Name: application of consistent massage-like perturbations on mouse calves and monitoring the resulting intramuscular pressure changes
Uploaded: 2019-09-20T13:00:00
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Nous remercions K. Nakanishi, K. Hamamoto, N. Kume et K. Tsurumi pour leur soutien constant tout au long du projet. Ce travail a été en partie soutenu par le Fonds de recherche intra-muros du ministère japonais de la Santé, du Travail et du Bien-être social; Subventions d'aide pour la recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science; Programme soutenu par MEXT pour la Fondation de recherche stratégique des universités privées, 2015-2019 du ministère japonais de l'Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie (S1511017).

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées sous l'approbation du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Centre national de réadaptation pour les personnes handicapées.
1. Immobilisation des membres postérieurs bilatéraux de souris
REMARQUE : Des souris mâles c57BL/6 ont été utilisées pour des expériences à l'âge de 11 - 12 semaines après l'acclimatation pendant au moins 7 jours.
<ol><li>Anesthésiez adéquatement...

<ol>
	<li>Furlan, A. D., Imamura, M., Dryden, T., Irvin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massage+for+low+back+pain:+an+updated+systematic+review+within+the+framework+of+the+Cochrane+Back+Review+Group.">Massage for low back pain: an updated systematic review within the framework of the Cochrane Back Review Group.</a> Spine. 34 (16), 1669-1684 (2009).</li><li>Robertson, A., Watt, J. M., Galloway, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+leg+massage+on+recovery+from+high+intensity+cycling+exercise.">Effects of leg massage on recovery from high intensity cycling exercise.</a> British Journal of Sports Medicine. 38 (2), 173-176 (2004).</li><li>Waters-Banker, C., Butterfield, T. A., Dupont-Versteegden, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effects+of+massage+on+nonperturbed+skeletal+muscle+in+rats.">Immunomodulatory effects of massage on nonperturbed skeletal muscle in rats.</a> Journal of Applied Physiology. 116 (2), 164-175 (2014).</li><li>Haas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massage+timing+affects+postexercise+muscle+recovery+and+inflammation+in+a+rabbit+model.">Massage timing affects postexercise muscle recovery and inflammation in a rabbit model.</a> Medicine &amp; Science in Sports &amp; Exercise. 45 (6), 1105-1112 (2013).</li><li>Crane, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massage+therapy+attenuates+inflammatory+signaling+after+exercise-induced+muscle+damage.">Massage therapy attenuates inflammatory signaling after exercise-induced muscle damage.</a> Science Translational Medicine. 4 (119), 119ra113 (2012).</li><li>Bove, G. M., Harris, M. Y., Zhao, H., Barbe, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+therapy+as+an+effective+treatment+for+fibrosis+in+a+rat+model+of+upper+extremity+overuse+injury.">Manual therapy as an effective treatment for fibrosis in a rat model of upper extremity overuse injury.</a> Journal of the Neurological Sciences. 361, 168-180 (2016).</li><li>Andrzejewski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+skeletal+muscle+expression+of+VEGF+induced+by+massage+and+exercise.">Increased skeletal muscle expression of VEGF induced by massage and exercise.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 53 (2), 145-151 (2015).</li><li>Mantovani Junior, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+massage+as+a+recuperative+technique+on+autonomic+modulation+of+heart+rate+and+cardiorespiratory+parameters:+a+study+protocol+for+a+randomized+clinical+trial.">Effects of massage as a recuperative technique on autonomic modulation of heart rate and cardiorespiratory parameters: a study protocol for a randomized clinical trial.</a> Trials. 19 (1), 459 (2018).</li><li>Zeng, H., Butterfield, S., Agarwal, F., Haq, T., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineering+approach+for+quantitative+analysis+of+the+lengthwise+strokes+in+massage+therapies.">An engineering approach for quantitative analysis of the lengthwise strokes in massage therapies.</a> Journal of Medical Devices. 2 (4), (2008).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechatronic+system+for+quantitative+application+and+assessment+of+massage-like+actions+in+small+animals.">A mechatronic system for quantitative application and assessment of massage-like actions in small animals.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (1), 36-49 (2014).</li><li>Saitou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cyclical+compression+modulates+macrophage+function+in+situ+and+alleviates+immobilization-induced+muscle+atrophy.">Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy.</a> Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).</li><li>Onda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+mouse+model+of+skeletal+muscle+atrophy+using+spiral+wire+immobilization.">A New mouse model of skeletal muscle atrophy using spiral wire immobilization.</a> Muscle Nerve. 54 (4), 788-791 (2016).</li><li>Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines--chemotactic+cytokines+that+mediate+inflammation.">Chemokines--chemotactic cytokines that mediate inflammation.</a> The New England Journal of Medicine. 338, 436-445 (1998).</li><li>Reid, M. B., Li, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-&#945;+and+muscle+wasting:+a+cellular+perspective.">Tumor necrosis factor-&#945; and muscle wasting: a cellular perspective.</a> Respiratory Research. 2 (5), 269-272 (2001).</li><li>Baumann, J. U., Sutherland, M. D., Hangg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramuscular+pressure+during+walking:+An+experimental+study+using+the+wick+catheter+technique.">Intramuscular pressure during walking: An experimental study using the wick catheter technique.</a> Clinical Orthopaedics Related Research. 145, 292-299 (1979).</li><li>Lee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+physical+inactivity+on+major+non-communicable+diseases+worldwide:+an+analysis+of+burden+of+disease+and+life+expectancy.">Effect of physical inactivity on major non-communicable diseases worldwide: an analysis of burden of disease and life expectancy.</a> Lancet. 380, 219-229 (2012).</li></ol>

