Name: high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain at JoVE.com

Tüm yazarlar minnetle Singapur-MıT Alliance araştırma ve teknoloji (SMART) BioSystems ve mikromekanik (BioSyM) disiplinlerarası araştırma grubu aracılığıyla Singapur Ulusal Araştırma Vakfı 'ndan fon desteğini kabul eder. Yazarlar Dr. Jagielska ve Dr. Van Vliet de minnetle Saks-Kavanaugh Vakfı 'ndan fon ve destek kabul. Yazarlar, bu çalışma açıklanan bazı deneyler için sıçan oligodendrosit progenitör hücreleri sağlamak için Nanyang teknolojik Üniversitesi, Singapur, William Ong ve Dr Sing Yian Chew teşekkür ve yazarlar Dr G. V. shivashankar teşekkür Mechanobiology Enstitüsü, Singapur Ulusal Üniversitesi, Singapur, nükleer alan dalgalanmaları hakkında tartışmalar için.

1. yüksek çözünürlüklü görüntüleme için tek-iyi polydimetilsiloxane kalıp tasarımı
Not: polydimetilsiloxane plakaları üretimi için kalıp, 100x yağ daldırma lens ile görüntüleme ve özel yapı gerinim cihazına doğru uyum sağlamak için aşağıdaki özelliklerle tasarlanmıştır (Şekil 1a, B).
<ol><li>Genel plaka boyutlarını, gerinim cihazının kelepçeleri içine sığmasını sağlar. Not: bura...

<ol>
	<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+produced+by+nerve+cells+in+tissue+culture.">Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture.</a> Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Developmental Biology. 389, (1983).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-based+theory+of+morphogenesis+and+compact+wiring+in+the+central+nervous+system.">A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system.</a> Nature. , (1997).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+Extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Research. , 103-115 (2011).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).</li><li>Niki&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).</li><li>Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+loss+during+chronic+secondary+degeneration+in+rat+optic+nerve.">Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, (2018).</li><li>Zeiger, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+mechanical+strain+induces+capillary+endothelial+cell+cycle+re-entry+and+sprouting.">Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting.</a> Physical Biology. 13, 1-16 (2017).</li><li>Jagielska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+promotes+oligodendrocyte+differentiation+by+global+changes+of+gene+expression.">Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).</li><li>Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+spatio-temporal+fluctuations+in+chromatin+compaction+states+characterize+stem+cells.">Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells.</a> Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).</li><li>Makhija, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+strain+alters+cellular+and+nuclear+dynamics+at+early+stages+of+oligodendrocyte+differentiation.">Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).</li></ol>

Bir cihaz daha önce1 ' i yapışkanı hücrelerde hücre içi çekme gerilme uygulaması için tasarlandı. Bu çalışmanın polydimetylsiloxane substratum tasarımı biyokimyasal çalışmalar için yeterli, hem de gergin hücrelerin düşük çözünürlüklü görüntüleme. Bu çalışmada, substratum yeniden tasarlandı ve yüksek çözünürlüklü alt hücresel canlı hücre görüntülemeyi kolaylaştıran yeni bir görüntüleme konfigürasyonu tanıtıldı. Bu sistemin avantajları ço...

