Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
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Diese Arbeit wurde von der Gründerfonds zur Verfügung gestellt von der Iowa State University und durch das National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747) unterstützt.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee (IACUC, 8-16-8333-I) der Iowa State University genehmigt.
1. Synthese von der integrativen Spannung sensor
<ol><li>Anpassen und SsDNAs (siehe die Tabelle der Materialien) zu bestellen. Hinweis: Die SsDNA-Sequenzen sind wie folgt. Die oberen Strang ist /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. Die unteren Stränge sind wie folgt. 12 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio//5C...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+cell+migration.">Integrins in cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).</li><li>Hood, J. D., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+integrins+in+cell+invasion+and+migration.">Role of integrins in cell invasion and migration.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).</li><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts.">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li><li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression.">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li><li>G&#243;mez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ib&#225;&#241;ez-Jim&#233;nez, B., Palacios, I. M., Mart&#237;n-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy.">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li><li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions.">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

Der ITS ist eine hochverfügbare, aber dennoch leistungsfähige Technik für zellulares zwingen Zuordnung im Hinblick auf die Synthese und Anwendung. Mit allen Materialien bereit kann der ITS innerhalb 1 Tages synthetisiert werden. Während der Experimente sind nur drei Schritte der Oberflächenbeschichtung vor der Zelle Beschichtung erforderlich. Vor kurzem haben wir weiter vereinfacht Coating-Verfahren für einen Schritt durch direkte Verknüpfung des ITS zu Rinderserumalbumin, ermöglicht direkte physikalische Adsorpt...

