Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af fondens opstart fra Iowa State University og af National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC, 8-16-8333-jeg) i Iowa State University.
1. Sammenfatning af Integrativ spænding sensor
<ol><li>Tilpasse og Bestil ssDNAs (Se Tabel af materialer). Bemærk: SsDNA sekvenserne er som følger. Den øverste del er /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. De lavere dele er som følger. 12 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG KBRT FTT CCC /3Bio/ 23 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CT...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+cell+migration.">Integrins in cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).</li><li>Hood, J. D., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+integrins+in+cell+invasion+and+migration.">Role of integrins in cell invasion and migration.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).</li><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts.">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li><li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression.">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li><li>G&#243;mez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ib&#225;&#241;ez-Jim&#233;nez, B., Palacios, I. M., Mart&#237;n-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy.">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li><li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions.">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

ITS er en meget tilgængelig endnu kraftfulde teknik for cellulær tvinge kortlægning både syntese og anvendelse. Med alle materialer klar, kan ITS syntetiseres i 1 dag. Under eksperimenter, er kun tre trin af overfladebehandling nødvendig før celle plating. For nylig, vi yderligere forenklet proceduren belægning til et trin af direkte forbinder ITS til bovin serum albumin, som giver mulighed for direkte fysisk adsorption af ITS til glas eller polystyren overflader33. ITS bringer fluoresceren...

Celler stole på integriner at overholde og udøve cellulære styrker til ekstracellulære matrix. Integra-medieret celle vedhæftning og kraft transmission er afgørende for celle spredning1,2, migration3,4og overlevelse5,6,7. På lang sigt påvirkninger integrin biomekaniske signalering også celle spredning8,9,10 og differentiering11,12. Forskere har udviklet forskellige metoder til at måle og kort integrin overførte cellulære styrker på grænsefladen celle-matrix. Disse metoder er baseret på elastisk undergrundens13, array af micropost14, eller atomic force mikroskopi (AFM)15,16. Elastisk undergrundens og micropost metoder er afhængige af deformation af substrater til at rapportere den cellulært stress og har begrænsninger med hensyn til rumlige opløsning og tvinge følsomhed. AFM har høj kraft følsomhed, men det kan ikke afsløre kraft på flere steder samtidig, hvilket gør det vanskeligt at kortlægge cellulære kraft fremsendes integriner.
I de seneste år, blev flere teknikker udviklet for at studere cellulær kraft på molekylært niveau. En samling af molekylære spænding sensorer baseret på polyethylen glycol17,18, spider silke peptid19og DNA20,21,22,23 blev udviklet til visualisere og overvåge spændingen fremsendes molekylære proteiner. Blandt disse teknikker, blev DNA først vedtaget som syntese materiale i spændingen måle tether (TGT), en rupturable linker, der modulerer den øvre grænse for integrin spændinger i levende celler22,24. Senere, DNA og fluorescens resonans overførsel teknik blev kombineret til at oprette hårnål DNA-baserede fluorescerende spænding sensorer først af Chens gruppe23 og Salaitas gruppe20. Hårnål DNA-baserede spænding sensor rapporter integrin spændinger i real-tid og har været anvendt med succes til undersøgelse af en række cellulære funktioner21. Bagefter, kombineret Wang's lab en TGT med fluorophore-quencher parret til betænkningen integrin spændinger. Denne sensor er opkaldt en ITS25,26. ITS er baseret på dobbelt-strenget DNA (dsDNA) og har et bredere dynamikområde (10-60 pN) til integrin spænding kalibrering. I modsætning til hårnål DNA-baserede sensorer, ITS rapporterer ikke cellulære kraft i realtid men registrerer alle historiske integrin begivenheder som fodaftryk af cellulære kraft; Dette signal ophobning proces forbedrer følsomheden for cellulære kraft imaging, der gør det muligt at billedet cellulære kraft selv med en low-end fluorescens mikroskop. Syntesen af ITS er relativt mere bekvemt, da det er skabt af hybridizing to enkeltstrenget DNAs (ssDNA).
ITS er en 18-base-parret dsDNA konjugeret med biotin, en fluorophore, en quencher (sort hul Quencher 2 [BHQ2])27og en cyklisk arginylglycylaspartic syre (M.H.T.) peptid28 som en integrin peptid ligand (figur 1). Den nederste linje er konjugeret med fluorophore (Cy3 er anvendt i dette manuskript, mens andre farvestoffer, såsom Cy5 eller Alexa serien, også har bevist, muligt i vores lab) og biotin tag, hvormed ITS er immobiliseret på et underlag af biotin-begærlighed bond. Den øvre strand er konjugeret med M.H.T. peptid og sort hul Quencher, der slukker Cy3 med ca 98% quenching effektivitet26,27. Med protokollen præsenteret i dette papir, er belægning tætheden af ITS på et substrat omkring 1.100/µm2. Dette er massefylden vi tidligere kalibreret for 18 bp biotinylated dsDNA belagt på neutrAvidin-functionalized underlaget ved at følge den samme belægning protokol29. Når celler overholder substrat belagt med ITS, integrin binder ITS gennem M.H.T. og transmitterer spænding til ITS. ITS har en specifik spænding tolerance (Ttol), der defineres som den spænding tærskelværdi, der mekanisk adskiller dsDNA ITS inden for 2 s22. SIT ruptur af integrin spændinger fører til adskillelsen af quencher fra farvestoffet, der efterfølgende udsender fluorescens. Som et resultat, den usynlige integrin spænding er konverteret til et fluorescens signal og den cellulære kraft kan kortlægges af fluorescens billeddannelse.
For at demonstrere anvendelsen af ITS, bruger vi fisk keratocyte her, udbredte celle model for celle migration undersøgelse30,31,32, CHO-K1 celle, almindeligt anvendte nonmotile cellelinje og NIH 3T3 fibroblast. Coimaging af integrin spændinger og celle strukturer er også gennemført.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