Nous avons décrit une méthode pour appliquer un stimulus mécanique massage-like, qui a des effets anti-inflammatoires. Notre système a des avantages suivants, même par rapport à ceux signalés précédemment. Tout d'abord, les études précédentes n'ont pas défini quantitativement les forces mécaniques appliquées2 ou défini leurs magnitudes en fonction de la mesure à la surface du corps, mais pas à l'intérieur des tissus10. En revanche, nous avons mesuré la p...

Le massage est généralement reconnu comme bénéfique à la fois pour soulager la douleur et l'amélioration de la performance physique chez les athlètes de compétition et les non-athlètes1,2. En fait, des études antérieures ont montré que le massage supprime l'inflammation locale3 et incite à la récupération des dommages musculaires post-exercice4,5. Les mécanismes moléculaires sous-jacents aux effets bénéfiques du massage restent largement inconnus.
L'une des difficultés avec l'enquête mécaniste sur le massage est liée à la reproductibilité des techniques expérimentales par lesquelles des interventions de massage sont testées. Dans des études antérieures, les procédures expérimentales qui imitent le massage impliquent principalement l'application d'interventions physiques utilisant les parties du corps des praticiens, telles que les paumes et les doigts6,7,8. Il est donc difficile de reproduire avec précision leur ampleur, leur fréquence, leur durée et leur mode.
De nombreux dispositifs ont été développés pour appliquer des charges mécaniques définies sur les tissus cibles. Par exemple, Zeng et coll. ont mis au point un système pneumatique pour la charge mécanique de longueur des membres postérieurs des rats9 et Wang et coll. ont mis au point un dispositif méchatronique qui peut appliquer des charges mécaniques semblables à des massages aux membres postérieurs des rats et des lapins avec contrôle de rétroaction en temps réel10. Par rapport à eux, notre système local de compression cyclique (LCC) est beaucoup plus simple, exigeant beaucoup moins de coûts pour la construction. Néanmoins, nous pouvons reproduire les changements de pression intramusculaire qui sont générés pendant la légère contraction musculaire. À l'aide de ce dispositif, nous avons démontré avec succès que les interventions mécaniques semblables à des massages modulent la dynamique des fluides interstitiels locaux et atténuent l'atrophie musculaire induite par l'immobilisation11.
Ici, nous décrivons les détails de notre dispositif et le protocole, qui peut aider à explorer les mécanismes moléculaires derrière les effets positifs des exercices et des massages. Les schémas du protocole sont présentés sous la forme d'une figure supplémentaire 1.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Aluminum wire</td>
<td>DAISO JAPAN</td>
<td>B028</td>
<td>An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire</td>
</tr>
<tr>
<td>Blood pressure telemeter</td>
<td>Millar</td>
<td>SPR-671</td>
<td>A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure.</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1306</td>
<td>DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy.</td>
</tr>
<tr>
<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500)</td>
<td>Invitrogen </td>
<td>A11034</td>
<td>Antibody for immunohistochemical staining.</td>
</tr>
<tr>
<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500))</td>
<td>Invitrogen </td>
<td>A11077</td>
<td>Antibody for immunohistochemical staining.</td>
</tr>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>NIH</td>
<td>N/A</td>
<td>Analysis software for image</td>
</tr>
<tr>
<td>LabChart8</td>
<td>ADInstrumens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Analysis software for acquiring biological signals.</td>
</tr>
<tr>
<td>Prolong gold</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>P36930</td>
<td>Prolong gold is for mounting stained samples.</td>
</tr>
<tr>
<td>Protein Block Serum-Free</td>
<td>Dako</td>
<td>X090930-2</td>
<td>For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000)</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>L0663</td>
<td>Antibody for immunohistochemical staining.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500)</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab6640</td>
<td>Antibody for immunohistochemical staining.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000)</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab25124</td>
<td>Antibody for immunohistochemical staining.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit polyclonal anti-TNF-&alpha; antibody (Dilution ratio, 1:1000)</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab66579</td>
<td>Antibody for immunohistochemical staining.</td>
</tr>
<tr>
<td>Surgical tape</td>
<td>3M Japan</td>
<td>1530EP-0</td>
<td>Surgical tape is used to restrict joint movement.</td>
</tr>
</tbody>
</table>