Zellen setzen auf Integrine zu halten und zelluläre Kräfte zur extrazellulären Matrix auszuüben. Integrin-vermittelte Zelle Adhäsion und Kraft Übertragung sind entscheidend für die Zelle verbreiten,1,2, Migration3,4und überleben5,6,7. Auf lange Sicht beeinflusst das Integrin biomechanische Signalisierung auch Zelle Verbreitung8,9,10 und Differenzierung11,12. Forscher entwickelten verschiedene Methoden zur Messung und Karte Integrin übertragbare Mobilfunk Kräfte an der Zellmatrix Schnittstelle. Diese Methoden basieren auf elastischen Substrat13, Array von Micropost14, oder atomic force Microscopy (AFM)15,16. Elastische Substrat und Micropost Methoden beruhen auf der Verformung von Substraten zu berichten die zellulären Stress und haben Einschränkungen in Bezug auf räumliche Auflösung und Empfindlichkeit zu erzwingen. AFM hat hohe Kraftempfindlichkeit, aber es nicht Kraft an mehreren Stellen gleichzeitig erkennen, erschwert das zelluläre Kraft Karte durch Integrine übertragen.
In den letzten Jahren wurden verschiedene Techniken entwickelt, um zelluläre Kraft auf molekularer Ebene zu untersuchen. Eine Sammlung von molekularen Spannung Sensoren basierend auf Polyethylenglykol17,18, Spinne Seide Peptid19und DNA-20,21,22,23 wurden entwickelt, um visualisieren Sie und überwachen Sie Spannung durch molekulare Proteine übertragen. Unter diesen Techniken wurde DNA zuerst angenommen, da die Synthese Material in der Spannung messen Tether (TGT), ein rupturable Linker, der die Obergrenze der Integrin Spannungen in lebenden Zellen22,24moduliert. Später, DNA und Fluoreszenz-Resonanz-Transfertechnik wurden kombiniert, um Haarnadel fluoreszierende Spannung DNA-basierte Sensoren erstellen zuerst nach Chens Gruppe23 und Salaitas Gruppe20. Die Haarnadel DNA-basierte Spannung Sensor berichtet Integrin Spannung in Echtzeit und dem Studium einer Reihe von zellulären Funktionen21erfolgreich angewendet wurde. Danach kombiniert Wangs Lab ein TGT mit dem Fluorophor-Quencher paar Bericht Integrin Spannung. Dieser Sensor ist ein ITS25,26benannt. Der ITS basiert auf doppelsträngige DNA (DsDNA) und hat einen breiteren Dynamikbereich (10-60 pN) für Integrin Spannung Kalibrierung. Im Gegensatz zur Haarnadel DNA-basierte Sensoren ITS meldet keine zelluläre Kraft in Echtzeit sondern zeichnet alle historischen Integrin-Ereignisse wie der Fußabdruck von zellulären Kraft; Dieses Signal Akkumulationsprozess verbessert die Empfindlichkeit für zelluläre Kraft imaging, so dass es möglich ist Bild zellulären Kraft sogar mit einem Low-End Fluoreszenzmikroskop. Die Synthese von IVS ist relativ bequemer, wie es durch Hybridisierung zwei einzelsträngigen DNA (SsDNA) erstellt wird.
Der ITS ist ein 18-Basis gepaart DsDNA konjugiert mit Biotin, ein Fluorophor, einen Quencher (Schwarzloch Quencher 2 [BHQ2])27und eine zyklische Arginylglycylaspartic Säure (RGD) Peptid28 als ein Integrin-Peptid-Liganden (Abbildung 1). Der untere Strang ist mit dem Fluorophor konjugiert (Cy3 in dieser Handschrift, während andere Farbstoffe wie Cy5 oder Alexa-Serie verwendet wird, sind auch möglich in unserem Labor nachgewiesen worden) und das Biotin-Tag, mit denen der ITS wird auf einem Substrat von Biotin-Avidin Bond immobilisiert. Der obere Strang ist konjugiert mit RGD-Peptid und das Schwarzloch Quencher, die Cy3 mit ca. 98 % abschrecken Effizienz26,27stillt. Mit dem Protokoll in diesem Papier präsentiert ist die Beschichtung Dichte des ITS auf einem Substrat um 1.100/µm2. Dies ist die Dichte, die wir zuvor für 18 bp biotinylierte DsDNA auf dem NeutrAvidin funktionalisiert Substrat durch Anschluss an das gleiche Protokoll29Beschichtung beschichtet kalibriert. Wenn Zellen auf das Substrat beschichtet mit dem ITS anhaften, Integrin bindet den ITS durch RGD und überträgt Spannungen an den ITS. Der ITS hat eine bestimmte Spannung Toleranz (TTol) definiert als die Spannung Schwelle, die mechanisch die DsDNA des ITS innerhalb von 2 s22trennt. DER Bruch durch Integrin Spannung führt zur Trennung von der Quencher aus der Farbstoff, der anschließend Fluoreszenz emittiert. Infolgedessen die unsichtbare Integrin-Spannung ist ein Fluoreszenzsignal umgewandelt und die zelluläre Kraft durch Fluoreszenz-Bildgebung abgebildet werden kann.
Um die Anwendung des ITS zu demonstrieren, verwenden wir Fisch auch hier, eine weit verbreitete Zellmodell für Zelle Migration Studie30,31,32CHO-K1-Zelle, eine häufig verwendete nonmotile Zelllinie und NIH-3 t 3-Fibroblasten. Coimaging Integrin Spannung und Zelle Strukturen wird auch durchgeführt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

Molekulare Spannung übertragen durch Integrin-Ligand-Bindungen ist das grundlegende mechanische Signal in der Integrin-Weg, der bedeutende Rollen in vielen Zellfunktionen und Verhaltensweisen spielt. Zur Kalibrierung und Bild Integrin Spannung mit hoher Kraft Sensibilität und räumliche Auflösung, haben wir einen integrative Spannung Sensor (ITS), ein DNA-basierte fluoreszierende Spannung Sensor entwickelt. Der ITS ist aktiviert, um fluoreszieren, wenn eine molekulare Spannung aufrechterhalten Fluoreszenzsignal auf molekularer Ebene dadurch Kraft umwandeln. Die Spannung Schwelle für ITS-Aktivierung ist einstellbar im Bereich von 10 – 60 pN, die den Dynamikbereich des Integrin-Spannung in den Zellen gut abdeckt. Auf einem Substrat mit einem ITS veredelt ist die Integrin-Spannung von adhärenten Zellen durch Fluoreszenz visualisiert und mit Submikron Auflösung abgebildet. Der ITS ist auch kompatibel mit Zelle strukturelle Bildgebung in lebenden Zellen und festen Zellen. Der ITS hat sich dem Studium der Thrombozyten Kontraktion und Zellwanderung erfolgreich angewendet. Dieses Papier beschreibt das Verfahren für die Synthese und Anwendung von IVS in der Erforschung der zellulären Kraft Integrin-übertragen.

