Name: application of consistent massage-like perturbations on mouse calves and monitoring the resulting intramuscular pressure changes
Uploaded: 2019-09-20T13:00:00
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Agradecemos a K. Nakanishi, K. Hamamoto, N. Kume e K. Tsurumi pelo seu apoio consistente em todo o projeto. Este trabalho foi, em parte, apoiado pelo fundo de investigação intramural do Ministério japonês da saúde, trabalho e bem-estar; Subvenções em auxílio à investigação científica da sociedade japonesa para a promoção da ciência; MEXT-programa apoiado para a Fundação de pesquisa estratégica em universidades privadas, 2015-2019 do Ministério japonês da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (S1511017).

Todos os experimentos com animais foram conduzidos a aprovação do Comitê institucional de cuidados e uso de animais do centro nacional de reabilitação para pessoas com deficiência.
1. imobilização dos membros posteriores bilaterais do rato
Nota: camundongos machos C57BL/6 foram utilizados para experimentos com idade de 11-12 semanas após aclimatação por pelo menos 7 dias.
<ol><li>Anestesiam adequadamente um rato utilizando pentobarbital sódico (50 mg/k...

<ol>
	<li>Furlan, A. D., Imamura, M., Dryden, T., Irvin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massage+for+low+back+pain:+an+updated+systematic+review+within+the+framework+of+the+Cochrane+Back+Review+Group.">Massage for low back pain: an updated systematic review within the framework of the Cochrane Back Review Group.</a> Spine. 34 (16), 1669-1684 (2009).</li><li>Robertson, A., Watt, J. M., Galloway, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+leg+massage+on+recovery+from+high+intensity+cycling+exercise.">Effects of leg massage on recovery from high intensity cycling exercise.</a> British Journal of Sports Medicine. 38 (2), 173-176 (2004).</li><li>Waters-Banker, C., Butterfield, T. A., Dupont-Versteegden, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effects+of+massage+on+nonperturbed+skeletal+muscle+in+rats.">Immunomodulatory effects of massage on nonperturbed skeletal muscle in rats.</a> Journal of Applied Physiology. 116 (2), 164-175 (2014).</li><li>Haas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massage+timing+affects+postexercise+muscle+recovery+and+inflammation+in+a+rabbit+model.">Massage timing affects postexercise muscle recovery and inflammation in a rabbit model.</a> Medicine &amp; Science in Sports &amp; Exercise. 45 (6), 1105-1112 (2013).</li><li>Crane, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massage+therapy+attenuates+inflammatory+signaling+after+exercise-induced+muscle+damage.">Massage therapy attenuates inflammatory signaling after exercise-induced muscle damage.</a> Science Translational Medicine. 4 (119), 119ra113 (2012).</li><li>Bove, G. M., Harris, M. Y., Zhao, H., Barbe, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+therapy+as+an+effective+treatment+for+fibrosis+in+a+rat+model+of+upper+extremity+overuse+injury.">Manual therapy as an effective treatment for fibrosis in a rat model of upper extremity overuse injury.</a> Journal of the Neurological Sciences. 361, 168-180 (2016).</li><li>Andrzejewski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+skeletal+muscle+expression+of+VEGF+induced+by+massage+and+exercise.">Increased skeletal muscle expression of VEGF induced by massage and exercise.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 53 (2), 145-151 (2015).</li><li>Mantovani Junior, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+massage+as+a+recuperative+technique+on+autonomic+modulation+of+heart+rate+and+cardiorespiratory+parameters:+a+study+protocol+for+a+randomized+clinical+trial.">Effects of massage as a recuperative technique on autonomic modulation of heart rate and cardiorespiratory parameters: a study protocol for a randomized clinical trial.</a> Trials. 19 (1), 459 (2018).</li><li>Zeng, H., Butterfield, S., Agarwal, F., Haq, T., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineering+approach+for+quantitative+analysis+of+the+lengthwise+strokes+in+massage+therapies.">An engineering approach for quantitative analysis of the lengthwise strokes in massage therapies.</a> Journal of Medical Devices. 2 (4), (2008).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechatronic+system+for+quantitative+application+and+assessment+of+massage-like+actions+in+small+animals.">A mechatronic system for quantitative application and assessment of massage-like actions in small animals.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (1), 36-49 (2014).</li><li>Saitou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cyclical+compression+modulates+macrophage+function+in+situ+and+alleviates+immobilization-induced+muscle+atrophy.">Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy.</a> Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).</li><li>Onda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+mouse+model+of+skeletal+muscle+atrophy+using+spiral+wire+immobilization.">A New mouse model of skeletal muscle atrophy using spiral wire immobilization.</a> Muscle Nerve. 54 (4), 788-791 (2016).</li><li>Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines--chemotactic+cytokines+that+mediate+inflammation.">Chemokines--chemotactic cytokines that mediate inflammation.</a> The New England Journal of Medicine. 338, 436-445 (1998).</li><li>Reid, M. B., Li, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-&#945;+and+muscle+wasting:+a+cellular+perspective.">Tumor necrosis factor-&#945; and muscle wasting: a cellular perspective.</a> Respiratory Research. 2 (5), 269-272 (2001).</li><li>Baumann, J. U., Sutherland, M. D., Hangg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramuscular+pressure+during+walking:+An+experimental+study+using+the+wick+catheter+technique.">Intramuscular pressure during walking: An experimental study using the wick catheter technique.</a> Clinical Orthopaedics Related Research. 145, 292-299 (1979).</li><li>Lee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+physical+inactivity+on+major+non-communicable+diseases+worldwide:+an+analysis+of+burden+of+disease+and+life+expectancy.">Effect of physical inactivity on major non-communicable diseases worldwide: an analysis of burden of disease and life expectancy.</a> Lancet. 380, 219-229 (2012).</li></ol>

