Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها الصندوق بدء التشغيل المقدمة من جامعة ولاية آيوا والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (R35GM128747).

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها لجنة الاستخدام (IACUC، 8-16-8333--أنا) من جامعة ولاية آيوا ورعاية الحيوان المؤسسية.
1-تجميع لاستشعار التوتر التكاملية
<ol><li>تخصيص وترتيب سدناس (انظر الجدول للمواد). ملاحظة: تسلسل سدنى كما يلي. ستراند العلوي هو/5ThioMC6-D/GGG AGG ACG كاج وظفته دول مج...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+cell+migration.">Integrins in cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).</li><li>Hood, J. D., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+integrins+in+cell+invasion+and+migration.">Role of integrins in cell invasion and migration.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).</li><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts.">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li><li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression.">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li><li>G&#243;mez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ib&#225;&#241;ez-Jim&#233;nez, B., Palacios, I. M., Mart&#237;n-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy.">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li><li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions.">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

البحث عن هو الوصول للغاية بعد قوة تقنية قوية للخلوي التعيين من حيث التوليف والتطبيق. مع جميع المواد جاهزة، يمكن توليفها البحث عن إطار يوم 1. خلال التجارب، هناك حاجة فقط ثلاث خطوات لطلاء السطح قبل الطلاء الخلية. في الآونة الأخيرة، نحن كذلك تبسيط الإجراءات طلاء إلى خطوة واحدة بربط مباشرة الب?...

