Name: high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00
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Todos os autores reconhecem com gratidão o apoio ao financiamento da Fundação Nacional de pesquisa de Singapura através do grupo de pesquisa interdisciplinar da Aliança para a pesquisa e tecnologia (SMART) biosistemas e Micromecânicos (BioSyM) de Singapura-MIT. Os autores Dr. Jagielska e Dr. Van Vliet também reconhecem com gratidão o financiamento e o apoio da Fundação Saks-Kavanaugh. Os autores agradecem a William ONG e o Dr. Sing Yian Chew da Universidade Tecnológica de Nanyang, Singapura, por fornecer células progenitoras oligodendrocyte de ratos para alguns experimentos descritos neste trabalho, e os autores agradecem ao Dr. G. V. Shivashguei de Instituto de mechanobiology, Universidade Nacional de Singapore, Singapore, para discussões sobre flutuações da área nuclear.

1. projeto do molde do polidimetilsiloxano do único-poço para a imagem latente de alta resolução
Nota: o molde para a fabricação de placas de polidimetilsiloxano é projetado com as seguintes características para permitir a imagem com uma lente de imersão de óleo 100x e um ajuste correto no dispositivo de deformação Custom-Build (Figura 1a, B).
<ol><li>Mantenha as dimensões gerais da chapa de tal forma que se encaixe...

<ol>
	<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+produced+by+nerve+cells+in+tissue+culture.">Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture.</a> Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Developmental Biology. 389, (1983).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-based+theory+of+morphogenesis+and+compact+wiring+in+the+central+nervous+system.">A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system.</a> Nature. , (1997).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+Extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Research. , 103-115 (2011).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).</li><li>Niki&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).</li><li>Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+during+chronic+secondary+degeneration+in+rat+optic+nerve.">Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, (2018).</li><li>Zeiger, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+mechanical+strain+induces+capillary+endothelial+cell+cycle+re-entry+and+sprouting.">Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting.</a> Physical Biology. 13, 1-16 (2017).</li><li>Jagielska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+promotes+oligodendrocyte+differentiation+by+global+changes+of+gene+expression.">Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).</li><li>Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+spatio-temporal+fluctuations+in+chromatin+compaction+states+characterize+stem+cells.">Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells.</a> Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).</li><li>Makhija, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+alters+cellular+and+nuclear+dynamics+at+early+stages+of+oligodendrocyte+differentiation.">Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).</li></ol>

Um dispositivo foi projetado previamente1 para a aplicação da tensão de tração extracelular em pilhas aderentes. O projeto do substrato do polidimetilsiloxano em que o trabalho era suficiente para ensaios bioquímicos, assim como a imagem latente de baixa resolução de pilhas esticadas. Neste trabalho, o substrato foi redesenhado, e uma nova configuração de imagem que facilita a imagem de célula viva subcelular de alta resolução foi introduzida. As vantagens deste sistema são numerosas...