Nós descrevemos um método para aplicar uma massagem-como o estímulo mecânico, que tem efeitos anti-inflammatory. Nosso sistema tem as seguintes vantagens mesmo quando comparado com aqueles relatados previamente. Em primeiro lugar, estudos prévios não definiram quantitativamente as forças mecânicas aplicadas2 ou definiram suas magnitudes com base na medida na superfície do corpo, mas não dentro dos tecidos10. Ao contrário, Nós medimos a pressão intramuscular usa...

A massagem é geralmente reconhecida como benéfica tanto para o alívio da dor quanto para a melhora do desempenho físico entre atletas competitivos e não atletas iguais1,2. Na verdade, estudos anteriores mostraram que a massagem suprime a inflamação local3 e solicita a recuperação do dano muscular pós-exercício4,5. Os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos benéficos da massagem permanecem largamente desconhecidos.
Uma das dificuldades com a investigação mecanicista sobre massagem relaciona-se com a reprodutibilidade de técnicas experimentais pelas quais as intervenções de massagem são testadas. Em estudos prévios, os procedimentos experimentais que imitam a massagem envolvem principalmente a aplicação de intervenções físicas utilizando partes corporais dos praticantes, como palmas e dedos6,7,8. Isso faz com que seja difícil reproduzir precisamente sua magnitude, frequência, duração e modo.
Muitos dispositivos foram desenvolvidos para aplicar cargas mecânicas definidas aos tecidos-alvo. Por exemplo, Zeng et al. desenvolveram um sistema pneumático para o carregamento mecânico de comprimento-sábio para os membros posteriores do rato9 e Wang et al. desenvolveram um dispositivo Mecatrônico que pode aplicar cargas mecânicas de massagem como para os membros posteriores de ratos e coelhos com controle de feedback em tempo real10. Comparado a eles, o nosso sistema de compressão cíclica local (LCC) é muito mais simples, exigindo muito menos custo para a construção. No entanto, podemos reproduzir as alterações da pressão intramuscular que são geradas durante a contração muscular leve. Usando este dispositivo, Nós demonstramos com sucesso que as intervenções mecânicas massagem-como modulam a dinâmica fluida intersticial local e aliviam a atrofia imobilização-induzida do músculo11.
Aqui, descrevemos os detalhes do nosso dispositivo e do protocolo, que pode ajudar a explorar os mecanismos moleculares por trás dos efeitos positivos dos exercícios e massagens. Os esquemas do protocolo são apresentados como Figura complementar 1.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Aluminum wire</td>
<td>DAISO JAPAN</td>
<td>B028</td>
<td>An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire</td>
</tr>
<tr>
<td>Blood pressure telemeter</td>
<td>Millar</td>
<td>SPR-671</td>
<td>A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure.</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1306</td>
<td>DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy.</td>
</tr>
<tr>
<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500)</td>
<td>Invitrogen </td>
<td>A11034</td>
<td>Antibody for immunohistochemical staining.</td>
</tr>
<tr>
<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500))</td>
<td>Invitrogen </td>
<td>A11077</td>
<td>Antibody for immunohistochemical staining.</td>
</tr>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>NIH</td>
<td>N/A</td>
<td>Analysis software for image</td>
</tr>
<tr>
<td>LabChart8</td>
<td>ADInstrumens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Analysis software for acquiring biological signals.</td>
</tr>
<tr>
<td>Prolong gold</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>P36930</td>
<td>Prolong gold is for mounting stained samples.</td>
</tr>
<tr>
<td>Protein Block Serum-Free</td>
<td>Dako</td>
<td>X090930-2</td>
<td>For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000)</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>L0663</td>
<td>Antibody for immunohistochemical staining.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500)</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab6640</td>
<td>Antibody for immunohistochemical staining.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000)</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab25124</td>
<td>Antibody for immunohistochemical staining.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit polyclonal anti-TNF-&alpha; antibody (Dilution ratio, 1:1000)</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab66579</td>
<td>Antibody for immunohistochemical staining.</td>
</tr>
<tr>
<td>Surgical tape</td>
<td>3M Japan</td>
<td>1530EP-0</td>
<td>Surgical tape is used to restrict joint movement.</td>
</tr>
</tbody>
</table>