الخلايا تعتمد على إينتيجرينس الالتزام وبذل القوات الخلوية للمصفوفة خارج الخلية. نقل الخلية بوساطة إنتغرين الالتصاق والقوة حاسمة بالنسبة للخلية التي تنتشر الهجرة3،4،1،2وبقاء5،،من67. على المدى الطويل، إنتغرين مما يشير إلى النشاط الحيوي أيضا يؤثر على خلية انتشار8،،من910 والتمايز11،12. قد طور الباحثون أساليب مختلفة لقياس والخريطة المنقولة إنتغرين الخلوية قوات في واجهة الخلية-مصفوفة. وتستند هذه الطرق التحتية المرنة13، مجموعة من14من micropost، أو ذرية قوة مجهرية (فؤاد)15،16. الطرق التحتية و micropost مرنة تعتمد على تشوه ركائز تقرير الإجهاد الخلوية والقيود فيما يتعلق بالقرار المكانية وقوة حساسية. فؤاد قوة عالية الحساسية، ولكن فإنه لا يمكن الكشف عن القوة في مواقع متعددة في وقت واحد، مما يجعل من الصعب على خريطة القوة الخلوية أحالها إينتيجرينس.
في السنوات الأخيرة، وضعت عدة تقنيات لدراسة القوة الخلوية على المستوى الجزيئي. ووضعت مجموعة من أجهزة الاستشعار الجزيئية التوتر على أساس17،البولي إيثيلين غليكول18وعنكبوت الحرير الببتيد19، والحمض الخلوي الصبغي20،21،،من2223 إلى تصور ورصد التوتر المرسلة بواسطة البروتينات الجزيئية. من بين هذه التقنيات، اعتمد الحمض النووي أولاً كقياس المواد التوليف في التوتر الحبل (TGT)، رابط روبتورابل الذي ينظم الحد الأعلى للتوترات إنتغرين في الخلايا الحية22،24. في وقت لاحق، تقنية نقل صدى الحمض النووي والأسفار تم الجمع بين لخلق دبوس أجهزة استشعار التوتر الفلورسنت على أساس الحمض النووي أولاً تشن المجموعة23 و مجموعة ساليتا في20. جهاز استشعار التوتر القائم على الحمض النووي دبوس تقارير إنتغرين التوتر في الوقت الحقيقي وتم تطبيقه بنجاح على دراسة سلسلة من الوظائف الخلوية21. بعد ذلك، ضم مختبر وانغ TGT مع زوج فلوروفوري-يحتوي تقرير إنتغرين التوتر. يدعى هذا الاستشعار البحث عن25،26. يستند مزدوج تقطعت الحمض النووي (dsDNA) ومجموعة ديناميكية أوسع (10-60 pN) لمعايرة التوتر إنتغرين. على النقيض من دبوس أجهزة الاستشعار على أساس الحمض النووي، البحث عن لا تبلغ قوة الخلوية في الوقت الحقيقي لكن يسجل جميع الأحداث التاريخية إنتغرين كالبصمة الخلوية القوة؛ تحسن هذه العملية تراكم الإشارات حساسية الخلوية قوة التصوير، ويجعلها ممكنة لقوة الصورة الخلوية حتى مع مجهر الأسفار منخفضة. توليف للبحث عن نسبيا أكثر ملاءمة، فإنه يتم إنشاؤه بواسطة التهجين اثنين واحد-الذين تقطعت بهم السبل المعينة (سدنا).
البحث عن دسدنا 18-قاعدة-إقران مترافق مع البيوتين، فلوروفوري، تقضي (الثقب الأسود يحتوي 2 [BHQ2])27، و دوري أرجينيلجليسيلاسبارتيك حمض (إدارات) ببتيد28 يجند ببتيد إنتغرين (الشكل 1). حبلا أقل هو مترافق مع فلوروفوري (Cy3 ويستخدم في هذه المخطوطة، بينما الأصباغ الأخرى، مثل سلسلة Cy5 أو أليكسا، ثبت عمليا في المختبر لدينا أيضا) والعلامة البيوتين، التي هي معطلة البحث عن على الركازة بالسندات avidin البيوتين. ستراند العلوي هو مترافق مع إدارات الببتيد و "تقضي الثقب الأسود"، الذي يروي Cy3 مع حوالي 98 ٪ التبريد الكفاءة26،27. مع البروتوكول المعروضة في هذه الورقة، كثافة الطلاء لها على الركازة حول 1,100/ميكرون2. وهذا هو كثافة نحن معايرة سابقا عن 18 شركة بريتيش بتروليوم بيوتينيلاتيد دسدنا المغلفة على الركازة فونكتيوناليزيد نيوترافيدين باتباع نفس طلاء بروتوكول29. عندما تلتزم الخلايا الركيزة مغطاة البحث عن، يربط لها من خلال إدارات إنتغرين وينقل التوتر إلى البحث عن. وقد البحث عن توتر محددة تسامح (تيتول) الذي يعرف بأنه على عتبة التوتر الذي يفصل ميكانيكيا دسدنا لها داخل 2 ق22. تمزق سبب التوتر إنتغرين يؤدي إلى فصل يحتوي من الصبغة التي تنبعث الأسفار فيما بعد. نتيجة لذلك التوتر إنتغرين غير مرئية يتم تحويلها إلى إشارة الأسفار ويمكن تعيين قوة الخلوية بتصوير الأسفار.
لبيان تطبيق للبحث عن، نستخدم الأسماك كيراتوسيتي هنا، نموذج خلية مستخدمة على نطاق واسع للخلية الهجرة دراسة30،،من3132، الخلية K1 تشو، خط الخلية نونموتيلي استخداماً، وتنتجها الخلايا الليفية 3T3 المعاهد الوطنية للصحة. ويجري أيضا كويماجينج إنتغرين الهياكل التوتر والخلية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

هو التوتر الجزيئية المرسلة بواسطة السندات إنتغرين-يجند الإشارات الميكانيكية الأساسية في المسار إنتغرين التي تضطلع بأدوار هامة في العديد من وظائف الخلية والسلوكيات. لمعايرة والصورة إنتغرين التوتر مع حساسية عالية القوة والقرار المكانية، قمنا بتطوير جهاز استشعار توتر تكاملية (البحث عن)، جهاز استشعار توتر فلورية القائمة على الحمض النووي. يتم تنشيط البحث عن فلوريس إذا إدامة توتر جزيئية، وبالتالي تحويل القوة إلى إشارة مضيئة على المستوى الجزيئي. عتبة التوتر عن التنشيط الانضباطي في النطاق من 10 – 60 pN جيدا يغطي النطاق الديناميكي للتوتر إنتغرين في الخلايا. على الركازة المطعمة بالبحث عن، تصور بالأسفار التوتر إنتغرين الخلايا ملتصقة وتصويرها في القرار submicron. البحث عن أيضا متوافقة مع التصوير الهيكلي الخلية في الخلايا الحية والخلايا الثابتة. البحث عن طبق بنجاح دراسة تقلص الصفائح الدموية والهجرة الخلية. هذه الورقة تفاصيل الإجراء للتوليف وتطبيق لها في الدراسة المنقولة إنتغرين القوة الخلوية.