Células e tecidos no corpo são submetidos a várias pistas mecânicas, incluindo tensões de tração. No entanto, os efeitos dessas pistas sobre a biologia das células neurais ainda não foram estudados extensivamente e compreendidos plenamente. No sistema nervoso central, as fontes de deformação mecânica incluem o crescimento do desenvolvimento1,2,3,4, processos fisiológicos, como flexão da medula espinhal, sangue e líquido cefalorraquidiano pulsação, e condições patológicas tais como o traumatismo, o inchamento do AXON, scarring glial, ou o crescimento do tumor5,6,7,8. Vale a pena investigar como a tensão elástica afeta a diferenciação de oligodendrócitos e a subsequente mielinação de axônios, que é um processo crítico no sistema nervoso central de vertebrados. Usando um dispositivo de deformação personalizado e placas de multipoços elastoméricos, trabalhos anteriores9,10 mostraram que a cepa uniaxial estática pode aumentar a diferenciação de oligodendrocyte através de mudanças globais na expressão gênica 10. para obter uma maior compreensão dos mecanismos de mecanotransdução de estirpe nestas células, o aparelho experimental anterior deve ser redesenhado como descrito aqui, para permitir a imagem latente de fluorescência de alta resolução da dinâmica nuclear na vida células tensão. Especificamente, uma placa polidimetilsiloxano do único-poço é desenvolvida, e a configuração da imagem latente é redesenhada para permitir a imagem latente do tempo-lapso de pilhas ao vivo a tensão usando uma lente da imersão do óleo 100x. Para eliminar os efeitos ópticos negativos do polidimetilsiloxano na via de luz, as células são imaged não através da placa de polidimetilsiloxano, mas na posição invertida, através do vidro de cobertura cobrindo o compartimento da célula. Usando este projeto novo da imagem latente, as centenas de filmes high-resolution do tempo-lapso são gravadas, de núcleos individuais da pilha dentro das pilhas aderentes intactas, onde a cromatina é etiquetada etiquetando o histona H2B à proteína fluorescente verde. Estes filmes demonstram que a tensão elástica induz mudanças na estrutura e na dinâmica da cromatina que são consistentes com a progressão da diferenciação do oligodendrocyte.
A imagem latente viva da pilha a tensão aplicada é tecnicamente desafiante e exige um projeto do dispositivo que seja compatível com o sistema do microscópio. O design personalizado descrito aqui apresenta uma alternativa barata para soluções comerciais. Suas dimensões permitem sua instalação nos estágios do microscópio e na imagem latente viva da pilha na definição espacial elevada durante a tensão aplicada. O setup da imagem latente é projetado facilitar a imagem latente viva da pilha usando uma lente da imersão do óleo 100x com a claridade a mais elevada, através do vidro da tampa, não através da camada da placa do polidimetilsiloxano que diminui de outra maneira a qualidade de imagem e é comum em a maioria configurações de imagem tensão. O dispositivo, com uma placa montada que contem pilhas, pode igualmente ser armazenado facilmente na incubadora. Este dispositivo é projetado aplicar a tensão uniaxial aos substratos que facilitam a cultura de pilha aderente e mantêm uma tensão estável e uniforme sobre dias múltiplos. A instalação descrita aqui pode ser usada para a imagem latente de alta resolução de vários tipos aderentes da pilha a tensão, fazendo a aplicável aos estudos do mechanotransdução em muitos campos da mecanobiologia da pilha.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primary cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats 
			were provided by Dr. S. Y. Chew&#39;s lab at Nanyang Technological University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high&#160; glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11996-065-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-608-50ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-776-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Stock components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroxine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold and PDMS plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - Dow Corning Sylgard 184</td>
			<td>Ellsworth</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold - Liquid Plastic</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Smooth Cast 310 - Trail Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate Coatings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface functionalization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3648-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>13306-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63578-AK-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1110501-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain

A estirpe mecânica extracellular é sabida para provocar respostas fenotípicas da pilha e tem a relevância physiological em diversos sistemas do tecido. Para capturar o efeito da tensão de tração extracelular aplicada em populações da pilha in vitro através dos ensaios bioquímicos, um dispositivo foi projetado previamente que pode ser fabricado simplesmente e é pequeno bastante caber dentro das incubadoras da cultura do tecido, assim como na parte superior de estágios do microscópio. Entretanto, o projeto precedente do substrato do polidimetilsiloxano não permitiu a imagem latente subcellular de alta resolução através dos objetivos da óleo-imersão. Este trabalho descreve uma geometria redesenhada do substrato do polidimetilsiloxano e uma configuração de imagem personalizada que, em conjunto, pode facilitar a imagem subcelular de alta resolução de células ao vivo, enquanto estirpe aplicada. Este substrato pode ser usado com o mesmo, dispositivo projetado anteriormente e, portanto, tem as mesmas vantagens como listado acima, além de permitir a imagem óptica de alta resolução. O projeto do substrato do polidimetilsiloxano pode ser melhorado incorporando uma grade que facilite o seguimento da mesma pilha antes e depois da aplicação da tensão. Os resultados representativos demonstram a imagem latente de alta resolução do tempo-lapso de núcleos cDNAs etiquetados dentro das pilhas tensas capturadas usando o método descrito aqui. Estes dados da dinâmica nuclear dão introspecções no mecanismo por que a tensão elástica aplicada promove a diferenciação de pilhas do progenitor do oligodendrocyte.