Mit dem ITS wurde die Integrin-Spannung-Karte von Fisch Keratozyten gefangen genommen. Es zeigt, dass eine auch migriert und Integrin Spannung an Kraft zweigleisig (Abbildung 2A erzeugt). Die Auflösung der Karte Kraft war so kalibriert, dass 0,4 µm (Abb. 2 b) werden. Hohen Integrin Spannung konzentriert sich am hinteren Rand (Abb. 3A). Der ITS zeigt auch unterschiedliche spezifische Muster der vers...

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Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Integrin Spannung spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Zellfunktionen. Mit einem integrativen Spannung Sensor ist Integrin Spannung mit Pikonewton (pN) Empfindlichkeit kalibriert und mit Submikron Auflösung abgebildet.

Imaging-Integrin Spannung und zelluläre Kraft mit Submicron-Auflösung mit einem integrativen Spannung Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Dieser DNA-basierte integrative Spannungssensor (ITS), das Kraftsignal lokal in Fluoreszenz umwandelt, ermöglicht die direkte Abbildung der zellulären Kraft mit Fluoreszenzmikroskopie. ITS hat eine hohe räumliche Auflösung und eine hohe Empfindlichkeit. Die Aktivierungsschwelle ist abstimmbar, was ein selektives Bild der Integrinspannung auf verschiedenen Ebenen ermöglicht.Nach Erhalt der kundenspezifischen einsträngigen DNA oder ssDNA, die von Interesse ist, um RGD-Peptid zum thiolierten ssDNA-Quencher zu konjugieren, fügen Sie zunächst 100 Mikroliter 0,5-molar EDTA in 400 Mikroliter Wasser zu etwa 450 Mikroliterfrisch hergestellter TCEP-Lösung hinzu. Fügen Sie dann 10 Mikroliter der TCEP-EDTA-Lösung zu 20 Mikrolitern einmillimollaren Thiol-DNA-Quencher in PBS für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Um RGD-Amin mit Sulfo-SMCC zu konjugieren, fügen Sie 40 Mikroliter frisch zubereiteten 23-Millimolar-Sulfo-SMCC zu 100 Mikroliterfrisch zubereiteter 11-Millimolar-RGD-Aminlösung für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu.Um RGD-Amin SMCC mit dem thiolierten ssDNA-Quencher zu konjugieren, mischen Sie das gesamte Volumen der thiolierten ssDNA Quencher-Lösung mit dem gesamten Volumen der RGD-Amin-SMCC-Lösung für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Lösung am Ende der Inkubation über Nacht auf vier Grad Celsius Lagerung. Am nächsten Morgen dreimolares Natriumchlorid mit der thiolkonjugierten DNA-Lösung und minus 20 Grad Celsius, gekühlt, 100% Ethanol im Verhältnis eins bis 10 bis 25, mischen und die Reaktion etwa 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius platzieren.Wenn die DNA gefällt hat, sammeln Sie die DNA durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in PBS zur Messung der DNA-Konzentration auf einem Spektrometer wieder auf. Für integrativen Spannungssensor, oder ITS, Synthese, mischen Sie die oberen und unteren Strang DNA-Lösungen in einem 1,1-zu-ein-Molar-Verhältnis, und inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei vier Grad Celsius, bevor Aliquots der Mischung bei minus 20 Grad Celsius für die langfristige Lagerung. Für die ITS-Immobilisierung eine Petrischale mit 29 Millimeterdurchmessern mit Glasboden mit 200 Mikrolitern 0,1 Milligramm pro Milliliter biotinyliertem Rinderserumalbumin oder BSA-Biotin 30 Minuten bei vier Grad Celsius beschichten.Wenn das BSA-Biotin auf der Glasoberfläche physisch adsorbiert hat, waschen Sie die Schale dreimal mit 200 Mikrolitern frischer PBS pro Wäsche, gefolgt von einer Inkubation mit 200 Mikrolitern 50 Mikroliter pro Milliliter Avidinprotein 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Schale