application of consistent massage-like perturbations on mouse calves and monitoring the resulting intramuscular pressure changes

Le massage est généralement reconnu comme bénéfique pour soulager la douleur et l'inflammation. Bien que des études antérieures aient rapporté des effets anti-inflammatoires du massage sur les muscles squelettiques, les mécanismes moléculaires derrière sont mal compris. Nous avons récemment développé un dispositif simple pour appliquer la compression cyclique locale (LCC), qui peut générer des ondes de pression intramusculaire avec des amplitudes variables. Utilisant ce dispositif, nous avons démontré que LCC module des réponses inflammatoires des macrophages in situ et soulage l'atrophie musculaire induite par l'immobilisation. Ici, nous décrivons des protocoles pour l'optimisation et l'application de LCC comme intervention mass-like contre l'inflammation induite par l'immobilisation et l'atrophie des muscles squelettiques des membres postérieurs de souris. Le protocole que nous avons développé peut être utile pour étudier le mécanisme sous-jacent aux effets bénéfiques de l'exercice physique et le massage. Notre système expérimental fournit un prototype de l'approche analytique pour élucider la régulation mécanique de l'homéostasie musculaire, bien que d'autres développements doivent être faits pour des études plus complètes.

Conformément à nos observations précédentes12, l'ASC des myofibres gastrocnemius a été considérablement diminuée par immobilisation postérieure(figure 2A,B). En outre, notre analyse de coloration d'immunofluorescence a indiqué que les cellules exprimant MCP-1 et TNF-, qui jouent tous les deux des rôles clés en réglant des processus inflammatoires13,14, sensiblement augmenté dans ...

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Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Nous décrivons ici les protocoles pour appliquer des charges mécaniques définies aux veaux de souris et pour surveiller les changements concomitants de pression intramusculaire. Les systèmes expérimentaux que nous avons développés peuvent être utiles pour étudier le mécanisme derrière les effets bénéfiques de l'exercice physique et le massage.

Application de perturbations de massage cohérentes sur les veaux de souris et surveillance des changements de pression intramusculaire qui en résultent

