Name: high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00
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Todos los autores reconocen con gratitud el apoyo a la financiación de la Fundación Nacional de investigación de Singapur a través del grupo de investigación interdisciplinar de la Alianza de Singapur-MIT para la investigación y la tecnología (SMART) BioSystems y Micromechanics (BioSyM). Los autores Dr. Jagielska y el Dr. van Vliet también reconocen con gratitud la financiación y el apoyo de la Fundación Saks-Kavanaugh. Los autores agradecen a William ONG y al Dr. Sing Yian Chew de la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, por proporcionar células progenitoras de oligodendrocitos de rata para algunos experimentos descritos en este trabajo, y los autores agradecen al Dr. g. v. Shivashankar de Instituto de mecanobiología, Universidad Nacional de Singapur, Singapur, para discusiones sobre las fluctuaciones de la zona nuclear.

1. diseño del molde de polidimetilsiloxano de un solo pozo para imágenes de alta resolución
Nota: el molde para fabricar placas de polidimetilsiloxano está diseñado con las siguientes características para permitir la creación de imágenes con una lente de inmersión de aceite de 100x y un ajuste correcto en el dispositivo de deformación unitaria de construcción personalizada (figura 1A, B).
<ol><li>Mantenga las dimensio...

<ol>
	<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+produced+by+nerve+cells+in+tissue+culture.">Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture.</a> Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Developmental Biology. 389, (1983).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-based+theory+of+morphogenesis+and+compact+wiring+in+the+central+nervous+system.">A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system.</a> Nature. , (1997).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+Extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Research. , 103-115 (2011).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).</li><li>Niki&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).</li><li>Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+during+chronic+secondary+degeneration+in+rat+optic+nerve.">Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, (2018).</li><li>Zeiger, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+mechanical+strain+induces+capillary+endothelial+cell+cycle+re-entry+and+sprouting.">Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting.</a> Physical Biology. 13, 1-16 (2017).</li><li>Jagielska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+promotes+oligodendrocyte+differentiation+by+global+changes+of+gene+expression.">Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).</li><li>Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+spatio-temporal+fluctuations+in+chromatin+compaction+states+characterize+stem+cells.">Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells.</a> Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).</li><li>Makhija, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+alters+cellular+and+nuclear+dynamics+at+early+stages+of+oligodendrocyte+differentiation.">Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).</li></ol>

Un dispositivo ha sido previamente1 diseñado para la aplicación de la tensión de tracción extracelular en las células adherentes. El diseño del sustrato de polidimetilsiloxano en ese trabajo fue suficiente para los ensayos bioquímicos, así como la imagen de baja resolución de las células estiradas. En este trabajo, se rediseñó el sustrato y se introdujo una nueva configuración de imágenes que facilita la imagen de células vivas subcelulares de alta resolución. Las ventajas de este ...