dreimal mit PBS wie gezeigt, und fügen Sie 200 Mikroliter 0,1-Mikromolar ITS für eine weitere 30-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Schale dreimal mit PBS, so dass die letzte Wäsche in der Schüssel bis zur Zellbeschichtung.Um eine Fischkeratozytenkultur zu initiieren, verwenden Sie eine flache Pinzette, um ein Stück Skala von einem Fisch zu pflücken, und drücken Sie vorsichtig die Waage auf den Brunnen einer unveränderten Glasboden-Petrischale, wobei die Innenseite der Waage das Glas anbringt. Warten Sie etwa 30 Sekunden, bis die Fischwaage an der Glasoberfläche der Schale haftet, bevor Sie die Waage mit einem Millimeter des modifizierten Dulbecco-Mediums von Iscove bedecken. Dann inkubieren Sie die Waage in einer dunklen und feuchten Box für sechs bis 48 Stunden bei Raumtemperatur.Um die Keratozyten auf die ITS-Oberfläche zu stellen, ersetzen Sie das Medium aus der Keratozytenkulturschale durch eine 1X-Zellablösung für eine dreiminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie am Ende der Inkubation die Ablösungslösung durch ein frisches komplettes Medium, und dissoziieren Sie die Zellen mit sanfter Pipettierung. Passen Sie dann die Zellen auf die entsprechende Konzentration für die Beschichtung an und säen Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf die ITS-beschichtete Schale, bevor Sie sie bildgebungsbilden.Für quasi-Echtzeit-Integrin-Spannungsbildgebung in lebenden Zellen, übertragen Sie die Zellen auf das Stadium eines Fluoreszenzmikroskops, und wählen Sie das 40- oder 100-fache Objektiv. Legen Sie in der Bildverarbeitungssoftware die Belichtungszeit auf eine Sekunde und das Bildintervall von 20 Sekunden fest, um ein Video der ITS-Bilder zu erhalten. Verwenden Sie dann ein geeignetes Bildanalyse-Softwareprogramm, um einen vorherigen Frame des ITS-Videos von einem aktuellen Frame zu subtrahieren, um das ITS-Signal zu berechnen, das im neuesten Frameintervall neu erstellt wurde.Das neu erzeugte ITS-Signal stellt die im letzten Rahmenintervall erzeugte Integrinspannung dar und meldet damit die zelluläre Kraft quasi-echtzeit. Hier zeigt die Integrinspannungskartierung die Induktion von Integrinspannung an zwei Kraftspuren während der Keratozytenmigration. Die Auflösung der Kraftkarte könnte dann auf 0,4 Mikrometer kalibriert werden.Hohe Integrinspannung konzentriert sich am hinteren Rand in motilen Fischkeratozyten. In nichtmotilen Zellen wird ein spezifisches Integrin-Spannungsmuster gebildet, das sich deutlich von dem unterscheidet, das beim schnell wandernden Keratozyten beobachtet wird. Fokale Adhäsionen und die Integrinspannung von Fischkeratozyten können mitabgebildet werden, um die Beziehung zwischen Integrinspannung und Zellstruktur in Voninteresseszellen zu bewerten.Mit ITS wird die Zellhaftungskraft mit einer Auflösung und einer Empfindlichkeit sichtbar, die mit der Zellstrukturbildgebung vergleichbar ist. Diese Technik ebnet den Weg für die Untersuchung eines Kraft-Struktur-Zusammenspiels in Zellen.

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Biomolekulare Erkennung Einsatz der Interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

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Messung der Spannungsstifte Während Laser Induced Axon Läsion Axonal Haftung auf dem Substrat und auswerten zu Pikonewton Millisekundenauflösung

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Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics

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