Vücutta hücreler ve dokular, çekme suşları da dahil olmak üzere çeşitli mekanik ipuçlarına tabi tutulur. Ancak, bu ipuçların nöral hücrelerin biyolojisinde etkileri henüz kapsamlı bir şekilde incelenmedi ve tam olarak anlaşılmamıştır. Santral sinir sisteminde, mekanik gerinim kaynakları gelişimsel büyüme1,2,3,4, omurilik bükme, kan ve beyin omurilik sıvısı gibi fizyolojik süreçleri içerir Nabız ve travma, Akon şişmesi, glial skarlaşma veya tümör büyümesi gibi patolojik koşullar5,6,7,8. Bu çekme gerinim oligodendrositlerin farklılaşmasını ve omurga merkezi sinir sisteminde kritik bir süreçtir akonlar, sonraki miyelinasyon nasıl etkilediğini araştırmaya değer. Özel tasarımlı bir gerinim cihazı ve elastomerik multiwell plakaları kullanarak, önceki çalışmalar9,10 statik tek eksenli gerilimin gen ifadesinde küresel değişiklikler yoluyla oligodendrosit farklılaşmasını artırabilir göstermiştir 10. bu hücrelerde strain mechanotransdution mekanizmaları daha fazla anlayış elde etmek için, önceki deneysel cihaz burada açıklandığı gibi yeniden tasarlanmalıdır, yaşayan nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme sağlamak için hücreler gerilme altında. Özellikle, tek-iyi polydimetilsiloxane plaka geliştirilmiştir, ve görüntüleme yapılandırması bir 100x yağ daldırma lens kullanarak gerginlik altında canlı hücrelerin zaman atlamalı görüntüleme için izin vermek için yeniden tasarlandı. Işık yolu polidimetilsiloksan negatif optik etkilerini ortadan kaldırmak için, hücreler polydimetilsiloxane plaka aracılığıyla değil, ancak ters pozisyonda, hücre bölmesi kapsayan kapak cam aracılığıyla görüntülenmiş. Bu yeni görüntüleme tasarımını kullanarak yüzlerce yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı film, kromatinin histon H2B yeşil floresan proteini etiketleyerek etiketlendiği, bozulmamış yapışmaz hücrelerdeki bireysel hücre çekirdeğinden kaydedilir. Bu filmler, çekme gerinim, oligodendrosit farklılaşmasının ilerlemesi ile tutarlı olan kromatin yapısında ve dinamiklerdeki değişiklikleri ortaya koymasını göstermektedir.
Uygulamalı gerginlik altında canlı hücre görüntüleme Teknik olarak zordur ve mikroskop sistemi ile uyumlu bir cihaz tasarımı gerektirir. Burada açıklanan özel tasarım ticari çözümlere ucuz bir alternatif sunar. Boyutları, uygulanan gerginlik sırasında yüksek uzamsal çözünürlükte mikroskop aşamaları ve canlı hücre görüntüleme üzerine kurulumunu sağlar. Görüntüleme kurulumu, yüksek netlik ile 100 x yağ daldırma lens kullanarak canlı hücre görüntüleme kolaylaştırmak için tasarlanmıştır, kapak cam aracılığıyla, aksi takdirde görüntü kalitesini azaltır ve en yaygın olan polidimetilsiloksan plaka tabakası ile değil görüntüleme kurulumları. Hücre içeren takılı bir plaka ile cihaz, ayrıca kuluçte kolayca depolanabilir. Bu cihaz, yapışan hücre kültürünü kolaylaştıran ve birden fazla gün boyunca istikrarlı ve Tekdüzen bir gerginlik sağlamak için kaybolduğu tek eksenli gerinim uygulamak için tasarlanmıştır. Burada açıklanan kurulum, hücre mechanobiology birçok alanda mechanotransdution çalışmalar için uygulanabilir hale, gerginlik altında çeşitli yapışkar hücre türlerinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primary cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats 
			were provided by Dr. S. Y. Chew&#39;s lab at Nanyang Technological University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high&#160; glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11996-065-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-608-50ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-776-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Stock components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroxine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold and PDMS plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - Dow Corning Sylgard 184</td>
			<td>Ellsworth</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold - Liquid Plastic</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Smooth Cast 310 - Trail Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate Coatings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface functionalization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3648-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BS3</td>
			<td>Covachem</td>
			<td>13306-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63578-AK-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1110501-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution imaging of nuclear dynamics in live cells under uniaxial tensile strain