Os trabalhos recentes que visam investigar o efeito da tensão elástica em oligodendrócitos10 mostraram que uma tensão elástica uniaxial de 10% promove a diferenciação de pilhas do progenitor do oligodendrocyte por mudanças globais na expressão de Gene. O mecanismo por trás dessas alterações na expressão gênica pode ser sondados por meio da imagem de parâmetros subcelulares, como a estrutura do citoesqueleto, localização do fator de transcrição, d...

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High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Imagem latente de alta resolução da dinâmica nuclear em pilhas vivos a tensão elástica uniaxial

Usando um dispositivo projetado previamente para aplicar a tensão mecânica às pilhas aderentes, este papel descreve uma geometria redesenhada do substrato e um instrumento personalizado para a imagem latente da único-pilha de alta resolução de pilhas tensas com um objetivo da imersão do óleo 100x.

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Nós projetamos anteriormente um dispositivo para aplicar tensão mecânica em células aderentes. No trabalho atual, redesenhamos a geometria do substrato e personalizamos a configuração para imagens de alta resolução dessas células de cepa. A principal vantagem deste sistema de alongamento celular é que ele fornece uma imagem subcelular de alta resolução a 100x das células de cepa.Demonstrando a fabricação do substrato estará Vicki, uma assistente de pesquisa do meu laboratório. Comece projetando um molde de polidimimetilsiloxano de um único poço seguindo o protocolo de texto que acompanha. Em seguida, misture 20 partes de uma base de polidimetilsiloxano com uma parte de agente de cura em um copo descartável.Uma vez misturado, coloque a mistura de polidimotilatilaxitano em um desmoxicar a vácuo a 0,8 bar por 30 minutos para remover as bolhas da mistura. Em seguida, despeje a mistura de polidimotilatilaxano no molde e no prato. Remova quaisquer bolhas adicionais nesta fase, desausem-la novamente no vácuo de 0,8 bar por 30 minutos.Quando o desassador estiver completo, asse as amostras a 80 graus Celsius em uma mesa de nivelamento por duas horas. Em seguida, remova cuidadosamente as amostras do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Corte as bordas com uma lâmina e retire delicadamente o polidimimetilsiloxano curado.Na rede de 150 milímetros de diâmetro polidimtilsiloxano, desenhe uma grade de dois centímetros por dois centímetros com um marcador. Dentro de cada quadrado, desenhe um centímetro por um centímetro quadrado, deixando uma margem de 0,5 centímetros por todos os lados. Use uma lâmina para cortar cuidadosamente ao longo das linhas e obter compartimentos quadrados.Em seguida, limpe as amostras incubando-as em 100% acetona por quatro horas, 100% etanol por mais quatro horas e, em seguida, em água autoclavada por quatro horas. Coloque as amostras limpas em papel de apoio de filme de parafina dentro de um prato plástico de 150 milímetros de diâmetro e seque a amostra em um forno de 80 graus Celsius por quatro horas. Quando terminar, sele os pratos com filme de parafina e guarde-os em uma sala fria até usar ainda mais.Prepare células progenitoras e suspenda-as em meio de proliferação. Semear essas células a uma densidade de 35.000 células por centímetro quadrado em superfícies plásticas revestidas de PDL. Ajuste o volume do meio de proliferação para três mililitros por dez centímetros quadrados de área de superfície.Um volume menor de mídia pode levar ao agrupamento celular, decorrente de forças de tensão superficial, enquanto um maior volume de mídia nos pratos pode fazer com que a mídia se espalhe. No terceiro dia após a semeadura, colde as células e conte-as usando um hemócito. Em seguida, sementes 35.000 células por placa de polidimetilsiloxano com 700 microliters de meio de proliferação.Em seguida, adicione uma construção plasmática para rotular os complexos histítonos H2B da célula com proteína fluorescente verde seguindo as instruções do fabricante. Após 24 horas, monte as amostras de polidimtilsiloxano com células a serem esticadas no dispositivo de cepa uniaxial. Em seguida, mude o meio em todas as amostras para meio de diferenciação.Meça o comprimento do compartimento celular não treinado e gire o parafuso do micrômetro do estágio para aumentar o comprimento do compartimento celular pela quantidade desejada