Molekylær spænding fremsendes integrin-ligand obligationer er grundlæggende mekaniske signalet i integrin pathway, som spiller vigtige roller i mange cellefunktioner og adfærd. For at kalibrere og billed integrin spændinger med høj kraft følsomhed og rumlige opløsning, udviklede vi en integrativ spænding sensor (ITS), en DNA-baseret fluorescerende spænding sensor. ITS er aktiveret for at fluorescerer hvis opretholde en molekylær spændinger, således konvertering kraft til fluorescerende signal på det molekylære niveau. Spænding tærsklen for ITS aktivering er afstemmelige i rækken af 10 – 60 pN, der dækker godt dynamikområde integrin spændinger i celler. På et substrat podet med en ITS, er integrin spændingen i vedhængende celler visualiseret ved fluorescens og afbildet på submicron opløsning. ITS er også kompatibel med celle strukturel billeddannelse i levende celler og faste celler. ITS har været anvendt med succes til studiet af trombocyt sammentrækning og celle migration. Dette papir beskriver proceduren for syntese og anvendelse af ITS i studiet af integrin overførte cellulære kraft.

Med ITS, blev integrin spænding kort af fisk keratocytes fanget. Det viser, at en keratocyte vandrer og genererer integrin spænding på to kraft spor (figur 2A). Opløsning af kraft kort var kalibreret til at være 0,4 µm (figur 2B). Høj integrin spænding koncentrerer sig på den bageste margin (figur 3A). ITS viser også forskellige specifikke mønstre af forskellige celler. En nonmotile celle,...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Integrin spænding spiller vigtige roller i forskellige cellefunktioner. Med en integrativ spænding sensor, er integrin spændinger kalibreret med picoNewton (pN) følsomhed og afbildet på submicron beslutning.