Las células y los tejidos en el cuerpo están sometidos a diversas señales mecánicas, incluyendo las cepas de tracción. Sin embargo, los efectos de estas señales en la biología de las células neuronales aún no se han estudiado extensamente y entendido completamente. En el sistema nervioso central, las fuentes de la cepa mecánica incluyen crecimiento del desarrollo1,2,3,4, procesos fisiológicos tales como flexión de la médula espinal, sangre y líquido cefalorraquídeo palpitaciones y afecciones patológicas como trauma, hinchazón de Axon, cicatrices gliales o crecimiento tumoral5,6,7,8. Vale la pena investigar cómo la tensión de tracción afecta a la diferenciación de oligodendrocitos y la posterior mielinización de los axones, que es un proceso crítico en el sistema nervioso central del vertebrado. Utilizando un dispositivo de deformación de diseño personalizado y placas de multipozo elastoméricos, las obras anteriores9,10 han demostrado que la cepa uniaxial estática puede aumentar la diferenciación de oligodendrocitos a través de cambios globales en la expresión génica 10. para comprender mejor los mecanismos de la mecanotransducción de cepas en estas células, se debe rediseñar el anterior aparato experimental como se describe aquí, para permitir la imagen de fluorescencia de alta resolución de la dinámica nuclear en la vida células bajo tensión. Específicamente, se desarrolla una placa de polidimetilsiloxano de un solo pozo, y se rediseña la configuración de imágenes para permitir la toma de imágenes de lapso de tiempo de las células vivas bajo tensión utilizando una lente de inmersión de aceite 100x. Para eliminar los efectos ópticos negativos de polidimetilsiloxano en la vía de la luz, las células se muestran no a través de la placa de polidimetilsiloxano, pero en la posición invertida, a través del vidrio de la cubierta que cubre el compartimiento de la célula. Utilizando este nuevo diseño de imágenes, se registran cientos de películas de lapso de tiempo de alta resolución, de núcleos celulares individuales dentro de las células adherentes intactas, donde la cromatina se etiqueta etiquetando la histona H2B a la proteína fluorescente verde. Estas películas demuestran que la tensión de tracción induce cambios en la estructura de la cromatina y la dinámica que son consistentes con la progresión de la diferenciación de oligodendrocitos.
La toma de imágenes de células vivas bajo tensión aplicada es técnicamente desafiante y requiere un diseño de dispositivo compatible con el sistema del microscopio. El diseño personalizado descrito aquí presenta una alternativa barata a las soluciones comerciales. Sus dimensiones permiten su instalación en etapas de microscopio e imágenes de células vivas a alta resolución espacial durante la deformación aplicada. La configuración de imágenes está diseñada para facilitar la toma de imágenes de células vivas utilizando una lente de inmersión de aceite de 100x con la mayor claridad, a través del vidrio de la cubierta, no a través de la capa de placa de polidimetilsiloxano que de otra manera disminuye la calidad de imagen y es común en la mayoría configuraciones de imágenes bajo tensión. El dispositivo, con una placa montada que contiene las células, también se puede almacenar fácilmente en la incubadora. Este dispositivo está diseñado para aplicar la cepa uniaxial a substratos que facilitan el cultivo de células adherentes y mantienen una tensión estable y uniforme durante varios días. La configuración descrita aquí se puede utilizar para la imagen de alta resolución de varios tipos de células adherentes bajo tensión, por lo que es aplicable a los estudios de mecanotransducción en muchos campos de la mecanobiología celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primary cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats 
			were provided by Dr. S. Y. Chew&#39;s lab at Nanyang Technological University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high&#160; glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11996-065-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-608-50ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-776-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Stock components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroxine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold and PDMS plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - Dow Corning Sylgard 184</td>
			<td>Ellsworth</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold - Liquid Plastic</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Smooth Cast 310 - Trail Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate Coatings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface functionalization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3648-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>13306-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63578-AK-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1110501-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain

Se sabe que la cepa mecánica extracelular provoca respuestas fenotísicas celulares y tiene relevancia fisiológica en varios sistemas tisulares. Para capturar el efecto de la tensión de tracción extracelular aplicada en las poblaciones celulares in vitro a través de Ensayos bioquímicos, un dispositivo ha sido previamente diseñado que puede ser fabricado simplemente y es lo suficientemente pequeño para caber dentro de incubadoras de cultivo de tejido, así como en la parte superior de etapas del microscopio. Sin embargo, el diseño anterior del sustrato de polidimetilsiloxano no permitía la creación de imágenes subcelulares de alta resolución a través de objetivos de inmersión en aceite. Este trabajo describe una geometría rediseñada del sustrato de polidimetilsiloxano y una configuración de imágenes personalizada que, en conjunto, puede facilitar la toma de imágenes subcelulares de alta resolución de las células vivas bajo tensión aplicada. Este sustrato se puede utilizar con el mismo dispositivo diseñado anteriormente y, por lo tanto, tiene las mismas ventajas que se enumeran anteriormente, además de permitir la imagen óptica de alta resolución. El diseño del sustrato de polidimetilsiloxano se puede mejorar mediante la incorporación de una rejilla que facilitará el seguimiento de la misma célula antes y después de la aplicación de la cepa. Los resultados representativos demuestran la creación de imágenes en tiempo de lapso de alta resolución de núcleos etiquetados con fluorescencia dentro de las células tensas capturadas utilizando el método descrito aquí. Estos datos de dinámicas nucleares proporcionan información sobre el mecanismo mediante el cual la cepa de tracción aplicada promueve la diferenciación de las células progenitoras de oligodendrocitos.

Los trabajos recientes dirigidos a investigar el efecto de la tensión de tracción en los oligodendrocitos10 mostraron que una cepa de tracción uniaxial al 10% promueve la diferenciación de las células progenitoras de oligodendrocitas por los cambios globales en la expresión génica. El mecanismo detrás de estos cambios en la expresión génica se puede sondeado a través de la imagen de los parámetros subcelulares, como la estructura del citoesqueleto, la l...