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Notre protocole peut être utile dans les systèmes et le mécanisme. Et les bonnes informations montrent l’effet du stress physique et du massage. Notre système local d’achèvement cyclique est beaucoup plus simple.Les méthodes conventionnelles ne sont pas nécessaires pour l’insertion locale. Appliquer du ruban chirurgical sur les membres postérieurs bilatéraux en position supine avec les articulations du genou étendues et les articulations de la cheville plantaires fléchi. Placez un fil d’aluminium sur le tronc au niveau de la colonne vertébrale L4-5, et encez le fil dans une configuration en spirale autour des membres postérieurs avec des écarts de cinq millimètres entre chaque tour de la spirale.Afin de réduire au minimum la possibilité de s’échapper du câblage, ajustez manuellement la configuration du fil pour immobiliser les articulations de la hanche à une position d’enlèvement à 90 degrés. Ensuite, retournez la souris dans sa cage d’accueil avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Pour mesurer la pression musculaire gastrocnemius intramusculaire placer la souris anesthésiée dans la position couchée et raser, déplater et semi-stériliser la peau du veau postérieur.Utilisez un scalpel pour faire une incision de deux millimètres dans la peau désinfectée. Et insérez une aiguille de 20 jauges dans le muscle gastrocnemius à un angle de 150 à 170 degrés à la surface de la peau. Ensuite, en utilisant la gaine en plastique de l’aiguille comme un guide, placez un capteur de télémètre de pression artérielle dans le ventre moyen du muscle gastrocnemius.Enfermez la peau avec une suture en nylon 4-O. Ensuite, utilisez plusieurs poids cylindriques différents pour appliquer une compression cylindrique locale sur le muscle du mollet pendant une minute. Et surveiller la pression intramusculaire à l’aide du logiciel approprié pour l’analyse des signaux biologiques.Pour le traitement de compression cyclique local désengager la souris anesthésiée du câblage du membre postérieur. Et placez l’animal dans la position couchée. Ajustez les membres postérieurs de sorte que les articulations du genou soient étendues et que les articulations de la cheville soient plantaires fléchies avec les mollets orientés vers le haut.Et déplacez verticalement une unité de poids cylindrique, recouverte d’un coussin coussiné, sur le muscle du mollet à un hertz pendant 30 minutes par jour pendant sept jours. Après chaque épisode quotidien de compression rebrancher les membres postérieurs de la souris avant de retourner l’animal dans sa cage d’origine. À la fin de l’expérience, dépolar la surface postérieure du mollet et faire une incision cutanée pour permettre la séparation des muscles gastrocnemius de l’os tibiofibulaire.Congelez rapidement le tissu musculaire récolté dans une solution optimale de composé de température de coupe. Et utilisez un cryostat pour obtenir des sections des muscles gastrocnemius sur des toboggans en verre. Pour l’étiquetage immunohistochimique, décongeler et déshydrater les sections en séchant à l’air à température ambiante avant d’utiliser un stylo hydrophobe pour dessiner un anneau autour des sections tissulaires de chaque toboggan.Ensuite, placez les glissières dans la chambre d’humidité. Et ajouter 100 microlitres de tampon de blocage de chaque côté. Après 30 minutes à température ambiante rincer les diapositives avec deux lavages de 5 minutes en PBS-T, avant d’étiqueter les sections avec 100 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt pendant la nuit à température ambiante.Le lendemain matin, lavez les glissières 3 fois en PBS-T pendant 5 minutes par lavage. Et étiquetez les échantillons avec un anticorps secondaire approprié pendant 1 heure à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez les glissières 3 fois en PBS-T frais comme démontré.Et tacher les noyaux avec 100 microlitres de DAPI pendant trois minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, lavez la diapositive trois fois de plus. Et monter les échantillons avec un milieu de montage compatible et slips de couverture.Pour l’analyse histomorphométrique, placez les diapositives sur la scène d’un microscope à fluorescence et visualisez les échantillons sous un subjectif 20 X dans les filtres appropriés. Ensuite, dans le logiciel d’analyse d’image mesurer la zone transversale de chaque myofiber et compter le nombre de cellules exprimant les marqueurs expérimentaux d’intérêt. La zone transversale de gastrocnemius myofiber sont sensiblement diminuées par l’immobilisation de membre postérieur.En outre, l’analyse immunofluorescente de coloration indique que les cellules exprimant MCP-1 et TNF-alpha sont sensiblement augmentées dans les tissus musculaires gastrocnemius des membres postérieurs immobilisés. Ensemble, avec l’augmentation des cellules positivement souillées avec F4/80, l’immobilisation de membre postérieur semble instigateur de l’atrophie de muscle de veau, impliquant des réponses inflammatoires locales, y compris l’accumulation de macrophage. Parmi les différentes magnitudes de compression cycliques locales testées en changeant le poids de l’unité cylindrique, la compression correspondant à 50 millilitres d’ondes de pression intermusculaires au mercure, semble atténuer le plus efficacement la diminution induite par l’immobilisation dans la zone transversale du myofiber et augmenter l’accumulation de macrophages dans les muscles gastrocnemius.Une compression cyclique locale de 66 grammes, appliquée à 1 hertz pendant 30 minutes par jour pendant 7 jours, soulage de manière significative les diminutions induites par l’immobilisation observée dans la zone transversale myofiber des muscles gastrocnemius. De plus, la compression cyclique locale tempère partiellement les diminutions induites par l’immobilisation de la force contractante des muscles des triceps surae. En outre, la compression cyclique locale tempère l’augmentation de F4/80 positif, TNF-alpha positif, et MCP-1 une cellule positive dans le tissu musculaire gastrocnemius des membres postérieurs immobilisés.Notre approche fournira une base scientifique pour l’élévation musculaire dans le patient et notre stratégie potentielle pour la procédure préventive. Le rat a trouvé le limité de l’inactivité physique. En utilisant notre système, nous avons commencé à évaluer le plus grand nombre de patients qui manquent de mécanique dans le patient.Moyen industriel local modéré de le faire fait une atrophie musculaire induite par l’immobilisation parfaite.

Research

JoVE Journal

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Recherche

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