Ekstrelüler mekanik gerinim hücre fenotipi tepkiler ele almak için bilinmektedir ve çeşitli doku sistemlerinde fizyolojik alaka vardır. Biyokimyasal bilgiler aracılığıyla hücre popülasyonlarında uygulanan ekstrellüler çekme gerilimin etkisini yakalamak için, bir cihaz daha önce sadece imal edilebilir ve doku kültürü inküförleri içine sığdırmak için yeterli küçük, yanı sıra üzerine tasarlanmıştır mikroskop aşamaları. Ancak, polidimetilsiloksan substratum önceki tasarımı yağ daldırma hedefleri ile yüksek çözünürlüklü alt hücresel görüntüleme izin vermedi. Bu çalışma, polydimetylsiloxane substratum 'un yeniden tasarlanan geometrisini ve birlikte uygulanan gerinim altında canlı hücrelerin yüksek çözünürlüklü alt hücresel görüntülemeyi kolaylaştırabilecek özelleştirilmiş bir görüntüleme kurulumunu açıklar. Bu substratum aynı, daha önceki tasarlanmış cihaz ile kullanılabilir ve bu nedenle, yukarıda listelenen aynı avantajları vardır, ek olarak yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme izin. Polidimetilsiloksan substratum tasarımı önce ve gerinim uygulamadan sonra aynı hücreyi izlemeyi kolaylaştıracak bir ızgara ekleyerek iyileştirilebilir. Temsili sonuçlar burada açıklanan yöntemi kullanarak yakalanan gergin hücreler içinde floresan etiketli çekirdeklerin yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme gösterir. Bu nükleer dinamikler verileri, uygulanan çekme gerinim, oligodendrosit progenitör hücrelerinin farklılaşmasını teşvik eden mekanizmaya dair Öngörüler verir.

Son çalışma oligodendrosit üzerinde çekme geriliminin etkisini araştırmayı amaçlayan10 % 10 tek eksenli çekme gerinim gen ifadesinde küresel değişiklikler ile oligodendrosit progenitör hücrelerin farklılaşma teşvik gösterdi. Gen ifadesinde bu değişikliklerin arkasındaki mekanizma, sitroiskelet yapısı, transkripsiyon faktörü lokalizasyonu, nükleer dinamikler ve kromatin organizasyonu gibi alt hücresel parametrelerin görüntülenmesi yolu...

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain at JoVE.com

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi

Daha önce tasarlanmış bir cihazı kullanarak bağlı hücrelere mekanik gerilme uygulamak için, bu yazıda bir yeniden tasarlanan substratum geometrisi ve 100 x yağ daldırma amacı ile gergin hücrelerin yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüleme için özelleştirilmiş bir cihaz açıklanmaktadır.