مع لها، تم القبض على خريطة التوتر إنتغرين كيراتوسيتيس الأسماك. وتبين أن كيراتوسيتي وترحيل ويولد التوتر إنتغرين في مسارين القوة (الشكل 2A). تمت معايرة القرار خريطة القوة إلى 0.4 ميكرومتر (الشكل 2). ويركز إنتغرين ارتفاع حدة التوتر في الهامش الخ?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

التوتر إنتغرين تلعب أدواراً هامة في مختلف وظائف الخلية. مع جهاز استشعار توتر تكاملية، معايرة بحساسية بيكونيوتون (pN) إنتغرين التوتر وتصويرها في القرار submicron.

التصوير إنتغرين التوتر وقوة الخلوية في القرار Submicron مع جهاز استشعار توتر التكاملية

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

هذا الحمض النووي القائم على استشعار التوتر التكاملي، أو ITS، تحويل إشارة القوة إلى الفلوريسنس محليا تمكن التصوير المباشر للقوة الخلوية مع المجهر الفلوري. ITS لديه دقة المكانية العالية وحساسية عالية. عتبة التنشيط هو قابل للتواؤم، مما يسمح صورة انتقائية من التوتر integrin على مختلف المستويات.بعد تلقي الحمض النووي المخصص واحد تقطعت بهم السبل، أو ssDNA، من الفائدة، لconjugate RGD الببتيد إلى ثيوليتوات SsDNA quencher، أولا إضافة 100 ميكرولترات من 0.5-EDTA المولر في 400 ميكرولترات من الماء إلى حوالي 450 ميكرولتررز من حل TCEP الطازجة. ثم، إضافة 10 ميكرولترات من حل TCEP-EDTA إلى 20 ميكرولترات من واحد ملليمولار ثيول الحمض النووي quencher في برنامج تلفزيوني لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لمقارنه RGD أمين مع sulfo-SMCC، إضافة 40 ميكرولترات من 23 ملليمترا أعدت حديثا sulfo-SMCC إلى 100 ميكرولترات من 11 ملليمولار حديثا 11 ملليمولار أمين حل لاحتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.لconjugate RGD أمين SMCC مع ثيوليتوت SsDNA quencher، مزيج من كامل حجم حل ssDNA quencher thiolated مع كامل حجم حل RGD أمين SMCC لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، نقل الحل إلى تخزين أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، اخلطي كلوريد الصوديوم ثلاثي الزحم مع محلول الحمض النووي المتقارن ثيول وناقص 20 درجة مئوية، مبردة، 100٪ إيثانول بنسبة واحد إلى 10 إلى 25، ووضع التفاعل عند ناقص 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.عندما عجل الحمض النووي، وجمع الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في برنامج تلفزيوني لقياس تركيز الحمض النووي على مطياف. لمستشعر التوتر التكاملي، أو ITS، التوليف، مزيج حلول الحمض النووي حبلا العلوي والسفلي في نسبة 1.1 إلى واحد مولور، واحتضان رد فعل بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية قبل وضع aliquots من الخليط في ناقص 20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. لشليط لها، معطف 29 ملليمتر قطرها، طبق بيتري الزجاج القاع مع 200 ميكرولتر من 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر بيوتينيل بيوتينيبيبي ألبوم المصل البقري، أو BSA-البيوتين، لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية.عندما يكون BSA-biotin قد تمزّم جسديًا على سطح الزجاج ، اغسل الطبق ثلاث مرات بـ 200 ميكرولتر من PBS الطازج لكل غسل ، يليه حضانة مع 200 ميكرولتر من 50 ميكروغرامًا لكل ملليلتر من بروتين avidin لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الطبق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح، وإضافة 200 ميكرولترات من 0.1-micromolar ITS لاحتضان آخر لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الطبق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، وترك آخر غسل في الطبق حتى طلاء الخلية.لبدء ثقافة القرنية السمكية، استخدم ملاقط مسطح ة لنتف قطعة من المقياس من سمكة، واضغط بلطف على المقياس على بئر طبق بيتري زجاجي غير معدل، مع الجانب الداخلي من المقياس الذي يتصل بالزجاج. انتظر حوالي 30 ثانية لمقياس الأسماك للتمسك السطح الزجاجي للطبق قبل تغطية المقياس مع ملليمتر واحد من المتوسط الكامل لإيسكوف في Dulbecco المعدلة. ثم، احتضان المقياس في مربع الظلام والرطب لمدة ست إلى 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.لطبقة القراتوسيات على سطح ITS، استبدل الوسيط من طبق ثقافة القرنية القرنية مع محلول فصل الخلايا 1X لاحتضان لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، استبدال حل فصل مع المتوسطة كاملة جديدة، وفك الخلايا مع الأنابيب لطيف. ثم، ضبط الخلايا إلى التركيز المناسب للطلاء، والبذور منها على طبق المغلفة ITS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير.بالنسبة للتصوير شبه الفعلي للتوتر في الخلايا الحية، قم بنقل الخلايا إلى مرحلة مجهر الفلورسين، وحدد الهدف 40 أو 100 مرة. في برنامج التصوير، قم بتعيين وقت التعرض لثانية واحدة وفاصل الإطار 20 ثانية للحصول على فيديو لصور ITS. ثم، استخدم برنامج تحليل الصور المناسب لطرح إطار سابق من الفيديو ITS من إطار الحالي لحساب إشارة ITS التي تم إنتاجها حديثا في الفترة الأخيرة الإطار.وتمثل إشارة إي سي إي التي تم إنتاجها حديثاً التوتر المُتَوَكَّد في آخر فاصل زمني للإطار، وبذلك تبلغ عن القوة الخلوية بطريقة شبه آنية. هنا، رسم خرائط التوتر integrin يدل على تحريض التوتر integrin في مسارين قوة أثناء الهجرة قرينة القرنية. ويمكن عندئذ معايرة دقة خريطة القوة لتكون 0.4 ميكرومتر.ارتفاع التوتر integrin يركز على الهامش الخلفي في القراتوسيات الأسماك الضهر. في الخلايا غير المُمَلَّية، يُشكَّل نمط توتر غير مُحدد مختلف تمامًا عن النمط الذي لوحظ في القراتوسيات المُهاجرة بسرعة. يمكن أن تكون الالتصاقات البؤرية والتوتر integrin من قراتسيات السمك شارك في الصورة لتقييم العلاقة بين التوتر integrin وبنية الخلية في الخلايا ذات الاهتمام.مع ITS، قوة التصاق الخلية يصبح مرئيا مع قرار وحساسية مماثلة للتصوير الهيكلي الخلية. هذه التقنية تمهد الطريق لدراسة التفاعل بين القوة وبنية في الخلايا.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

اكتشاف الجزيئية البيولوجية توظيف الانعكاس التداخل التصوير الاستشعار (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

الشلل البكتيرية للتصوير بواسطة الفحص المجهري القوة الذرية

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

قياس الافراج عن التوتر أثناء المستحثة بالليزر اكسون الآفات لتقييم التصاق محور عصبي إلى الركيزة في Piconewton والقرار ملي

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

تعديل التقييم الأولى لجسم-يصرف مع الببتيدات المشتقة من الفيروسية لزيادة تراكم الخلوية وتحسين استهداف الورم

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...