application of consistent massage-like perturbations on mouse calves and monitoring the resulting intramuscular pressure changes

A massagem é geralmente reconhecida para ser benéfico para aliviar a dor e inflamação. Embora os estudos precedentes relatem efeitos anti-inflammatory da massagem em músculos esqueletais, os mecanismos moleculars atrás são compreendidos mal. Nós desenvolvemos recentemente um dispositivo simples para aplicar a compressão cíclica local (LCC), que pode gerar ondas intramusculares da pressão com amplitudes de variação. Usando este dispositivo, Nós demonstramos que o LCC modula respostas inflamatórios de macrófagos in situ e alivia a atrofia do músculo imobilização-induzida. Aqui, nós descrevemos protocolos para a optimização e a aplicação de LCC como uma massagem-como a intervenção de encontro à inflamação imobilização-induzida e à atrofia de músculos esqueletais de hindmembros do rato. O protocolo que desenvolvemos pode ser útil para investigar o mecanismo subjacente aos efeitos benéficos do exercício físico e da massagem. Nosso sistema experimental fornece um protótipo da abordagem analítica para elucidar a regulação mecânica da homeostase muscular, embora mais desenvolvimento precise ser feito para estudos mais abrangentes.

Em consonância com as observações anteriores12, a CSA de miofibras de gastrocnêmio foi significativamente diminuída pela imobilização do membro posterior (Figura 2A, B). Além disso, nossa análise da coloração da imunofluorescência revelou que as pilhas que expressam MCP-1 e TNF-α, ambo desempenham papéis chaves em regular processos inflamatórios13,14, aumentaram significativamen...

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Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Aqui nós descrevemos os protocolos para aplicar cargas mecânicas definidas aos bezerros do rato e para monitorar as mudanças intramusculares concomitantes da pressão. Os sistemas experimentais que desenvolvemos podem ser úteis para investigar o mecanismo por trás dos efeitos benéficos do exercício físico e da massagem.

Aplicação de consistente massagem-como perturbações em bezerros do mouse e monitoramento das mudanças de pressão intramuscular resultante