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Daha önce yapışık hücrelere mekanik zorlanma uygulamak için bir cihaz tasarladık. Mevcut çalışmada, substratum geometrisini yeniden tasarladık ve bu gerinim hücrelerinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kurulum özelleştirilmiş. Bu hücre germe sisteminin en büyük avantajı, gerinim hücrelerinin 100x'inde yüksek çözünürlüklü hücre altı görüntüleme sağlamasıdır.Substratum imalatını gösteren Vicki, laboratuvarımdan araştırma görevlisi. Eşlik eden metin protokolü ile birlikte takip ederek tek iyi polidimetilsiloksane kalıp tasarlayarak başlayın. Daha sonra, tek kullanımlık bir fincan bir parçası kür ajan ile bir polidimethylsiloxane baz 20 parça karıştırın.Bir kez karıştırılır, karışımı kabarcıklar kaldırmak için 0,8 bar 30 dakika bir vakum de-gasser polidimethylsiloxane karışımı yerleştirin. Sonra, kalıp ve çanak içine polidimethylsiloxane karışımı dökün. 30 dakika boyunca 0,8 bar vakum tekrar gaz gidererek bu aşamada herhangi bir ek kabarcıklar çıkarın.Gaz giderme tamamlandığında, numuneleri 80 derecede bir tesviye masasında iki saat pişirin. Daha sonra, dikkatle fırından örnekleri çıkarın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Bir bıçak ile kenarları kesin ve yavaşça tedavi poliditilsiloxane soyma.150 milimetre çapında polidimethylsiloxane, bir marker ile iki santimetre ızgara iki santimetre çizin. Her kare içinde, her tarafta 0,5 santimetre lik bir marj bırakarak, bir santimetre kare bir santimetre çizin. Dikkatle çizgiler boyunca kesmek ve kare bölmeleri elde etmek için bir bıçak kullanın.Daha sonra, dört saat boyunca% 100 aseton içinde kuluçka tarafından örnekleri temizleyin, ek dört saat için% 100 etanol, ve daha sonra dört saat otoklavlı suda. Temizlenmiş numuneleri 150 milimetre çapındaki plastik bir tabağın içine parafin film destek kağıdına yerleştirin ve numuneyi dört saat boyunca 80 derecelik bir fırında kurulayın. Bittiğinde, parafin film ile yemekleri mühür ve daha fazla kullanıma kadar soğuk bir odada saklayın.Progenitor hücreleri hazırlamak ve çoğalma orta onları askıya. PdL kaplı plastik yüzeyler üzerine santimetre kare başına 35,000 hücre yoğunluğunda bu hücreleri tohum. Çoğalma ortamının hacmini yüzey alanının 10 santimetre karesi başına üç mililitreye ayarlayın.Daha düşük bir ortam hacmi yüzey gerilim kuvvetlerinden kaynaklanan hücre kümelenmelerine yol açarken, tabaklarda daha yüksek bir ortam hacmi ortamın dökülmesine neden olabilir. Tohumlama dan sonra üçüncü gün, hücreleri hasat ve bir hemositometre kullanarak saymak. Daha sonra, tohum 35, 000 hücre polidimethylsiloxane plaka başına 700 mikrolitre proliferasyon orta ile.Daha sonra, üreticinin yönergelerini izleyerek hücrenin histon H2B komplekslerini yeşil floresan proteinle etiketlemek için plazmik bir yapı ekleyin. 24 saat sonra, polidimethylsiloxane örneklerini tek eksenli gerinim cihazına gerilecek hücrelerle monte edin. Daha sonra, tüm örneklerdeki ortamı farklılaşma ortamına çevirin.Zorlanmamış hücre bölmesi uzunluğunu ölçün ve hücre bölmesi uzunluğunu istenilen miktarda gerilme yle artırmak için sahne mikrometre vidasını çevirin. Gerilmiş ve gerilmemiş polidimethylsiloxane örneklerini görüntülemeye kadar 37 santigrat derecede kuvözde bırakın. Kuvöz sıcaklığını 37 dereceye ayarlayarak mikroskop inkübatörünü canlı görüntülemeye hazırlayın.Daha sonra, 100x petrol daldırma hedefini merkezi konuma getirin, çünkü nesnel dönüş daha sonra erişilemeyecektir. Bir kez pozisyonda, objektif sökmek ve objektif bir halka ile birlikte vida, böylece objektif hücrelere yakın getirilebilir. Sonra, objektif yağ bir damla ekleyin.