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High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Imágenes de alta resolución de la dinámica nuclear en células vivas bajo tensión de tracción uniaxial

Utilizando un dispositivo previamente diseñado para aplicar la cepa mecánica a las células adherentes, este papel describe una geometría de sustrato rediseñado y un aparato personalizado para la imagen de célula única de alta resolución de células tensas con un objetivo de inmersión de aceite 100x.

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Anteriormente hemos diseñado un dispositivo para aplicar tensión mecánica a las células adherentes. En el trabajo actual, hemos rediseñado la geometría del sustrato y personalizado la configuración para imágenes de alta resolución de estas células de tensión. La principal ventaja de este sistema de estiramiento celular es que proporciona una imagen subcelular de alta resolución a 100 veces de las células de tensión.Demostrando la fabricación del sustrato estará Vicki, una asistente de investigación de mi laboratorio. Comience diseñando un molde de polidimetilsiloxano de un solo pocillo siguiendo el protocolo de texto que lo acompaña. A continuación, mezclar 20 partes de una base de polidimetilsiloxano con una parte de agente de curado en una taza desechable.Una vez mezclado, coloque la mezcla de polidimetilsiloxano en un desgaste de vacío a 0,8 bar durante 30 minutos para eliminar las burbujas de la mezcla. Luego, vierta la mezcla de polidimetilsiloxano en el molde y el plato. Retire cualquier burbuja adicional en esta etapa desgasificándola de nuevo a 0,8 bar de vacío durante 30 minutos.Cuando se complete la desgasitación, hornee las muestras a 80 grados centígrados en una mesa de nivelación durante dos horas. A continuación, retire cuidadosamente las muestras del horno y déjelas enfriar a temperatura ambiente. Corta los bordes con una cuchilla y pela suavemente el polidimetilsiloxano curado.En el polidimetilsiloxano de 150 milímetros de diámetro, dibuje una rejilla de dos centímetros por dos centímetros con un marcador. Dentro de cada cuadrado, dibuja un centímetro por un centímetro cuadrado, dejando un margen de 0,5 centímetros en todos los lados. Utilice una cuchilla para cortar cuidadosamente a lo largo de las líneas y obtener compartimentos cuadrados.A continuación, limpie las muestras incubando en 100% acetona durante cuatro horas, 100%etanol durante cuatro horas adicionales y luego en agua autoclavada durante cuatro horas. Coloque las muestras limpiadas en papel de respaldo de película de parafina dentro de un plato de plástico de 150 milímetros de diámetro y seque la muestra en un horno celsius de 80 grados durante cuatro horas. Cuando haya terminado, selle los platos con película de parafina y guárdelos en una sala fría hasta su uso posterior.Preparar células progenitoras y suspenderlas en medio de proliferación. Siembra estas células a una densidad de 35.000 células por centímetro cuadrado sobre superficies de plástico recubiertas de PDL. Ajuste el volumen del medio de proliferación a tres mililitros por cada diez centímetros cuadrados de superficie.Un menor volumen de medios puede provocar aglomeraciones celulares, derivadas de las fuerzas de tensión superficial, mientras que un mayor volumen de medios en los platos puede hacer que los medios se derramen. Al tercer día después de la siembra, cosecha las células y cuentalas usando un hemocicómetro. Luego, semilla 35.000 células por placa de polidimetilsiloxano con 700 microlitros de medio de proliferación.A continuación, agregue una construcción plasmica para etiquetar los complejos de histona H2B de la célula con proteína fluorescente verde siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, monte las muestras de polidimetilsiloxano con células para estirar en el dispositivo de tensión uniaxial. A continuación, cambie el medio de todas las muestras a un medio de diferenciación.Mida la longitud del compartimiento celular sin restricciones y gire el tornillo micrómetro de etapa para aumentar la longitud del compartimiento celular en la cantidad deseada de tensión. Deje las muestras de polidimetilsiloxano estiradas y sin estirar en la incubadora a 37 grados centígrados hasta que se tome por imágenes. Prepare la incubadora de microscopios para imágenes en vivo estableciendo la temperatura de la incubadora en 37 grados centígrados.A continuación, lleve un objetivo de inmersión de aceite 