Imaging Integrin spændinger og cellulære kraft på Submicron opløsning med en integrativ spænding Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Denne DNA-baserede integrativ spændingssensor, eller ITS, konvertere kraft signal til fluorescens lokalt muliggør direkte billeddannelse af cellulære kraft med fluorescens mikroskopi. ITS har en høj rumlig opløsning og en høj følsomhed. Aktiveringstærsklen er ikke i stand til at give mulighed for selektivt billede af integrinspænding på forskellige niveauer.Efter at have modtaget den tilpassede enkeltstrengede DNA, eller ssDNA, af interesse, at konjugere RGD peptid til thiolated ssDNA quencher, først tilføje 100 mikroliter af 0,5-molar EDTA i 400 mikroliter vand til omkring 450 mikroliter af frisklavet TCEP løsning. Derefter tilsættes 10 mikroliter af TCEP-EDTA-opløsningen til 20 mikroliter af en millimolar thiol DNA quencher i PBS til en 30-minutters inkubation ved stuetemperatur. For at konjugere RGD-amin med sulfo-SMCC tilsættes 40 mikroliter frisklavet 23-millimolar sulfo-SMCC til 100 mikroliter frisklavet 11 millimolar RGD-aminopløsning til en 20-minutters inkubation ved stuetemperatur.For at konjugere RGD amine SMCC med den thiolerede ssDNA quencher blandes hele mængden af den thiolerede ssDNA quencher-opløsning med hele volumenet af RGD amine SMCC-opløsningen til en times inkubation ved stuetemperatur. Ved slutningen af inkubationen overføres opløsningen til fire grader Celsius-opbevaring natten over. Den næste morgen, bland tre-molar natriumchlorid med thiol-konjugerede DNA-opløsning og minus 20-graders Celsius, kølet, 100% ethanol ved en en-til-10-til-25 forhold, og placere reaktionen på minus 20 grader Celsius i ca 30 minutter.Når DNA'et er udfældet, indsamles DNA'et ved centrifugering, og pellet i PBS opslæmes til måling af DNA-koncentrationen på et spektrometer. For integrativ spændingssensor, eller ITS, syntese, bland den øvre og nedre streng DNA-løsninger på en 1,1-til-en-molar forhold, og inkubere reaktionen natten over ved fire grader Celsius før du placerer aliquots af blandingen på minus 20 grader Celsius for langtidsopbevaring. For sin immobilisering, pels en 29-millimeter-diameter, glas-bund petriskål med 200 mikroliter på 0,1-milligram-per-milliliter biotinyleret kvæg serum albumin, eller BSA-biotin, i 30 minutter ved fire grader Celsius.Når BSA-biotinen fysisk har adsorberet på glasoverfladen, vaskes skålen tre gange med 200 mikroliter frisk PBS pr. vask efterfulgt af inkubation med 200 mikroliter på 50 mikrogram avidinprotein i 30 minutter ved fire grader Celsius. Ved slutningen af inkubationen vaskes skålen tre gange med PBS som påvist, og der tilsættes 200 mikroliter af 0,1-mikromolar ITS til yderligere 30 minutters inkubation ved fire grader Celsius. Ved slutningen af inkubationen vaskes skålen tre gange med PBS, så den sidste vask efterlades i skålen, indtil belægningen.For at starte en fisk keratocyt kultur, bruge en flad-tippet pincet til at plukke et stykke skala fra en fisk, og forsigtigt trykke skalaen på brønden af en uændret glasbund petriskål, med den indvendige side af skalaen kontakt glasset. Vent i ca. 30 sekunder, før fiskeskalaen klæber til skålens glasoverflade, før du dækker skalaen med en millimeter komplet Iscoves modificerede Dulbeccos medium. Derefter inkubere skalaen i en mørk og fugtig kasse i seks til 48 timer ved stuetemperatur.For at plade keratocytterne på ITS-overfladen skal mediet erstattes af keratocytkulturskålen med 1X celleafskiveopløsning for en tre minutters inkubation ved stuetemperatur. Ved slutningen af inkubationen udskiftes afmontereopløsningen med frisk komplet medium, og cellerne adskilles med skånsom pipettering. Derefter justeres cellerne til den rette koncentration for plettering, og frø dem på ITS belagt skål i 30 minutter ved stuetemperatur før billeddannelse.For kvasi-real-time integrin spænding imaging i levende celler, overføre cellerne til det stadium af en fluorescens mikroskop, og vælg 40 eller 100 gange mål. I billedbehandlingssoftwaren skal du indstille eksponeringstiden til et sekund og billedintervallet på 20 sekunder for at få en video af ITS-billederne. Brug derefter et passende billedanalysesoftwareprogram til at trække en tidligere ramme af ITS-videoen fra en aktuel ramme for at beregne det ITS-signal, der for nylig er produceret i det seneste billedinterval.Det nyproducerede ITS-signal repræsenterer den integrinspænding, der er opstået i det seneste rammeinterval, hvorved den cellulære kraft rapporteres på en kvasi-realtidsmåde. Her viser integrinspændingskortlægningen induktionen af integrinspænding på to kraftspor under keratocytmigration. Kraftkortets opløsning kan derefter kalibreres til at være 0,4 mikrometer.Høj integrin spænding koncentrerer sig på den bageste margen i motile fisk keratocytter. I ikke-tåtil celler dannes et specifikt integrin spændingsmønster, der er helt forskelligt fra det, der observeres i den hurtigt vandrende keratocyt. Fokale sammenvoksninger og integrin spænding af fisk keratocytter kan co-imaged at vurdere forholdet mellem integrin spænding og cellestruktur i celler af interesse.Med ITS bliver cellevedhæftningskraft synlig med en opløsning og en følsomhed, der kan sammenlignes med cellestrukturisk billeddannelse. Denne teknik baner vejen for studiet af en kraft-struktur samspil i celler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Måling af Tension frigivelse i løbet Laser Induced Axon Læsion at evaluere axonale vedhæftning til underlaget ved Piconewton og millisekund

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Indkapslingen af ​​Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høj opløsning Spatiotemporal Analyse af receptor Dynamics ved Single-molekyle fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force mikroskopi Imaging og Kraft spektroskopi af understøttede lipiddobbeltlag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Indledende vurdering af antistof-konjugater modificeret med Viral-afledte peptider til at øge cellulære ophobning og forbedring af Tumor målretning

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Undertrykke gen transskription ved at omdirigere cellulære maskiner med kemiske epigenetiske modifikatorer

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...