Özel baskılı tutucu kullanarak, pencerenin çevresinde vakum gresi ile tutucuyu katlayın ve tutucunun üst yüzeyine sıfır numaralı kalınlıkta cam kapak kaydırın. Plastik pencereyi mikroskop aşamasına bantlayın. Daha sonra, bir Z çeviri sahnesini mikroskop aşamasına vidala ve en üstteki Z konumuna taşıyın.Görüntülenecek gerilmiş polidimethylsiloxane plaka dan orta 500 mikrolitre çıkarın ve beyaz plastik pencerede cam kapak üzerine bu orta ekleyin. Daha sonra, polidimethylsiloxane plakadan kare bölmeyi dikkatlice ayırmak için bir çift steril cımbız kullanın. Gerinim cihazını, hücrelerin yukarı, beyaz plastik pencerenin üzerinde bakacak şekilde dik bir pozisyonda tutun ve gerinim cihazını dikkatlice tersine çevirin, böylece hücreler aşağı bakacak şekilde cam örtünün ortasına herhangi bir ekstra ortamın düşmesine izin verin.Gerinim cihazının alt kısmını, yerinde tutmak için çift taraflı bant kullanarak Z çeviri aşamasına yerleştirin. Parlak alan altında göz parçası üzerinden bakarken, çok yavaş gerinim cihazı aşağı getirmek ve hücrelere odaklanmak için hedef yukarı taşımak. Z çeviri aşamasının düşürülmesi ile hedefin yükseltilmesi arasında dönüşümlü olarak bu odaklama adımını yavaşça gerçekleştirin.Z çeviri aşaması çok fazla düşerse, hücreler sıkıştırAbilir ve dolayısıyla ölebilir. Eğer hedefi çok yükseltirsek, cam kapak kaymasını kırabilir ve ortamın sızdırılmasına neden olabilir. 488 nanometre uyarma epiflorescence kullanarak, bir floresan çekirdeği olan bir hücre bulmak için X ve Y yönde polidimethylsiloxane plaka tarayın.Ayrıca, parlak alan altındaki örneğe bakarken hücrenin uygun bir morfolojiye sahip olduğundan emin olun. Toplam 30 dakika boyunca 488 nanometre dalga boyu uyarma ve parlak alan uyarma ile hücrenin geniş alan veya açık iğne deliği görüntülerini kare başına 30 saniyearalıklarla kaydedin. Polidimethylsiloxane substratumun yeniden tasarlanmış geometrisi ve bu videoda gösterilen görüntüleme kurulumu hücreler ile amaç arasındaki mesafeyi en aza indirir.Bu, 100x yağ daldırma amacı kullanarak floresan etiketli hücre çekirdeklerinin zaman atlamalı görüntüleme sağlar. Nükleer dalgalanmaları ölçmek için önce nükleer alanı zamana karşı planla. Daha sonra, üçüncü dereceden bir polinom kullanarak verilerin detrend'ini verin.Ve son olarak, artık dalgalanmaları çizin ve kalan dalgalanmaların standart sapmasını hesaplayın. Oligodendrocyte progenitor hücrelerinin nükleer dalgalanmaları, %10'luk bir çekme gerilimi ile ve %10 çekmesüz diferansiyasyonun kimyasal indüksiyonunu takiben, sadece kimyasal indüksiyonla nükleer dalgalanmaların genliği 48 saatte önemli bir düşüş gösterdiğini göstermektedir, ancak 24 saat değil. Diğer taraftan, kimyasal indüksiyon %10 çekme gerilimi ile birlikte 24 saatte önemli bir azalma gösterdi ve 48 saat daha fazla azalma olmadan sabit kaldı.Unutulmaması gereken en önemli şey, seçilen hedefin çalışma mesafesinin hücre bölmesi derinliğine ve kapak kaymasının kalınlığına eşit veya daha büyük olması gerektiğidir. Substratum, önceki ve sonraki veri kümesi türü deneysel hatadan kaynaklanan gürültüyü azalttığından, zorlanma uygulamasından önce ve sonra aynı hücrenin görüntülenmesikolaylaştıracak bir ızgara yı dahil edecek şekilde yeniden tasarlanabilir. Bu görüntüleme kurulumu kullanılarak, protein lokalizasyonu veya hücresel bileşenlerin dinamiği gibi yapışık canlı hücrelerdeki birçok hücre altı fenomen, mekanik zorlanmanın uygulanmasından saniyeler sonra görüntülenebilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

Manyetik Rezonans Görüntüleme altında Manyetik Destekli Uzaktan Kumandalı mikrokateter İpucu Sehim

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antikor conjugates ilk değerlendirilmesi ile Viral kaynaklı peptidler hücresel birikimi artan ve tümör hedefleme artırmak için değiştirilmiş

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...