100x a la posición central, ya que el giro objetivo no será accesible más adelante. Una vez en posición, desenrosque el objetivo y atornillarlo de nuevo con un anillo objetivo, para que el objetivo se pueda acercar a las células. A continuación, agregue una gota de aceite al objetivo.Con un soporte impreso a medida, cubra el soporte con grasa al vacío en la periferia de la ventana y coloque un cubreobjetos de vidrio número cero de espesor en la superficie superior del soporte. Pegue la ventana de plástico en la etapa del microscopio. A continuación, atornille una etapa de traducción Z a la etapa del microscopio y muévala a la posición Z superior.Retire 500 microlitros del medio de la placa de polidimetilsiloxano estirada que se va a tomar la imagen, y agregue este medio en el cubreobjetos de vidrio en la ventana de plástico blanco. A continuación, utilice un par de pinzas estériles para separar cuidadosamente el compartimento cuadrado de la placa de polidimetilsiloxano. Sostenga el dispositivo de tensión en posición vertical para que las células estén mirando hacia arriba, por encima de la ventana de plástico blanco e invierta cuidadosamente el dispositivo de tensión, con el fin de dejar caer cualquier medio adicional directamente en el medio del cubreobjetos de vidrio con las celdas hacia abajo.Coloque la parte inferior del dispositivo de deformación unitaria en la etapa de traslación Z utilizando cinta adhesiva de doble cara para mantenerlo en su lugar. Mientras mira a través del ocular bajo campo brillante, muy lentamente traer el dispositivo de tensión hacia abajo y mover el objetivo hacia arriba para centrarse en las células. Realice este paso de enfoque lentamente, alternando entre la reducción de la etapa de traducción Z y la elevación del objetivo.Si la etapa de traducción Z disminuye demasiado, las células podrían comprimirse y, por lo tanto, morir. Si elevamos el objetivo demasiado alto, podría romper el cubreobjetos de vidrio y hacer que el medio se filtre. Escanee la placa de polidimetilsiloxano en direcciones X e Y para encontrar una célula que tenga un núcleo fluorescente, utilizando la epiflorescencia a 488 nanómetros de excitación.Asegúrese también de que la celda tiene una morfología adecuada al mirar la muestra en campo brillante. Grabe imágenes de campo ancho o de agujero abierto del núcleo con 488 nanómetros de excitación de longitud de onda y de la célula con excitación de campo brillante a intervalos de 30 segundos por fotograma durante una duración total de al menos 30 minutos. La geometría rediseñada del sustrato de polidimetilsiloxano y la configuración de imágenes que se muestra en este vídeo minimizan la distancia entre las células y el objetivo.Esto permite la toma de imágenes de lapso de tiempo de núcleos celulares con etiqueta fluorescente utilizando un objetivo de inmersión de aceite de 100x. Para medir las fluctuaciones nucleares, primero traza la zona nuclear frente al tiempo. A continuación, detrend los datos mediante un polinomio de tercer orden.Y finalmente, trazar las fluctuaciones residuales y calcular la desviación estándar de las fluctuaciones residuales. Las fluctuaciones nucleares de las células progenitoras de oligodendrocitos, tras la inducción química de la diferenciación con y sin una tensión de 10% de tracción, muestran que solo con la inducción química, la amplitud de las fluctuaciones nucleares mostró una disminución significativa a las 48 horas, pero no a las 24 horas. Por otro lado, la inducción química junto con una cepa de 10% de tracción mostró una disminución significativa a las 24 horas, que se mantuvo constante sin una mayor reducción a las 48 horas.Lo más importante a recordar es que la distancia de trabajo del objetivo elegido debe ser igual o mayor que la profundidad del compartimiento de celda más el grosor del cubreobjetos. El sustrato se puede rediseñar para incorporar una cuadrícula, lo que facilitaría la toma de imágenes de la misma célula antes y después de la aplicación de la tensión, ya que un tipo de conjunto de datos antes y después reduce el ruido procedente de un error experimental. Usando esta configuración de imágenes, muchos fenómenos subcelulares dentro de las células vivas adherentes, como la localización de proteínas o la dinámica de los componentes celulares, se pueden tomar imágenes en cuestión de segundos después de aplicar la tensión mecánica.

Research

JoVE Journal

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