de tensão. Deixe as amostras de polidimtilsiloxano esticadas e não esticadas na incubadora a 37 graus Celsius até a imagem. Prepare a incubadora de microscópio para imagens ao vivo, definindo a temperatura da incubadora para 37 graus Celsius.Em seguida, traga um objetivo de imersão de óleo 100x para a posição central, já que o turnit objetivo não será acessível mais tarde. Uma vez em posição, desaparafusar o objetivo e enrosca-lo novamente com um anel objetivo, para que o objetivo possa ser aproximado das células. Em seguida, adicione uma gota de óleo ao objetivo.Usando um suporte personalizado, cubra o suporte com graxa de vácuo na periferia da janela e coloque uma tampa de vidro de espessura zero na superfície superior do suporte. Grave a janela de plástico no estágio do microscópio. Em seguida, enrosque um estágio de tradução Z no estágio do microscópio e mova-o para a posição mais alta Z.Remova 500 microliters do meio da placa de polidimetilsiloxano esticada para ser imageada e adicione este meio ao deslizamento de tampa de vidro na janela de plástico branco. Em seguida, use um par de pinças estéreis para desprender cuidadosamente o compartimento quadrado da placa de polidimtilsiloxano. Segure o dispositivo de tensão em uma posição vertical para que as células estejam voltadas para cima, acima da janela de plástico branco e inverta cuidadosamente o dispositivo de tensão, de modo a deixar qualquer meio extra cair diretamente no meio da tampa de vidro com as células voltadas para baixo.Coloque a parte inferior do dispositivo de tensão no estágio de tradução Z usando fita dupla face para mantê-la no lugar. Ao olhar através da ocular sob campo brilhante, muito lentamente trazer o dispositivo de tensão para baixo e mover o objetivo para cima para se concentrar nas células. Realize este passo de foco lentamente, alternando entre a redução da etapa de tradução Z e a elevação do objetivo.Se o estágio de tradução Z diminuir muito, as células podem comprimir e, portanto, morrer. Se elevarmos o objetivo muito alto, ele pode quebrar a tampa de vidro e fazer com que o meio vaze. Escaneie a placa de polidimtilsiloxano nas direções X e Y para encontrar uma célula que tenha um núcleo fluorescente, usando epiflorescência a 488 nanômetros de excitação.Certifique-se também de que a célula tenha uma morfologia apropriada ao olhar para a amostra sob campo brilhante. Grave imagens de campo largo ou de pinhole aberto do núcleo com 488 nanômetros de excitação do comprimento de onda e da célula com excitação de campo brilhante em intervalos de 30 segundos por quadro por uma duração total de pelo menos 30 minutos. A geometria redesenhada do substrato de polidimtilsiloxano e a configuração de imagem mostrada neste vídeo minimiza a distância entre as células e o objetivo.Isso permite imagens de lapso de tempo de núcleos celulares fluorescentes rotulados usando um objetivo de imersão de óleo de 100x. Para medir as flutuações nucleares, primeiro traçar a área nuclear versus o tempo. Em seguida, detença os dados usando um polinômial de terceira ordem.E, finalmente, parcelar flutuações residuais e calcular o desvio padrão das flutuações residuais. As flutuações nucleares das células progenitoras oligodendrocyte, após a indução química de diferenciação com e sem uma cepa de 10%, mostram que, apenas com a indução química, a amplitude das flutuações nucleares apresentou uma diminuição significativa em 48 horas, mas não em 24 horas. Por outro lado, a indução química juntamente com uma cepa de 10% de tração mostrou uma diminuição significativa em 24 horas, que permaneceu constante sem maiores reduções em 48 horas.O mais importante a ser lembrado é que a distância de trabalho do objetivo escolhido deve ser igual ou maior do que a profundidade do compartimento celular mais a espessura do deslizamento de tampas. O substrato pode ser redesenhado para incorporar uma grade, o que facilitaria a imagem da mesma célula antes e depois da aplicação da cepa, uma vez que um tipo de conjunto de dados antes e depois reduz o ruído proveniente de erro experimental. Usando essa configuração de imagem, muitos fenômenos subcelulares dentro de células vivas aderentes, como localização de proteínas ou dinâmica de componentes celulares, podem ser imagens em segundos após a aplicação da cepa mecânica.

Research

JoVE Journal

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