형을 적용하기 전과 후에 동일한 셀을 이미징할 수 있는 그리드를 통합하도록 재설계될 수 있습니다. 이 이미징 설정을 사용하여, 세포 성분의 단백질 국소화 또는 역학과 같은 부착 된 살아있는 세포 내의 많은 세포 전현상은 기계적 변형을 적용 한 몇 초 이내에 이미지화 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

연구

생체공학

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

고해상도 3D 영상의 전 VIVO</em마이크로 중부 표준시로> 생물 학적 샘플

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

증식하는 연속 고해상도 현미경으로 관찰 신진 효모의 노화

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

자기 공명 영상 아래에 자기 (磁 气)를 이용한 원격 제어 Microcatheter 팁 편향

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

세포 축적을 증가 하 고 종양을 대상으로 개선에 대 한 바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말의 초기 평가 수정

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...