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Nosso protocolo pode ser útil nos sistemas e mecanismos. E as informações certas mostram o efeito do estresse físico e da massagem. Nosso sistema de conclusão cíclica local é muito mais simples.Os métodos convencionais não são necessários para a inserção local. Aplique fita cirúrgica nos membros traseiros bilaterais na posição supina com as articulações do joelho estendidas e as articulações do tornozelo plantar flexionadas. Coloque um fio de alumínio no tronco no nível da coluna L4-5 e enrole o fio em uma configuração espiral ao redor dos membros traseiros com lacunas de cinco milímetros entre cada volta da espiral.Para minimizar a possibilidade de fuga da fiação, ajuste manualmente a configuração do fio para imobilizar as articulações do quadril em uma posição de 90 graus de abdução. Em seguida, devolva o mouse para sua gaiola doméstica com monitoramento até a recuperação completa. Para medir a pressão muscular gastrocnemius intramuscular coloque o camundongo anestesiado na posição propensa e raspe, despilate e semi-esterilize a pele da panturrilha posterior.Use um bisturi para fazer uma incisão de dois milímetros na pele desinfetada. E insira uma agulha de 20 medidores no músculo gastrocnemius em um ângulo de 150 a 170 graus à superfície da pele. Em seguida, usando a bainha de plástico da agulha como guia, coloque um sensor telemétrico de pressão arterial na barriga média do músculo gastrocnemius.Inclua a pele com uma sutura de nylon 4-O. Em seguida, use vários pesos diferentes da unidade cilíndrica para aplicar a compressão cilíndrica local no músculo da panturrilha por um minuto. E monitorar a pressão intramuscular usando o software apropriado para análise de sinais biológicos.Para o tratamento local de compressão cíclica desengate o rato anestesiado da fiação do membro traseiro. E coloque o animal na posição propensa. Ajuste os membros traseiros para que as articulações do joelho sejam estendidas e as articulações do tornozelo sejam plantar flexionadas com as panturrilhas voltadas para cima.E mova verticalmente uma unidade de peso cilíndrico, coberta com uma almofada amortecida, sobre o músculo da panturrilha em um hertz por 30 minutos por dia durante sete dias. Após cada ataque diário de compressão religar os membros traseiros do rato antes de devolver o animal à gaiola. No final do experimento despito da superfície posterior da panturrilha e fazer uma incisão da pele para permitir a separação dos músculos gastrocnemius do osso tibiofibular.Congele rapidamente o tecido muscular colhido em uma solução ótima de composto de temperatura de corte. E use um criostat para obter seções dos músculos gastrocnemius em lâminas de vidro. Para a rotulagem imunohistoquímica descongelar e desidratar as seções secando a temperatura ambiente antes de usar uma caneta hidrofóbica para desenhar um anel em torno das seções teciduais em cada lâmina.Em seguida, coloque os slides na câmara de umidade. E adicione 100 microliters de tampão de bloqueio para cada lado. Após 30 minutos a temperatura ambiente enxague os slides com duas lavagens de 5 minutos em PBS-T, antes de rotular as seções com 100 microliters do anticorpo primário de interesse durante a noite à temperatura ambiente.Na manhã seguinte, lave os slides 3 vezes em PBS-T por 5 minutos por lavagem. E rotule as amostras com um anticorpo secundário apropriado por 1 hora à temperatura ambiente, protegido da luz. No final da incubação, lave os slides 3 vezes em PBS-T fresco como demonstrado.E manche os núcleos com 100 microliters de DAPI por três minutos à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, lave o slide mais três vezes. E monte as amostras com um meio de montagem compatível e deslizes de cobertura.Para análise histomorfométrica, coloque os slides no estágio de um microscópio de fluorescência e visualize as amostras sob um subjetivo de 20 X nos filtros apropriados. Em seguida, no software de análise de imagem medir a área transversal de cada miofibra e contar o número de células expressando os marcadores experimentais de interesse. A área transversal da miofibra gastrocnemius são significativamente diminuídas pela imobilização do membro traseiro.Além disso, a análise de coloração imunofluorescente revela que as células que expressam MCP-1 e TNF-alfa são significativamente aumentadas nos tecidos musculares gastrocnemius de membros traseiros imobilizados. Em conjunto, com o aumento das células manchadas positivamente com F4/80, a imobilização do membro traseiro parece instigar atrofia muscular da panturrilha, envolvendo respostas inflamatórias locais, incluindo o acúmulo de macrófagos. Entre as várias diferentes magnitudes de compressão cíclica local testadas alterando o peso da unidade cilíndrica, a compressão correspondente a 50 mililitros de ondas de pressão intermuscular de mercúrio, parece aliviar mais eficientemente a diminuição induzida pela imobilização na área transversal do miofibra e aumentar o acúmulo de macrófago nos músculos gastrocnemius.Uma compressão cíclica local de 66 gramas, aplicada a 1 hertz durante 30 minutos por dia durante 7 dias, alivia significativamente as reduções induzidas pela imobilização observada na área transversal do miofibra dos músculos gastrocnemius. Mais, a compressão cíclica local tempera parcialmente a imobilização induzida à diminuição da força de contração dos músculos tríceps surae. Além disso, a compressão cíclica local tempera o aumento em F4/80 positivo, TNF-alfa positivo, e MCP-1 uma célula positiva no tecido muscular gastrocnemius de membros traseiros imobilizados.Nossa abordagem fornecerá uma base científica para o aumento muscular do paciente e nossa estratégia potencial para o procedimento preventivo. O rato encontrou a limitação da inatividade física. Usando nosso sistema, começamos a avaliar o maior número de pacientes que não têm músculos no paciente.Uma maneira industrial local moderada de fazê-lo faz uma atrofiação muscular induzida por imobilização perfeita.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

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Um modelo ortotópico de câncer de ovário seroso em camundongos imunocompetentes para In vivo Imaging Tumor e Monitoramento de Tumor respostas imunes

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Imunologia e Infecção

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Imagem adesão leucocitária ao endotélio vascular na pressão intraluminal de alta

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

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Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

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Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

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